Abstract
malattia periferica arteriosa (PAD) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare nei paesi sviluppati, e modelli animali che riproducono in modo affidabile la malattia umana sono necessarie per lo sviluppo di nuove terapie per questa malattia. Il modello di topo hindlimb ischemia è stato ampiamente utilizzato per questo scopo, ma la pratica standard di indurre ischemia dell'arto acuta mediante legatura dell'arteria femorale può provocare la necrosi tissutale sostanziale, compromettere la capacità degli investigatori di studiare le risposte vascolari e tessuto muscolare scheletrico all'ischemia . Un approccio alternativo alla legatura dell'arteria femorale è l'induzione di progressiva occlusione dell'arteria femorale attraverso l'uso di costrittori AMEROID. Quando posizionato intorno femorale uguali o differenti posizioni come i siti di legatura dell'arteria femorale, questi dispositivi occludono l'arteria più di 1 - 3 giorni con conseguente più graduale, subacuta ischemia. Ciò si traduce in meno consistente necrosi dei tessuti muscolo scheletrico, which può imitare più da vicino le risposte visto in PAD umana. Perché background genetico influenze esiti in entrambi i modelli di ischemia acuta e subacuta, considerazione del ceppo di topi in fase di studio è importante nella scelta del modello migliore. Questo documento descrive la procedura corretto posizionamento anatomico di legature o costrittori AMEROID sul mouse arteria femorale per indurre subacuta o ischemia degli arti posteriori acuta nel topo.
Introduction
Malattia periferica arteriosa (PAD) è una delle principali cause di morbilità e mortalità cardiovascolare nei paesi sviluppati 1. risultati PAD da ostruzione aterosclerotica delle arterie periferiche che porta a ischemia con conseguente dolore da sforzo o di riposo e, occasionalmente, ulcere e cancrena che necessitano di amputazione degli arti non-guarigione. Terapie mirate PAD sono dirette principalmente verso endovascolare 2 o rivascolarizzazione chirurgica 3, come essenzialmente terapie mediche efficaci esistono 4.
Purtroppo, la rivascolarizzazione è spesso di beneficio limitato, come bypass hanno alti tassi di fallimento (fino al 50% entro 5 anni) 5 che sono peggio in alcune popolazioni (ad esempio, per fumatori, le donne, non vena safena innesti) 6,7. approcci endovascolari, come angioplastica e stenting, sono anche compromesse da elevati tassi di restenosi (superiore al 50% in 1 anno), particolarmente in femoropoplitea malattia 8, anche se l'uso di palloncini e stent medicati ha migliorato i risultati un po '9-11. Al fine di sviluppare nuovi trattamenti per la PAD è essenziale sviluppare modelli animali che riproducono in modo affidabile la malattia umana.
Fino ad oggi, il modello più comune della PAD è il modello degli arti posteriori ischemia (HLI), che viene più frequentemente eseguita nei topi 12,13. Nella sua manifestazione più comune, il modello comporta legatura chirurgica dell'arteria femorale prossimale e distale e suoi intermedi rami laterali seguita da escissione della nave, con conseguente occlusione del flusso sanguigno e induzione di ischemia dell'arto acuta. HLI è stato utilizzato principalmente per studiare le risposte angiogeniche e arteriogenic nel tessuto muscolare degli arti periferici e gli effetti di varie terapie (ad esempio, la droga, la consegna del gene, le cellule staminali) su queste risposte. Più di recente, il nostro gruppo ha utilizzato questo modello per esaminare il ruolo delle cellule del muscolo scheletrico in la risposta alla ischemia e gli effetti delle differenze genetiche sui risultati 14.
Il modello HLI ha facilitato la nostra comprensione corrente che le risposte vascolari e muscolari all'ischemia dipendono genetica (cioè, ceppo inbred) 15, 16 anni, e la presenza o assenza di altre malattie o condizioni pertinenti ad aterosclerosi, compreso il diabete mellito 17 e ipercolesterolemia 18. Tuttavia, un importante debolezza del modello tradizionale HLI è che è un modello di ischemia acuta 12,13, mentre PAD umana provoca ischemia cronica a seguito del progressivo sviluppo di lesioni aterosclerotiche occlusive nelle arterie periferiche.
