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Artículo de método

La caracterización de propiedades mecánicas Multiescala de tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, Impacto sangría, y Rheometría

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DOI:

10.3791/54201

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6 de septiembre de 2016

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1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

Presentamos un conjunto de técnicas para caracterizar las propiedades mecánicas viscoelásticas del cerebro a escala micro, meso y macro.

Resumen

Diseñar e ingeniero de materiales inspirados en las propiedades del cerebro, ya sea para los simuladores mecánicos o para estudios de regeneración de tejidos, el tejido cerebral en sí debe estar bien caracterizado en diversas escalas de tiempo y longitud. Como muchos tejidos biológicos, el tejido cerebral presenta una estructura compleja, jerárquica. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los otros tejidos, el cerebro es de muy baja rigidez mecánica, con módulos de elasticidad E de Young del orden de 100s de Pa. Esta baja rigidez puede presentar desafíos para la caracterización experimental de las propiedades mecánicas clave. Aquí, demostramos varias técnicas de caracterización mecánica que han sido adaptados para medir las propiedades elásticas y viscoelásticas de materiales hidratados, que cumplen biológicos tales como el tejido cerebral, a diferentes escalas de longitud y velocidades de carga. En la microescala, llevamos a cabo experimentos de fluencia de incumplimiento y de relajación utilizando la fuerza de fuerza atómica hendidura microscopio habilitado. En los mesoscale, realizamos experimentos de impacto de indentación usando un indentador instrumentado a base de péndulo. En la macroescala, llevamos a cabo reometría de placas paralelas para cuantificar la función de la frecuencia de cizalla módulos elásticos. También se discuten los desafíos y las limitaciones asociadas con cada método. En conjunto, estas técnicas permiten una caracterización mecánica en profundidad del tejido cerebral que se puede utilizar para comprender mejor la estructura del cerebro y al ingeniero de materiales bio-inspirados.

Introducción

La mayoría-tejidos blandos que comprenden órganos biológicos son mecánicamente y estructuralmente compleja, de baja rigidez en comparación con el hueso mineralizado o materiales de ingeniería, y muestran la deformación no lineal y dependiente del tiempo. En comparación con otros tejidos en el cuerpo, el tejido cerebral es muy compatible, con módulos de elasticidad E del orden de 100s de 1 Pa. El tejido cerebral exhibe heterogeneidad estructural con gris distinta y interdigitados y las regiones de la materia blanca que también difieren funcionalmente. mecánica de tejido cerebral entendimiento ayudar en el diseño de materiales y modelos computacionales para imitar la respuesta del cerebro durante la lesión, facilitar la predicción de daños mecánicos, y permitir la ingeniería de las estrategias de protección. Además, dicha información puede ser usada para considerar los objetivos de diseño para la regeneración de tejidos, y para entender mejor los cambios estructurales en el tejido cerebral que están asociados con enfermedades tales como la esclerosis múltiple y el autismo. MARIDOERE, se describen y demuestran varios enfoques experimentales que están disponibles para caracterizar las propiedades viscoelásticas de los tejidos mecánicamente compatibles incluyendo el tejido cerebral, en la micro, meso y macro-escalas.

En la microescala, se realizó la fluencia de cumplimiento y la fuerza de relajación experimentos usando microscopio de fuerza atómica (AFM) muesca habilitado. Típicamente, la sangría AFM habilitado se utiliza para estimar el módulo elástico (o rigidez instantánea) de una muestra de 2-4. Sin embargo, el mismo instrumento también se puede utilizar para medir viscoelástico microescala propiedades (tiempo o dependiente de la frecuencia) 5-10. El principio de estos experimentos, mostrados en la Figura 1, es para sangrar un AFM sonda en voladizo en el tejido cerebral, mantener una magnitud especificada de la fuerza o profundidad de indentación, y medir los cambios correspondientes en la profundidad de indentación y la fuerza, respectivamente, en el tiempo. Utilizando estos datos, se puede calcular el borrador de fluencialiance J C y G módulo de relajación R, respectivamente.

En la mesoescala, llevamos a cabo experimentos de sangría de impacto en las condiciones de fluido sumergidos que mantienen la estructura del tejido y los niveles de hidratación, usando un nanoindentador instrumentado a base de péndulo. La configuración experimental se ilustra en la Figura 2. A medida que el péndulo oscila en contacto con el tejido, la sonda de desplazamiento se registra como una función del tiempo hasta que el péndulo oscilante viene a descansar dentro del tejido. Desde el movimiento oscilatorio armónico amortiguado resultante de la sonda, se puede calcular la máxima profundidad de penetración x max, capacidad de disipación de energía K, y el factor de calidad Q de disipación (que se refiere a la tasa de disipación de energía) del tejido 11,12.

