Introduction
Skelett- och hjärtmuskelsammandragning utlöses av sarko nätmagen Ca2 + frisättning medierad av Ryr. Det finns tre däggdjurs Ryr isoformer med funktionskanalen består av fyra identiska subenheter. Varje Ryr subenheten består av en stor cytoplasmisk reglerings N-terminala delen och en liten C-terminala delen som innehåller de transmembrandomäner som bildar en hög konduktans Ca2 + por. Onormal intra- och inter-subenheten interaktioner bakom Ryr kanal dysfunktion och resultera i neuromuskulär och hjärtsjukdomar 1. Identifieringen och karakteriseringen av specifika domäner som är involverade i Ryr struktur: funktion relation är därför av avgörande betydelse för förståelsen av Ryr patofysiologi.
Traditionella biokemiska protein-proteininteraktions tekniker kräver betydande mängder renat protein, som ofta produceras i bakterier. Detta är inte möjligt i fallet med Ryr, en mycket stor membran protein består av ~ 5000 aminosyror, medan dess rekombinanta fragment inte lätta att bakteriell expression och rening. Sålunda beskrivs alternativa expressionssystem som inbegriper eukaryota värdceller som krävs för däggdjurs integrerade membranproteiner. Vi har tidigare anställd Y2H, co-IP och tvärbindningsanalyser för att kollektivt visa att N-terminal tetra är ett strukturellt drag som är konserverat över tre däggdjurs Ryr isoformer 2,3. Viktigt, har vi funnit att en enda punktmutation i samband med arytmogena hjärtsjukdom stör N-terminal självassociation och resulterar i en dysfunktionell Ryr kanal 4. Vi har också tillämpats dessa tekniker för att oligomerisering studier av Ryr cytoplasmatiska C-terminala svansen 5 såväl som N-änden av den homologa intracellulära Ca2 + frisättning kanal, inositol 1,4,5 trisfosfat receptor 2.
I Y2H analysen, den interactipå mellan två proteiner (X och Y) mäts genom rekonstitution av en funktionell transkriptionsfaktor (GAL4) och den efterföljande aktiveringen av reportergener 6-9. Två olika kloningsvektorer används för att generera fusioner av de två testade proteiner med de två fysiskt separerbara, oberoende domäner av GAL4: DNA-bindande domän (DNA-BD) / protein X fusion (bete) och aktiveringsdomän (AD) / protein Y fusion (mål). Den Y2H kan användas för att testa om ett protein interagerar med sig själv genom att generera GAL4 DNA-BD och AD fusioner av samma protein. Genetiskt modifierade Y2H stammar GAL4 och GAL80 bristfällig (den GAL80-proteinet är en repressor av GAL4), liksom TRP1 och LEU2 bristfällig (för att ge närings val för bete och bytes plasmider, respektive). I jästen kärna, är de rekombinanta DNA-BD och AD-peptider bringas i nära fysisk närhet för att producera en hybrid GAL4 transkriptionsfaktor endast genom fusioner "X: Y interaction. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb genetisk screening för att detektera protein-proteininteraktioner genom parallell transkriptionell aktivering av prototrofa (HIS3 som kodar för ett enzym som krävs för histidin-biosyntes) och kromogen (LacZ som kodar för β-galaktosidas (β-Gal)) reportergener. Den största fördelen med den Y2H är att det är en in vivo-analys som detekterar även svaga eller transienta protein-proteininteraktioner. Dessutom involverar detektion den enkla användningen av urvals tillväxt (i media som saknar histidin) eller av en kolorimetrisk (β-Gal) -analys utan behov av rening av betet och målproteiner eller generering av specifika antikroppar. Dessutom kan Y2H användas för att screena en samling av slumpmässiga okända kloner (cDNA-biblioteksklonerna fuserade till GAL4 AD) för nya bindningspartners av en betesprotein, också ger direkt tillträde till cDNA av biblioteket proteinet.