Nel tentativo di aggirare questa debolezza, Tang e colleghi hanno inizialmente sviluppato un modello murino di graduale occlusione arteriosa femorale utilizzando constrictor AMEROID 19, e lo stesso gruppo poi developed un modello di topo simile 20. Costrittori AMEROID sono stati descritti inizialmente nel 1950 in un modello canino di ischemia miocardica cronica 21,22. Questi dispositivi hanno un manicotto metallico esterno che racchiude uno strato interno di un materiale igroscopico, di solito di caseina, e quando disposto intorno un'arteria inducono progressiva occlusione di vasi che assorbono l'umidità dai tessuti circostanti. Nella modifica del modello, Yang et al. Costrittori posizionato su entrambi prossimale e distale femorale in siti analoghi ai siti legatura chirurgica, e ligato i rami laterali dell'arteria femorale, come nel modello tradizionale. Rispetto al HLI acuta, ischemia AMEROID constrictor indotta portato a bassa espressione di geni infiammatori e di taglio di stress-dipendente, più bassa di recupero il flusso di sangue 4 - 5 settimane dopo l'intervento, e meno necrosi muscolare 20. Sulla base di queste osservazioni, si è ritenuto che progressiva occlusione arteriosa potrebbe fornire un modello di PAD più rilevante per la malattia umana.
In particolare, nel rapporto originale, effetti di AMEROID ischemia indotta constrictor sono stati esaminati solo in topi C57BL / 6 19, che sono relativamente resistenti alla ischemia indotta necrosi muscolare 15. Recentemente abbiamo modificato il modello di ischemia graduale ulteriormente e esplorato i suoi effetti nel più ischemia-sensibili BALB / c del mouse ceppo 23. Nella prima manifestazione del modello, abbiamo messo constrictor sia prossimale e distale femorale ma lasciato intatti tutti rami laterali. In un secondo, modifica mite, abbiamo posizionato un singolo costrittore solo sulla arteria femorale prossimale e ancora lasciato tutti collaterali rami dell'arteria intatta. In entrambe le modifiche di questo modello, abbiamo scoperto che i topi BALB / c, ma non C57BL / 6 topi, visualizzata significativa necrosi muscolare pur avendo simile flusso di sangue e la densità vascolare. Simile al nostro precedente studio 14, questi risultati hanno dimostrato che il muscolo degli artipregiudizio non è solo influenzata dal flusso di sangue, ma è in parte dipendente background genetico. Inoltre, abbiamo scoperto che il flusso di sangue arto è sceso al suo nadir entro 3 giorni, così il modello sembra essere più uno dei 'subacuta' piuttosto che graduale ischemia degli arti.
Sulla base di questi studi precedenti, appare chiaro che un singolo metodo per indurre hindlimb ischemia può non essere adatto in tutti i casi. A causa di una varietà di condizioni (ad esempio, le differenze genetiche e la presenza o assenza di condizioni di co-morbidità) influenza sia il vascolare e le risposte specifiche del muscolo scheletrico, gli investigatori potrebbe essere necessario modificare la cronicità e / o la gravità delle arti posteriori ischemia al meglio soddisfare i loro scopi. Inoltre, precedenti descrizioni del modello tipicamente mancavano punti di riferimento anatomici idonee ad agevolare affidabile inter-investigatore riproducibilità della tecnica. In questo lavoro, i metodi per indurre ischemia degli arti posteriori acuta o subacuta nel toposono descritti, e punti di riferimento anatomici precisi sono forniti.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo il protocollo approvato dal Comitato cura e l'uso Duke Istituzionale Animal. topi maschi sono stati utilizzati in questo studio, anche se entrambi i sessi può essere utilizzato come indicato ai fini scientifica dello studio.
1. Depilazione
- Prima di induzione di anestesia, impostare una zona di preparazione pre-chirurgica consiste di una piastra elettrica coperta a 37 ° C e una porta nosecone connesso al flusso continuo di isoflurano.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia. Impostare il flussometro O 2 a 1 L / min e isoflurano per 1 - 3%.