En la macroescala, se utilizó un reómetro de placas paralelas de cuantificar la frecuencia de cizalla depende módulos elásticos,denomina el módulo de almacenamiento G 'y módulo de pérdida G ", del tejido. En este tipo de reometría, aplicamos una cepa angular armónico (y la tensión de cizallamiento correspondiente) en amplitudes y frecuencias conocidas y medir el par reaccional (y el esfuerzo cortante correspondiente) , como se muestra en la Figura 3. a partir de la amplitud y la fase resultante de retraso del par medido y las variables geométricas del sistema, podemos calcular G 'y G "a frecuencias aplicadas de interés 13,14.

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Protocolo

Declaración de Ética: Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Hospital Infantil de Boston y cumplen con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Los procedimientos de adquisición de cerebro de ratón tisular (AFM para el sangrado habilitado y la sangría de impacto)

  1. Preparar una mezcla de ketamina / xilazina para anestesiar a los ratones. Combinar 5 ml de ketamina (500 mg / ml), 1 ml de xilazina (20 mg / ml) y 7 ml de 0,9% de solución salina.
  2. Inyectar ratón (Raza: TSC1; Syn-Cre; PLP-eGFP; Edad: p21; Sexo: Masculino o Femenino) con 7 l por gramo de peso corporal de la solución de ketamina / xilazina.
  3. Una vez que el ratón está totalmente anestesiado, como se demuestra por la falta de respuesta a la punta de la cola y pellizcos, la eutanasia el ratón por decapitación usando grandes tijeras de disección.
  4. Retire el cráneo cortando por la mitad con unas tijeras de disección más pequeños. Comenzando en el cerebelo, remove piezas del cráneo utilizando pinzas curvas. Después de retirar el cráneo, extraer el cerebro usando una espátula plana para levantar el cerebro, comenzando en el cerebelo, y colocar el cerebro en un plato Petri. Retire el cerebelo del cerebro usando una hoja de afeitar.
  5. Si el uso de todo un cerebro para las pruebas de indentación de impacto sobre tejido fresco, transferencia de cerebro en un tubo de fondo redondo con CO 2 medio nutriente -independiente para el tejido neural adulto en hielo y se proceda a la sección 4. De lo contrario continuar con el paso 1.6 para los procedimientos de rebanar.
  6. Ajuste la configuración vibratome a una velocidad de 0,7 mm / seg, una frecuencia de vibración de 70 Hz, y un grosor de corte de 350 micras. Rodear el plato vibratome con hielo. Colocar una gota de pegamento sobre la placa de vibratome y montar cerebro de manera que las rebanadas coronales se pueden cortar, con el cerebro orientada para cortar a través del lado dorsal primero.
  7. Llenar el recipiente vibratome con solución salina tamponada con fosfato suficiente de Dulbecco (DPBS) para simplemente sumergir el cerebro. Aumentoel plato en el vibratome de modo que la cuchilla es sólo sumergido en el DPBS.
  8. Presione START para comenzar cortando secciones del cerebro coronal 350 micras de espesor.
  9. Uso de pinceles para evitar daños en el tejido, la transferencia de los cortes de cerebro del baño de vibratome DPBS y en un tubo de fondo redondo con CO 2 medio nutriente -independiente para el tejido neural adulto en hielo y realizar mediciones en tejido fresco dentro de 48 hr. Para empezar los experimentos de sangría AFM habilitado, proceda a la sección 3.

2. Los procedimientos de adquisición de cerdo cerebrales de tejidos (por reología)

  1. Obtener un cerebro porcino media sagital rodajas dentro de ~ 1 hora del sacrificio de un carnicero local. Colocar la mitad del cerebro de CO 2 -independiente medio nutriente para el tejido neuronal adulta, y almacenar en hielo.
  2. Utilice una hoja de afeitar o un bisturí para hacer una gruesa rebanada coronal del cerebro ~ 5 mm y almacenar CO2 en medio nutritivo -independiente de tejido nervioso adulto. Asegúrese de que la superfi rebanadae es lo más plana posible. Use movimientos laterales cuidadosos con la maquinilla de afeitar / bisturí durante el corte.
  3. Tienda de tejido cerebral porcino en CO 2 medio nutriente -independiente de tejido nervioso adulto en hielo y realizar mediciones de reometría (sección 5) en tejido fresco dentro de las 48 horas.

3. Microscopio de Fuerza Atómica compatible con sangría

  1. Preparar platos 60 mm de diámetro Petri (P60) con un bioadhesivo mejillón derivados de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    1. Preparar un stock de solución tampón neutral que consiste en bicarbonato de sodio 0,1 M en agua estéril con un pH óptimo de 8,0. Filtrar a esterilizar (0,2 micrones) el búfer de bicarbonato de sodio y se almacena a 4 ° C.
    2. En una campana de flujo laminar, mezclar una solución de 6,25% de NaOH bio-adhesivo y 3,125% de mejillón derivado en el tampón de bicarbonato de sodio.
    3. Pipetear 100 pl de la solución bio-adhesivo de 3.1.2 en una punta de Petri (P60) plato y el uso de pipetas de 60 mm de diámetro para difundir sollución en un círculo de 3-5 cm de diámetro.
    4. Deja P60 platos descubiertos en campana de flujo laminar y dejar secar la solución (~ 30 min). platos de lavado 1X con PBS y 2x con agua estéril. Deje secar los platos del aire en cabina de flujo laminar y guardar en una bolsa de plástico sellada a 4ºC por hasta 1 mes.
  2. Calibrar el AFM y muestra de cerebro puesta a punto en el AFM.
    NOTA: Siga las instrucciones de calibración AFM según el fabricante.
    1. Coloque con cuidado una sonda de AFM con una constante de elasticidad nominal de 0,03 N / my una micras de diámetro borosilicato talón 20 en el soporte de la sonda.
    2. Calibrar la constante de elasticidad y sensibilidad palanca óptica inversa (InvOLS) del voladizo del AFM utilizando el método de ajustar las características térmicas 15,16.
      NOTA: Una vez que se calcula la constante de resorte para una sonda de AFM, debe permanecer constante con el uso repetido. Sin embargo, tendrán que ser recalibrado cada vez que el láser se vuelve a alinear con el voladizo InvOLS los voladizos. Además, la calibracióndebe ser realizado en contra de un varios orden de magnitud sustrato más rígido que el voladizo, tal como poliestireno.
    3. Encender el calentador etapa montada y ajustar la temperatura a 37 ° C.
    4. Montar el corte de cerebro sobre los platos preparados P60 en la sección 3.1.
      1. Verter suavemente un corte de cerebro de espesor 350 micras, así como el CO 2 medio -independiente del matraz de fondo redondo en una placa de P60 recubierto con el bioadhesivo mejillón derivados.
      2. Al inclinar suavemente el plato P60, la posición de la sección de cerebro en el centro del plato. Si es necesario, una pipeta lentamente medio de una pipeta manual para desplegar un corte de cerebro que se ha plegado sobre sí misma o mejor la posición de la sección de cerebro en el centro del plato.
      3. Eliminar cuidadosamente el exceso de medios usando una pipeta P1000 (no utilice el vacío).
      4. Coloque la cubierta en el plato P60 y dejar que el corte de cerebro se adhieran durante 20 minutos.
    5. Retire el cabezal AFM, colocar el corte de cerebro montado en la P60plato en la etapa de AFM, y añadir ~ 2 ml de pre-calentado CO 2 medio -independiente.
    6. Añadir cuidadosamente una gota de medios de comunicación en la sonda AFM para protegerlo de la rotura debido a la tensión superficial cuando se baja en los medios que rodean la sección de cerebro.
    7. Cambiar la posición de la cabeza AFM en el escenario, y comenzar a bajar la cabeza hasta que se sumerge en los medios de comunicación.
    8. Uso de la cámara CCD de alto punto de vista, cambiar la posición del láser sobre el voladizo.
      NOTA: La alineación del láser en el voladizo habrá cambiado ligeramente debido a la diferencia en el índice de refracción del aire y medio.
    9. Espere 5 minutos para el voladizo se ajuste a estar sumergido en un líquido caliente, a continuación, restablecer la alineación del espejo a una desviación libre de 0 V.
    10. Ejecutar un espectro térmico en la sonda AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante 16. Utilice el ajuste del primer pico térmico para volver a calcular InvOLS de la sonda de AFM en los medios de comunicación.
    11. Usando el microscopio óptico,mover la etapa de la muestra de tal manera que la región del cerebro de interés por debajo de la sonda de AFM.
      NOTA: El cuerpo calloso se verá oscura, ya que es más opaca que la materia gris circundante. La corteza es superior a la del cuerpo calloso.
    12. Restablecer la alineación del espejo a una desviación libre de 0 V.
    13. En la Suma y la deflexión del medidor en el software de AFM, haga clic en "Participar" para enganchar la cabeza AFM.
    14. Utilización del dial de la posición en la cabeza AFM, bajar la cabeza hasta que se hace el contacto entre la palanca y la muestra.
  3. (Opcional) Si se desea, medir el módulo elástico de la muestra, como se describió previamente 4,17,18.
  4. Llevar a cabo experimentos de deformación por fluencia.