NOTA: L'anestesia è tipicamente indotta in 25 g mouse con 2% isoflurano. - Controllare la risposta di stimolo del mouse delicatamente a dondolo della camera e osservando la mancanza di un riflesso di raddrizzamento.
- Lavare la camera con 2 O per cancellare l'isoflurano prima dell'apertura. spostare rapidamente il mouse per il riscaldamento pannuncio e collegarlo al isoflurano attraverso il musetto.
- Regolare il isoflurano al 1,5%. Controllare la risposta di stimolo da parte del pedale riflesso (pinch tep).
- Applicare il lubrificante oftalmica liberamente in entrambi gli occhi per evitare l'essiccamento durante l'intervento chirurgico.
- Radere i capelli da entrambi gli arti posteriori con un piccolo trimmer elettrico. Tenere la pelle tesa durante la rasatura per evitare di lacerare la pelle.
- Applicare pre-riscaldato crema depilatoria e lasciate riposare per 1 min. Delicatamente spazzare via con un tampone di garza inumidito.
- Per la procedura chirurgica in un secondo momento, disattivare l'isoflurano e spostare il mouse a un asciugamano foderata gabbia di recupero di carta vuoto per garantire il mouse non aspirare il assestamento gabbia. Monitorare l'animale fino a quando è in grado di mantenere decubito sternale. In caso contrario, spostare il mouse al tavolo operatorio.
NOTA: Il processo di rimozione dei capelli può irritare la pelle e influire sulle misurazioni della perfusione. Si consiglia di attendere 1 - 2 giorni dopo la rimozione dei peli dell'animale prima di performing una scansione perfusione pre-chirurgica o l'esecuzione di un intervento chirurgico.
Preparazione 2. Pre-chirurgica
- Utilizzare i seguenti strumenti durante questa procedura; piccole forbici chirurgiche rette, 2 punta fine pinze ad angolo, piccole pinze Graefe, ago pinze driver, 3 divaricatori, forbici piccola sorgente, e tamponi di cotone punta fine.
- Sterilizzare tutti gli strumenti utilizzando un autoclave prima dell'inizio della chirurgia. Utilizzare uno sterilizzatore a caldo tallone prima e tra ogni intervento chirurgico, per un massimo di 5 animali. Sterilizzare ulteriori pacchetti di strumento chirurgico per la chirurgia di gruppi superiori a 5.
- Preparare un campo chirurgico sterile, costituita da una piastra elettrica coperta e una porta isoflurano. Eseguire tutti i lavori sotto un microscopio dissezione 10 stereo.
- Anestetizzare e preparare il mouse come descritto nei punti da 1.1 a 1.5.
- Controllare che il mouse è completamente sedato e posto in posizione supina sul tavolo operatorio. Fissare entrambe le gambe con nastro chirurgico. </ Li>
- Se si utilizza una piastra elettrica a temperatura controllata, fissare la sonda di temperatura e fissarlo alla base della piattaforma chirurgica con nastro chirurgica per garantire che non venga accidentalmente estratta durante la procedura.
- Pulire il sito di incisione con 3 alternati iodopovidone e alcool salviette. Coprire l'animale con un telo chirurgico sterile e un foro per esporre il sito di incisione.
3. L'induzione di ischemia degli arti
- Utilizzare un bisturi per fare una incisione iniziale lungo il centro della coscia mediale, che va dal ginocchio verso l'addome, ed allungare l'incisione per circa 1 cm con forbici sottili (Figura 1A).
Figura 1. sito chirurgico e vascolari anatomici Luoghi di interesse per la chirurgia degli arti posteriori del mouse ischemia. (A) Vista esternal'arti posteriori di un mouse in posizione supina. La linea tratteggiata indica il sito di incisione per eseguire correttamente le procedure degli arti posteriori ischemia. (B) Veduta del prossimale vascolarizzazione degli arti posteriori del mouse. L'estremità prossimale dell'arteria femorale (FA) deriva da sotto del legamento inguinale (IL). L'estremità distale della FA si trova a sua biforcazione nell'arteria poplitea (PA) e l'arteria safena (SA). Le principali arterie collaterali al largo della FA sono l'arteria femorale laterale circonflessa (LCFA), il prossimale femorale caudale (PCFA), e il superficiale dell'arteria epigastrica caudale (SCEA). La vena femorale (FV) corre adiacente alla FA e rami venosi può essere visto parallelamente ai principali rami arteriosi. Gli asterischi (*) indicano i siti prossimale e distale per il posizionamento dei costrittori AMEROID o legature, a seconda che saranno indotte subacuta o ischemia acuta. Si prega click qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Utilizzando pinze, aprire l'incisione ed esporre la membrana che copre il tessuto adiposo inguinale (IFT).