    1. Construir una función de la fuerza aplicada en función de editor de software. La función de la fuerza consiste en una rampa de 0,1 segundos a un punto de 5 nN conjunto y mantenerla durante 20 segundos, seguido de un 1 seg deceleración a una fuerza aplicada de 0 NN.
      1. En la sangría Master PAnel, bajo el método de la sangría, seleccione "Cargar" para el modo penetrador; "N" para las unidades; y "editor de funciones" para la función del penetrador.
      2. En el editor de funciones, en el segmento de panel Parms, crear un segmento de la función de la fuerza aplicada que comienza en 0 nN, termina en 5 nN, con un tiempo de 0,1 seg. Haga clic en "Insertar ->".
      3. Para el siguiente segmento, arranque establecida de 5 nN, de extremo a 5 nN, y el tiempo de 20 seg. Haga clic en "Insertar ->".
      4. Para el segmento final, de arranque establecida de 5 nN, de extremo a 0 nN, y el tiempo de 1 seg. Haga clic en "Draw" y cierre la ventana de función Editor.
    2. En la ficha Fuerza del panel maestro, marque "rampa penetrador después del disparo" y ajustar la función de la fuerza aplicada para disparar después de llegar a un punto de 0,1 V. gatillo
    3. Haga clic en "sola fuerza" en la parte inferior de la ficha de trabajo del panel maestro, lo que activará la función de la fuerza aplicada construido para el cumplimiento de la fluencia.
    4. Después de lasola muesca fuerza se terminó, levantar la cabeza AFM de modo que está fuera de contacto con la muestra y vuelva a enganchar la cabeza y volver a la desviación cero libre.
    5. Volver a colocar la etapa de la muestra para ubicar una nueva área de interés, y bajar la cabeza AFM para hacer contacto. NOTA: La cabeza AFM debe retraerse desde la superficie de la muestra cuando la etapa de la muestra se mueve. El no hacerlo puede resultar en daños a la delicada voladizo del AFM.
    6. Repita los pasos 3.4.3-3.4.5 hasta que la cantidad deseada de los datos han sido recogidos.
  5. Llevar a cabo experimentos de relajación de la fuerza.
    1. Construir una función de sangría que se aplica en función de editor de software. La función de indentación consiste en una rampa de 0,1 seg a un punto de 3 micras conjunto y mantenerla durante 20 seg, seguido de una 1 sec rampa hacia abajo a una profundidad de indentación de 0 m.
      1. En el panel maestro sangría, bajo el método de la sangría, seleccione "sangría" para el modo penetrador; "M" para las unidades; y "; Editor de funciones "para la función del penetrador.
      2. En el editor de funciones, en el segmento de panel Parms, crear un segmento de la función de la fuerza aplicada que comienza en 0 m, termina a 3 micras, con un tiempo de 0,1 seg. Haga clic en "Insertar ->".
      3. Para el siguiente segmento, set empezar a 3 micras, de extremo a 3 m, y el tiempo de 20 seg. Haga clic en "Insertar ->".
      4. Para el segmento final, de arranque establecida a 3 micras, de extremo a 0 m, y tiempo de 1 seg. Haga clic en "Draw" y cierre la ventana de función Editor.
    2. En la ficha Fuerza del panel maestro, marque "rampa penetrador después del disparo" y ajustar la función de la fuerza aplicada para disparar después de llegar a un punto de 0,1 V. gatillo
    3. Haga clic en "sola fuerza" en la parte inferior de la ficha de trabajo del panel maestro, lo que activará la función de sangría que se aplica construido para la fuerza de relajación.
    4. Una vez finalizada la sola fuerza de indentación, levantar la cabeza AFM de modo que seafuera de contacto con la muestra y luego volver a enganchar la cabeza y la deflexión re-cero.
    5. Volver a colocar el escenario para ubicar una nueva área de interés, y bajar la cabeza para hacer contacto.
    6. Repita los pasos 5.3 a 5.5 hasta que se haya recogido la cantidad deseada de datos.
  6. La conclusión de los experimentos y limpieza.
    1. Después de concluir los experimentos, levantar la cabeza AFM y sacarlo de la muestra.
    2. Utilice un pañuelo de laboratorio para eliminar el exceso de líquido con cuidado sin tocar el voladizo.
    3. limpiar con cuidado el soporte voladizo del AFM utilizando una pequeña cantidad de etanol. No exponga los componentes electrónicos delicados en el soporte voladizo de etanol. Retire el voladizo del AFM y colocar en un contenedor de almacenamiento.
    4. Disponer de la muestra de tejido cerebral siguiendo los protocolos de bioseguridad adecuadas.
  7. Usando MATLAB, calcular deformación por fluencia y la fuerza de los módulos de relajación utilizando la geometría del indentador, de acuerdo con la solución derivada por Lee y Radok, 1960 19.
    1. Calcular la fuerza F y profundidad de la huella figure-protocol-1 a partir de datos sobre la posición en voladizo z, d, deflexión y constante del resorte k, c

      figure-protocol-2 y figure-protocol-3 .
    2. Busque el punto de contacto a lo largo de la curva de la sangría utilizando el algoritmo descrito en Lin et al. 20.
    3. Definir una ventana de interés para el análisis de datos. La ventana de interés es la región en la que cualquiera de fuerza (por deformación por fluencia) o profundidad de indentación (por fuerza de relajación) se mantiene a un valor de consigna (es decir, Región 3, como se muestra en la Figura 1C, D).
    4. Para los experimentos de deformación por fluencia, se calcula el módulo de deformación por fluencia experimental, J c (t), en respuesta a una carga de pason 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq4.jpg "/>:
      figure-protocol-4 ,
      donde H (t) es la función de paso Heavyside y R es el radio de la sonda esférica.
    5. Para los experimentos de fuerza de relajación, calcular el módulo fuerza de relajación experimental, G R (t), en respuesta a una profundidad de indentación paso figure-protocol-5 :
      figure-protocol-6 .

4. Impacto sangría

  1. Calibrar el nanoindentador instrumentado y ajustar la configuración por defecto para permitir experimentos de impacto dinámico en los tejidos del cerebro hidratadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    1. Montar una sonda esférica deslizándola en el péndulo con unas pinzas.
    2. Pegar una muestra de cuarzo fundido en el poste de la muestra, que se atornilla en la traslaciónescenario.
    3. Ir al menú de calibración y seleccione "celular líquido." Siga las instrucciones del software para hacer contacto con la muestra de cuarzo fundido.
    4. Seleccione "Normal" para el tipo de penetrador y utilizar el valor por defecto de 0,05 mN para la carga del penetrador. Haga clic en "Continuar" para realizar la calibración de la configuración normal penetrador.
    5. Mueva la etapa de la muestra de nuevo por al menos 5 mm. Montar el brazo de palanca, lo que permite que la sonda se introduce en el líquido celular, y repetir la calibración de células de líquido en la nueva configuración seleccionando "celular líquido" para el tipo de penetrador. Haga clic en "Continuar" para obtener el factor de calibración celular líquido.
    6. Active la opción de software celular líquido yendo al menú experimento y seleccionando "Opciones especiales." Utilice el último valor de calibración.
    7. Aumentar la distancia de la base del condensador ya que esto dará lugar a una mayor profundidad máxima medible, lo cual es necesario cuando se prueba higHly materiales compatibles.
      1. Bajo el menú del sistema, seleccione "Configuración no protegidas" y "Parámetros máquina" para cambiar la velocidad de ensayo de péndulo de carga, velocidad de carga cero, y la rampa de espera compensar a 0,5 mN / seg, 0,1 mN / seg, y 3 V, respectivamente.
      2. Con una llave, gire las tres tuercas que controlan la placa de condensador de las agujas del reloj separación en pequeños incrementos.
      3. Después de cada vuelta en sentido horario completo, seleccionar "Ajuste Puente Box" en el menú de mantenimiento y obtener una buena prueba del péndulo, lo que requerirá mover el peso de contrapeso lejos del péndulo.
      4. Repetir los pasos hasta que la calibración 4.1.7.2-4.1.7.3 profundidad aproximada lee un valor de 70.000 nm / V o superior.
    8. Situar un nuevo límite en la parte inferior del péndulo que se pueden conectar y desconectar a través de una fuente de alimentación. Retraer el tope original de sentado detrás del péndulo para eliminar una obstrucción potencial del movimiento del péndulo y permitir una mayorvelocidades de impacto, así como las profundidades de penetración más elevadas en muestras no conformes.
    9. Deje que la cabina alcance el equilibrio térmico (tarda aproximadamente 1 hora).
    10. Mientras que el gabinete se equilibra, volver al menú del sistema y seleccione "Configuración no protegidas" y "parámetros de la máquina." Ajuste la profundidad de la velocidad de calibración (DCAL) de contacto de 1 m / s, la velocidad de contacto primario muesca a 3 m / s, y la velocidad de carga de los contactos de ultra bajo a 1 m / seg.
    11. Bajo el menú de calibración, realizar una calibración de profundidad estándar en esta nueva configuración.
    12. Encienda la fuente de alimentación para el solenoide y la puso a 10 V. Vaya al menú y seleccione Experimento "Impacto" y "Ajuste del impulso Desplazamiento". Siga las instrucciones del software (le pide automáticos) para calibrar la distancia oscilación del péndulo.