- Utilizzando chiuse-pinze, forare attraverso la membrana nella separazione tra IFT e l'addome. Delicatamente rilasciare pressione sulle pinze per separare il IFT dai muscoli addominali, esponendo il fascio neurovascolare sotto. Osservare il prossimale e rami caudali superficiali come importanti punti di riferimento anatomici (Figura 1B).
- Inserire un divaricatore e tirare il tessuto addominale prossimale per esporre il AMEROID constrictor o legatura sito prossimale, proprio in prossimità del laterale circonflessa femorale (Figura 1B). L'arteria circonflessa laterale si trova circa 5 mm prossimale al prossimale e arterie caudale superficiali.
- Inserire due divaricatori nella parte distale dell'incisione, uno mediale e l'altra laterale, di tirare il IFT distalmente dalsito chirurgico per allargare il campo chirurgico.
- Utilizzare due pinza sottile per rimuovere la membrana più esterna che copre il fascio neurovascolare. Inserire delicatamente la metà della punta pinza sottile tra la vena e arteria, scorrere la punta pinza sotto la membrana che li unisce. Chiudere la pinza e delicatamente strappare la membrana.
- Inserire la punta di una pinza chiuse tra la vena e arteria e creare un divario tra loro rilasciando la pressione sulle pinze. Ripetere questa tecnica per creare un divario tra l'arteria e il nervo.
- Per subacuta ischemia, posizionare un costrittore AMEROID sull'arteria femorale prossimale (Figura 2).
- Per installare il costrittore AMEROID prossimale, far scorrere la punta di una pinza sotto l'arteria femorale per isolarlo dal fascio neurovascolare. Utilizzare una seconda serie di pinze angled- per afferrare il bordo del costrittore e guidare sotto l'arteria femorale.
- Posare l'arteria femorale nelle smolto nel constrictor. Ripetere per costrittore distale, posizionandolo immediatamente prossimale alla biforcazione dell'arteria femorale nell'arteria poplitea e arteria safena (Figura 2).
Figura 2. Collocamento di AMEROID costrittori e Legature. (A) Esempio di due costrittori AMEROID immessi sul arteria femorale per indurre subacuta degli arti posteriori ischemia. Il constrictor prossimale si trova appena prossimale al femorale circonflessa laterale (LCFA). Il constrictor distale si trova appena prossimale alla biforcazione del popliteo (PA) e le arterie safena (SA). Costrittori sono installati con la scanalatura rivolta verso l'alto al fine di garantire l'arteria è impostato correttamente all'interno del constrictor. (B) Esempio di legature dell'arteria femorale per indurre ischemia degli arti posteriori acuta. Ligatures (frecce gialle) sono posizionati in modo tale che fiancheggiano la posizione dei costrittori pannello (B), e l'arteria femorale viene transected tra ciascun gruppo di due legature (asterischi). Bar, 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Per ischemia degli arti acuta, legare e transetto l'arteria femorale prossimale.
- Per transetto l'arteria femorale, filo 7 - O sutura sotto l'arteria appena prossimale alla posizione del costrittore prossimale (vedi punto 3.7) e legare. Tie una seconda legatura circa 1 mm distalmente alla prima.
- Usare le forbici a molla al transetto l'arteria tra le due legature. Per la transection arteriosa distale, ripetere questi passaggi, mettendo due legature di circa 1 mm l'una dall'altra, proprio prossimali alla biforcazione dell'arteria femorale in arteria poplitea e l'arteria safena, ma assicurando che essi sono distale al caud superficialiAl arteria epigastrica (vedi Figura 1)
- Chiudere l'incisione utilizzando interrotto 5 - punti di sutura Vicryl O.