  2. Montar el tejido cerebral del ratón en la celda líquida.
    1. Después de cosechar todo el cerebro de step 1.5, almacenar inmediatamente en CO 2 -independiente medio nutritivo para los medios tejido nervioso adulto en hielo.
    2. Una vez configurada la muesca impacto es totalmente completa, transferir cuidadosamente el cerebro en una placa de Petri, junto con CO 2 medio -independiente. Cortar el cerebro en 6 mm de grosor con superficies planas a ambos lados.
    3. Adherir el tejido en rodajas para el poste de muestra de aluminio con una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato.
    4. Deslice la célula líquido sobre la segunda junta tórica en el poste de la muestra, y llenar el líquido celular con 5 ml de CO 2 medio -independiente para sumergir completamente el tejido. Este post muestra se monta con cuidado en la etapa de traslación en el interior del nanoindentador instrumentado.
  3. Medir la respuesta impacto del tejido cerebral.
    1. Si es necesario, retire la sonda esférica y sustituirla por la sonda de interés sin necesidad de retirar el brazo de palanca.
    2. Bajo el menú Sistema, seleccione "no protegidasConfiguración "y" Parámetros de la máquina. "Cambiar la velocidad de contacto principal impacto a 5 micras / seg.
    3. Con el baño de muestra de baja (dirección -z) y lejos del péndulo (+ dirección x), moverse en la dirección -x hasta que la punta en el brazo de palanca está correctamente situado por encima del baño. Moverse en la dirección + z hasta que la punta está totalmente sumergido en el baño y en frente de la muestra.
    4. Uso de la ventana de control de etapa de la muestra, hacer contacto con cuidado y luego de nuevo la etapa de distancia de la superficie de la muestra en aproximadamente 30 micras.
    5. Bajo el menú Experimento, haga clic en "Impacto" para configurar una prueba de impacto. Elija una carga de impulso específico que se relacionan directamente con la velocidad de impacto resultante sobre la base de la calibración de la distancia media vuelta. Ejecutar el experimento programado.
    6. Cuando el péndulo oscila hacia atrás y la superficie de la muestra continúa moviéndose al plano de medición, gire el interruptor de parada de límite inferior fuera.
    7. Observe que el péndulo oscila forward para impactar la muestra. El desplazamiento de la sonda como una función del tiempo será registrado por el software.
    8. Cuando aparezca la ventana del escenario XYZ, gire el interruptor de fin de carrera de nuevo.
    9. Repita los pasos 3.4-3.8 para probar la mayor cantidad de cargas y lugares diferentes, según sea necesario.
  4. Analizar el desplazamiento adquirida vs tiempo de respuesta del péndulo utilizando secuencias de comandos de MATLAB personalizados para determinar la profundidad máxima de penetración x max, capacidad de disipación de energía K, y el factor de calidad Q de disipación. 11
    1. Vaya al menú Análisis y exportar los datos en un archivo de texto.
    2. Tomar la derivada en el tiempo del perfil de desplazamiento para obtener velocidad como una función del tiempo. Ajuste de desplazamiento cero como el punto de contacto x o1.
      NOTA: Impacto velocidad v en es la velocidad máxima inmediatamente antes de ponerse en contacto con x max corresponde a la deformación a la que la sonda.velocidad disminuye primero a cero. x o2, que es equivalente a x r, es la posición requerida para reiniciar el contacto con la muestra deformada en el siguiente ciclo. V velocidad de rebote a cabo es la velocidad en el desplazamiento x r.
    3. Definir K (sin unidad) como la energía disipada por la muestra normalizada por la suma de las energías muestra recuperada y se disipa durante el primer ciclo de impacto. Calcula K en base a las propiedades intrínsecas del péndulo 21 (tales como rigidez rotacional y coeficiente de amortiguación), x o1, x max, x r, v, y v a cabo.
      NOTA: Para obtener más información, se puede consultar la obra de Kalcioglu et al., 2011.
    4. Desde desplazamiento puede ser descrito como un movimiento oscilatorio armónico amortiguado, encajar una función de decaimiento exponencial a los máximos de los discolocación frente a la curva de tiempo.
    5. Calcular Q (sin unidades) como π multiplicado por el número de ciclos necesarios para la amplitud de oscilación para disminuir en un factor de e. Un valor Q más alto significa una capacidad de disipación de energía más bajo.