4. Perfusion Imaging
- Muovi il mouse per un 37 ° piastra elettrica C impostare sotto l'imager laser doppler perfusione (LDPI) e collegare tramite un nosecone alla fonte isoflurano. Se nessun controllo della temperatura è disponibile, per consentire 5 min per il mouse per riscaldare fino a 37 ° C.
- Accendere l'imager e lanciare il software di acquisizione delle immagini.
- Fare clic sull'icona 'Nuova Immagine singolo' per aprire la finestra 'Setup Scanner'. Impostare il 'Formato scansione' per 'Large' e la 'velocità di scansione' a '4 ms / pixel'. Impostare l'area di scansione modificando i valori X e Y sotto il 'Area di scansione (unità)' riquadro.
- Fare clic sulla scheda 'Video e Distanza' per visualizzare il feed video, e di organizzare il mouse per adattarsi l'area di scansione indicata da un contorno rosso. Fare clic su 'Auto Distanza' per calibrarela distanza dal laser al soggetto. Fare clic su 'Next' per aprire la finestra il "soggetto Dettagli.
- Inserire le informazioni oggetto e eventuali commenti. Fare clic sul pulsante 'Avanti' per passare alla finestra di scansione.
- Fare clic sul pulsante 'Start misura' per aprire il 'Confermare o Override Scan Distanza' di dialogo. Fare clic su 'OK' per confermare la distanza di scansione. Osservare il processo di scansione inizia e correre per 4 - 8 min a seconda delle dimensioni dell'area di scansione.
- Dopo la scansione, di osservare la finestra 'Salva con nome'. Assegnare un nome al file e salvarlo.
- Spegnere il isoflurano e spostare il mouse per una gabbia di recupero vuoto e monitorare fino a quando l'animale è in grado di mantenere decubito sternale. Non mettere mai un mouse recupero dall'anestesia in una gabbia con altri topi.
- Aprire il software di analisi delle immagini. Fare clic sull'icona 'Open' e individuare e aprire il file immagine per l'analisi. Nella finestra del file, osservare il cambiamento continuo,foto, e immagini a colori del mouse.
- Per celebrare la regione di interesse (ROI) sull'immagine di flusso, fare clic sull'icona 'Mostra ROI. Avanti fare clic sul pulsante 'Aggiungi poligono' e trascinare il cursore intorno all'arto non chirurgica per disegnare il ROI. Tasto destro del mouse per chiudere la forma. Seleziona 'Aggiungi poligono' di nuovo e di tracciare un ROI corrispondente intorno all'arto chirurgica.
- Fare clic sull'icona 'statistiche' per aprire la finestra 'ROI statistici Risultati (PU) Immagine'. Osservare la differenza percentuale in continuo mutamento nella colonna 'Flux%'.
NOTA: La prima ROI disegnato servirà da riferimento.
NOTA: Prima di ogni successiva scansione perfusione seguire la procedura descritta nella Sezione 1 per anestetizzare il mouse e in passi da 4.1 a 4.11 per l'immagine dell'animale.
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Representative Results
La corretta identificazione del sistema vascolare del mouse arti posteriori è fondamentale per garantire la riproducibilità delle tecniche per indurre sia subacuta e ischemia degli arti posteriori acuta, come descritto qui. Oltre alla variazione intrinseca in studi sugli animali, altri fattori possono introdurre variabilità laser Doppler perfusione (LDPI), compreso il tipo di anestesia, la posizione dell'animale (vs supina prona), e la temperatura corporea (vedere Figura 3). Inoltre, il modello di ischemia degli arti posteriori subacuta dipende dalla qualità dei costrittori AMEROID, che possono variare ampiamente in un determinato batch (vedere Figura 4). Ognuno di questi problemi possono avere effetti sostanziali sulla quantificazione del flusso misurata dal LDPI e sono discussi in dettaglio più avanti.