5. La reología

  1. Puesta en marcha y calibrar el reómetro según las instrucciones del fabricante.
    1. Inicializar el reómetro abriendo el panel del dispositivo / control. En la pestaña del panel de control, haga clic en "inicializar".
    2. Montar la placa de 25 mm de diámetro de medición (PP25) y el sistema térmico.
    3. (Opcional) Para reducir el deslizamiento entre las placas del reómetro y el tejido, cortar rodajas de papel de lija adhesivas que coinciden con la forma de la placa superior del reómetro y se adhieren al papel de lija para la placa superior e inferior.
    4. Hacer contacto entre la placa superior e inferior haciendo clic en "asigna el valor cero brecha" en el panel de control.
    5. Cero el transductor de fuerza normal por clicking "reset fuerza normal."
    6. Llevar a cabo un ensayo de inercia con la apertura de la pestaña de servicios en el panel de control, en "sistema de medición", y luego haciendo clic en "ensayo de inercia". Registre el antiguo y el nuevo inercia. Compruebe que la inercia se encuentra dentro del límite permitido para la sonda, como se indica por el fabricante.
  2. Cargar la muestra en el reómetro.
    1. Después de cosechar el tejido y cortar un segmento coronal del cerebro de cerdo de espesor ~ 5 mm, almacenarlo en hielo en CO 2 medio -independiente.
    2. Coloque el cerebro entre las dos placas. Eliminar grandes gotas de agua desde la superficie superior e inferior de la muestra para evitar el deslizamiento, pero no secar la muestra.
    3. Lentamente baje la placa de medición hasta que la placa está en pleno contacto con la superficie superior del tejido y la fuerza normal medida es consistente en 0.01 mN después de un período de relajación 5-10 min.
      1. En el panel de control para introducir alturas sucesivamente más bajos in el cuadro de posición de medición y haga clic en "posición de medición" para bajar lentamente la placa de medición.
      2. Cuando dentro de un milímetro de contacto con el tejido, bajar la placa de medición en incrementos de 0,1 mm hasta que la placa está totalmente en contacto con la superficie superior del tejido. Asegúrese de que la fuerza medida normal es consistente en 0.01 mN después de un período de relajación 5-10 min.
      3. Registrar la fuerza normal medido inicial. Las medidas repetidas se deben tomar a la misma compresión esfuerzos / deformaciones.
    4. Recorte la muestra con una hoja de plástico si la muestra supera el diámetro de la placa. Pipetear un volumen pequeño (~ 1-2 ml) de medios de comunicación en los bordes de la muestra para hidratar el tejido.
    5. (Opcional) Bajar la cubierta térmica. En el panel de control, ajustar la temperatura a 37 ° C y haga clic en "set".
  3. Realizar un barrido de amplitud para establecer el rango viscoelástico lineal del material (es decir, la cizallacepas en la que G 'y G' 'son constantes) en las frecuencias de interés (por ejemplo, 1 rad / seg).
    1. Seleccione "Archivo / Nuevo". En la pestaña de gel seleccionar "barrido Amplitud: LVE-gama." Seleccione la ventana y haga clic en "Medida 1: barrido de amplitud." Haga doble clic en el cuadro de oscilación. Introduzca la cepa inicial y final (por ejemplo, de 0,01 a 105), la frecuencia (por ejemplo, 1 rad / seg) y el número de puntos por década (por ejemplo, 6 puntos / DEC). Seleccione "OK" y haga clic en inicio ".
    2. Repita este procedimiento para varias rebanadas con la repetición de pruebas para garantizar la coherencia del rango elástico lineal. La compresión axial de la muestra debe permanecer constante entre las muestras.
  4. Llevar a cabo un barrido de frecuencia del tejido en una cepa en el intervalo viscoelástico lineal de los tejidos (por ejemplo, 1% de tensión) 22, y en un rango de frecuencia de interés (por ejemplo, 0,1 a 100 rad / seg).
    1. Hacer clic "Archivo / Nuevo" y en la pestaña de gel seleccionar "barrido de frecuencia." Haga clic en la ventana / Medida 1: barrido de frecuencia. Haga doble clic en el cuadro de oscilación. Introduzca la gama de frecuencias (por ejemplo, 0,1 a 100 rad / s), la cepa (por ejemplo, 1% de deformación) y el número de puntos por década (por ejemplo, 6 puntos / DEC). Seleccione "OK" y haga clic en "Inicio" para iniciar el barrido de frecuencia.
  5. barrido Frecuencia de repetición (paso 5.4) en duplicados o triplicados.
  6. Revisar los datos que se calculan y se exporta por el reómetro de forma automática: G 'y G "en función de la frecuencia (barrido de frecuencia) o la tensión de cizallamiento (barrido de amplitud.) NOTA: G' y G '' se calculan a partir de la muestra (máximo ) la amplitud de par reactional T '0, y el ángulo de desplazamiento rotativo (o ángulo de desviación) figure-protocol-7 Y retardo de faseEcuación 1 "src =" / files / ftp_upload / 54201 / 54201eq9.jpg "/>, de la respuesta de la muestra de la cepa oscilatoria aplicada (Figura 3):
    figure-protocol-8
    figure-protocol-9
    donde R y h son el radio y la altura de la muestra.