Dopo il posizionamento dei costrittori AMEROID nel modello di ischemia degli arti posteriori subacuta o legaturae transezione dell'arteria femorale nel modello hindlimb ischemia acuta, immagini LDPI sono ottenuti immediatamente dopo l'intervento, mentre l'animale è anestetizzato ancora per dimostrare gli effetti della chirurgia e stabilire un livello post-operatorio basale di perfusione (Figura 5). Quantificazione di perfusione avviene disegnando una regione di interesse (ROI) intorno al hindlimb ischemica e un ROI paragonabile intorno all'arto non ischemica. Perfusione è più comunemente espressa come rapporto tra la perfusione dell'arto ischemico che nell'arto non ischemico, e cambiamenti in questo rapporto sono misurati nel tempo. Abbiamo scoperto che i topi di imaging nei risultati posizione prona in meno variabilità dovuta al movimento degli animali e cambiamenti nel posizionamento dei piedi da un punto temporale al successivo. Inoltre, perfusione nella coscia tende ad essere più variabile quando i topi sono in posizione supina. Una perdita completa di perfusione hindlimb Va osservato dopo induzione dell'arto acutaischemia, mentre solo una lieve diminuzione perfusione è tipicamente osservata dopo posizionamento di costrittori AMEROID nel modello subacuta (Figura 5). In alcuni casi, abbiamo osservato una rapida occlusione constrictor con conseguente drammatica perdita di perfusione subito dopo l'intervento.
Figura 3. Variazione Perfusion Imaging Sulla base degli arti posteriori di posizione e la temperatura corporea. Laser Doppler immagini di perfusione di un singolo BALB / c del mouse, anestetizzati con 1,5% isoflurano e scansita sia in posizione supina e prona a 35 ° C, 37 ° C, e 38 ° C. Con isoflurano, zampe posteriori dell'animale tendono a muoversi con la respirazione, determinando un manufatto (linee orizzontali) che si osservano con maggiore frequenza supina rispetto alle immagini inclini. In posizione prona, è molto più facile da riprodurre l'angolo precisodei piedi, rendendo la quantificazione della perfusione nel tempo più preciso. Perfusione è sostanzialmente ridotta come la temperatura corporea scende sotto i 37 ° C, mentre le immagini sono saturi a temperature più elevate. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. La variabilità della reperibile in commercio AMEROID costrittori (A) Un esempio di 0,25 millimetri di diametro interno (doppia freccia) costrittore ideale di forma di slot e spessore uniformi caseina (B - D).. Esempi di variazione di forma slot. Le bande orarie possono a volte visualizzare una forma 'D' (B e C) o una forma 'b' (D). In questi casi, la caseina è abbastanza uniformemente distribuito e gli slot sono abbastanza in profondità hold l'arteria. (E) Un esempio di spessore caseina non uniforme. Questo costrittore verrebbe scartato. (F) Un esempio di slot che è troppo bassa per mantenere l'arteria in posizione durante costrizione. Questo costrittore potrebbe anche essere eliminata. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. perfusione immagini subito dopo induzione di subacuta o acuta degli arti posteriori ischemia. Immagini di perfusione rappresentative sia nella posizione supina e prona di topi BALB / c che hanno subito il posizionamento di due costrittori AMEROID sull'arteria femorale sinistro per indurre subacuta degli arti posteriori ischemia o il posizionamento due legature e recisione dell'arteria femorale sinistra per indurre ischemia acuta degli arti posteriori. Si noti che perfusion è ridotta, ma ancora rilevabili dopo il posizionamento constrictor AMEROID, mentre in sostanza nessun flusso viene rilevato immediatamente dopo la doppia legatura / recisione dell'arteria femorale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Forse il passo più difficile in questa procedura è la separazione dell'arteria femorale dalla vena femorale. Il diametro maggiore e pareti più sottili della vena femorale rispetto a quelli dell'arteria aumentano la suscettibilità alle perforazioni e strappi durante la manipolazione chirurgica. La probabilità di interferire vena può essere ridotto mantenendo la ferita umida utilizzando un tampone sterile inumidito con PBS. È altresì importante garantire che tutti pinze sono affilate, allineate, e priva di interruzioni per consentire precisa manipolazione dei vasi e dei tessuti circostanti. Nel caso che il sanguinamento si verifica, applicare pressione alla zona con garza sterile fino a quando il sanguinamento si è fermato. Dettagliate note chirurgici devono essere mantenuti per ciascun animale, come quello che può essere percepito come eventi di sanguinamento "minori" può rappresentare un involontariamente più grave danno ischemico nel lungo termine. Per la coerenza dei dati, interventi chirurgici che non comportano spurgo arterioso venoso o garanziaeventi ing sono cruciali.
Una limitazione di questa tecnica è che la gravità e / o inizio di ischemia (nel AMEROID modello costrittore subacuta) può variare ampiamente a seconda di diversi fattori. Il sito / legatura constrictor prossimale determinerà il numero di arterie collaterali sono influenzati dalla induzione di ischemia. Lasciando rami collaterali intatto riduce la gravità della lesione, anche se, come detto, in determinati contesti, cioè, negli animali di alcuni background genetico, anche lievi, subacuta ischemia può causare necrosi dei tessuti sostanziale 23. Inoltre, l'aggiunta di un secondo, costrittore distale o legatura diminuirà perfusione sia nel modello di acuta e subacuta 23. Alcuni ricercatori hanno legatura o utilizzato un elettrobisturi per l'ablazione rami collaterali fuori l'arteria circonflessa laterale, prossimale femorale caudale, e il superficiale caudale dell'arteria epigastrica 24. Ciò si traduce in un più grave ischemiaND può indurre una maggiore lesioni muscolari, anche se questo dipende anche dal background genetico. E 'importante notare che l'elettrocauterizzazione può essere più probabilità di causare lesioni ai tessuti circostanti e deve quindi essere usato con cautela.
Alla luce di queste variabili, è fondamentale che l'anatomia vascolare è identificato accuratamente prima di selezionare il sito di occlusione. Kochi et al. 25 ha notato una marcata mancanza di consenso tra numerose segnalazioni riguardanti i nomi e le posizioni dei vasi sanguigni nel arti posteriori del mouse, e hanno fornito una descrizione molto dettagliata dell'anatomia arteriosa che noi crediamo è una guida essenziale per chiunque intraprendere questo procedura. Una precedente pubblicazione in questa rivista ha dimostrato la tecnica per indurre ischemia acuta 13, ma in tale relazione i punti di riferimento anatomici vascolari non erano ben definiti. Un obiettivo importante di questa relazione è stato quello di fornire una migliore rappresentazione visiva of quei punti di riferimento oltre a dimostrare una modifica della tecnica utilizzando subacuta ischemia.
Un'ulteriore limitazione di questo approccio è che l'insorgenza di ischemia nel modello subacuta ischemia è una funzione della qualità dei costrittori AMEROID che si usa. Abbiamo scoperto che costrittori commerciali possono variare la profondità e la forma della loro scanalatura interna (figura 4). Se lo slot è troppo bassa l'arteria può essere estruso durante la costrizione. Costrittori con la caseina rotti o malformati slot devono essere eliminate. Inoltre, la distribuzione incoerente della caseina all'interno del constrictor può portare a tassi accelerati di occlusione. Le dimensioni e l'età dei topi è un altro fattore critico da considerare, come grandezze delle navi nei topi 'adulti' possono variare considerevolmente di età compresa tra 8 e 30 settimane di età tra i. Questo è particolarmente importante quando si utilizzano più coorti indipendenti di topi per generare insiemi di dati, come apparentemente Smalfasce di età (ad esempio l, 10 - 16 settimane) può provocare tassi incoerenti di occlusione e la gravità delle lesioni degli arti ischemico.