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Resultados

La figura 4 muestra la sangría representativa y la fuerza frente a respuestas de tiempo (Figura 4 B, E) para el cumplimiento de la fluencia y la fuerza de relajación experimentos, dada una fuerza aplicada o profundidad de la deformación (Figura 4 A, D), respectivamente. El uso de estos datos y de la geometría del sistema, la deformación por fluencia J c (t) y fuerza de relajación módulos G R (t) se...

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Discusión

Cada técnica presentada en este documento mide diferentes facetas de las propiedades mecánicas del tejido cerebral. deformación por fluencia y el estrés módulos de relajación son una medida de las propiedades mecánicas dependientes del tiempo. Los módulos de almacenamiento y pérdida de propiedades mecánicas representan dependiente de la frecuencia. indentación Impact también mide propiedades mecánicas dependiente de la frecuencia, pero en el contexto de la disipación de energía. En la caracterización de las propiedades ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo a este trabajo de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple y el Centro Simons para el Cerebro Social. BQ reconoce el apoyo del programa de Becas de Posgrado en Ciencia e Ingeniería de Defensa Nacional de los Estados Unidos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
XylazineLloyd Laboratorieddroga de prescripción
KetaminaAnaSed Inyecciones deprescripción
droga Vibratome (micrótomo de cuchilla vibratoria)LeicaVT1200
Hibernate-A MediumGibcoA1247501CO2-independent neural medium para tejido adulto
Microscopio de fuerza atómica, MFP-3D-BIOAsylumResearch-Calentador
plato de PetriAsylumResearch-AFM
0.03 N / m, 10  y micro; Esfera de borosilicato de radio mNovascanPT. GS
Hidróxido de sodio, 1 NSigma-Aldrich59223Cpueden utilizar proveedores alternativos
Indenter instrumentado, NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-La punta de la sonda debe mecanizarse (punzón plano de acero, 1  mm de diámetro, 4-5  mm de longitud)
NanoTest Liquid CellMicro Materials Ltd.-
Reómetro de placa paralela MCR501Anton-Parr-PP25
 Anton-Parr-Placademedición plana de 25 mm de diámetro
Papel de lija adhesivoMcMaster-Carr4184A48se pueden utilizar proveedores
alternativos Loctite 4013 Adhesivo instantáneoHenkel20268se pueden utilizar proveedores alternativos
de Probe, Cell-Tak Corning 354240 bioadhesivo derivado del mejillón Bicarbonato de sodio Sigma-Aldrich S5761 se pueden utilizar proveedores alternativos se

Referencias

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