Quantificazione di perfusione laser Doppler può anche variare ampiamente a seconda della temperatura corporea dell'animale e la posizione (figura 4), così come l'agente anestetico usato. E 'fondamentale che il mouse mantenere una temperatura corporea di 37 ° C durante l'imaging di perfusione. Se la temperatura è superiore a 37 ° C sarà saturo dell'immagine perfusione. Se la temperatura è inferiore a 36 ° C il segnale di perfusione può essere troppo debole. E 'anche importante mantenere entrambe le gambe più simmetrico possibile avere un rapporto perfusione accurata (perfusione dell'arto ischemico rispetto a quella dell'arto non ischemica). Anche se i topi sono spesso ripreso mentre si trovava in posizione supina, simmetria può essere più difficile da mantenere in questa posizione. Inoltre, la variazione del flusso di sangue nella porzione superiore del campo dell'imaging, cioè, il prcoscia oximal, può contribuire alla variabilità dei quantificazione. Inoltre, l'anestesia con isoflurano provoca spesso maggiore movimento del torace, che a sua volta causa il movimento delle gambe e la variabilità del segnale ottenuto dalla LDPI. Abbiamo trovato che ponendo animali in posizione prona dà più sostegno agli arti, che facilitano il posizionamento e movimento notevolmente ridotto, che si traduce in quantificazione più riproducibile di perfusione (Figura 5). Inoltre, la posizione prona facilita la manutenzione più costante di 37 ° C di temperatura negli arti digitalizzati, che migliora anche la riproducibilità di quantificazione (figura 5). Rispetto a isoflurano, topi anestetizzati con display ketamina è diminuito movimento del torace, rendendo meno variabile di imaging in posizione supina. Tuttavia, ketamina aumenterà anche l'induzione dell'anestesia e il tempo di recupero, con conseguente significativo aumento della perfusione valori assoluti 16. Ogni combinazione di posizione del corpo e Anestagente hetic può creare un valore dell'immagine perfusione distinti, quindi è importante utilizzare una tecnica coerente per ciascuno di questi metodi attraverso tutte le misurazioni successive perfusione.
È importante riconoscere diverse altre limitazioni di questa tecnica. Poiché il modello è spesso eseguita in topi senza comorbidità, come l'obesità, iperlipidemia, aterosclerosi, diabete mellito, o di altri fattori che predispongono alla malattia vascolare, l'induzione di ischemia non potrà mai riprodurre perfettamente il patologia del PAD clinica. Come notato, gli effetti di ischemia degli arti acuta sono stati valutati in topi anziani, diabetici, e ipercolesterolemici, e in futuro sarà utile per determinare gli effetti di queste condizioni di comorbidità sulle risposte a subacuta ischemia. Inoltre, poiché PAD è una malattia cronica, anche subacuta ischemia è un modello imperfetta dello scenario clinico. Pertanto, sarà importante continuare a sviluppare modelli chetradursi in vera ischemia degli arti cronica e di testarli in combinazione con i modelli di fattori di rischio cardiovascolare. Una limitazione tecnica del laser Doppler modalità indipendentemente dal modello animale utilizzato sia che misura la velocità del flusso sanguigno e non perfusione tissutale assoluto, quindi può essere utilizzato solo per confrontare le variazioni relative nel flusso sanguigno entro un determinato animale. In particolare, ischemia che causa la perdita dell'arto provocherà un rapporto perfusione ridotta indipendentemente cambiamenti nel flusso sanguigno 23.
In sintesi, mettiamo a disposizione metodi dettagliati per indurre acuta e subacuta ischemia degli arti posteriori nei topi con lo scopo di analizzare gli effetti sulla muscolatura scheletrica e rimodellamento vascolare. Particolare attenzione viene data alla identificazione dei punti di riferimento vascolari critici per facilitare intra accurate e inter-operatore di riproducibilità del modello. Ulteriore affinamento della tecnica può portare allo sviluppo di un modello ischemia cronica che accurately replica la patogenesi della PAD clinica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Dumoxel |
| Dumont Style 5 Mini Forceps | Fine Science Tools | 11200-14 | Inox |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 7 - 0 Silk Suture | Sharpoint | DA-2527N | |
| 5 - 0 Coated Vicryl Suture | Ethicon | J463G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Artifical Tears Ointment | Rugby Laboratories | 0536-6550-91 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-0 | |
| Fine Cotton Swabs | Contec | SC-4 | |
| Temperature Controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Ameroid Constrictors | Research Instruments SW | MMC-0.25 x 1.00-SS | |
| Hot Bead Sterilizer | |||
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010-023 | |
| Moor LDPI | Moor Instruments | moorLDI2 | |
| moorLDI Measurement software | Moor Instruments | v. 6.0 | |
| Hair Removal Cream | Nair |
References
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