Att förlänga Y2H observationer, två friståendeent biokemiska tekniker kan användas. Co-IP och tvärbindningsanalyser i kombination med immunoblotting är metoder som används för att detektera proteinföreningar i komplexa provblandningar, t ex., Hela cellysat 10. Deras huvudsakliga fördel är att de rapporterar om protein-proteininteraktioner från naturlig vävnad, till skillnad från andra metoder som kräver användning av rekombinanta proteiner. Rekombinanta proteiner kan också användas, typiskt uttryckt i en cellinje från däggdjur, där de sannolikt kommer att ha sina korrekta konformation och posttranslationella modifieringar, såväl som subcellulära lokalisering. Eftersom emellertid co-IP och tvärbindning är in vitro-analyser som använder sig av homogeniserade celler, är det nödvändigt att bekräfta huruvida de två proteinpartners är co-lokaliserad i den intakta cellen 11. Vi använder rutinmässigt transfektion av däggdjurs HEK293-celler att övergående uttrycka däggdjurs integrerad membran och cytosoliska proteiner med användning av kalciumfosfatfällningsmetoden 2-4,12-14, Beskrivs här i detalj. Detta är ett billigt sätt att effektivt leverera den plasmid-DNA inuti celler, men det är beroende av den särskilda cellinjen som används och cellsammanflödet, samt renheten hos plasmid-DNA 11,15.
Co-IP analys involverar isolering av det nativa eller rekombinant protein av intresse från cellysat under icke-denaturerande betingelser som möjliggör samtidig rening av förmodade interaktionspartners 10,16. Det kräver användning av två oberoende antikroppar, den immunoprecipitating antikropp för isolering av protein X, och immunoblotting antikropp för detektion av proteinpartner Y. Den kan användas för att testa om ett protein interagerar med sig själv genom att generera två olika fusioner med två annan epitop taggar (eg., HA och cMyc). Den immunoprecipitating antikroppen är bunden via sin Fc-region på Protein-A (eller protein-G, beroende på den djurart, där antikroppen togs upp), vilketkonjugeras till agaros (eller Sepharose) harts. Protein X utfälles genom antikropp: protein-A-harts efter inkubation med cellysatet, nämligen detergent-lösliga fraktionen av homogeniserade celler. Proteinimmunkomplex elueras med SDS-innehållande buffert och analyserades därefter med SDS-PAGE och immunoblotting med användning av en antikropp för att detektera närvaron av protein Y 17. Co-IP bör utföras med detergent lösliga proteiner för att undvika överdriven icke-specifik bindning. Valet av tvättmedel och dess koncentration, liksom antalet tvättar, bör optimeras för varje X: Y par 10,16,18.
Tvärbindning används för att bestämma stökiometrin hos den oligomera proteinkomplex. Den är baserad på en kemisk reaktion för att skapa kovalenta bindningar mellan intilliggande samverkande protomerer, och därför möjliggör den bevara proteinets oligomera status under SDS-PAGE-separation. Det finns många tvärbindnings Reagents av olika längd och kemi inriktade på olika reaktiva grupper på proteiner, typiskt primära aminer, karboxyl eller tiolgrupper. Här beskriver vi användningen av glutaraldehyd (OHC (CH2) 3 CHO), en homo-bifunktionella tvärbindare med två aldehydgrupper på vardera änden som reagerar med fria aminogrupper som är närvarande i lysinrester 19,20. Tvärbindning följs på ett koncentrations eller tidsberoende sätt som resulterar i adduktbildning. Glutaraldehyd Reaktionen stoppas med hydrazin (H 2 NNH 2) och proteinprover analyseras sedan med SDS-PAGE och immunoblotting 17 för att utvärdera deras oligomerisering tillstånd. Vi bör notera att tvärbindning inte inducerar oligomerisering utan endast skapar stabila broar mellan befintliga proteinkomplex. Viktiga överväganden vid utför tvärbindningsexperiment innefattar valet av tvärbindningsmedel, dess koncentration och reaktionstiden 19,20.
Protocol
1. Jäst två-hybrid
- jäst Transformation
- Förbered följande media och buffertar:
- Förbereda jäst komplett jästextrakt-pepton-dextros (YPD) medium genom att blanda 20 g / L pepton, 10 g / L jästextrakt, 2% vikt / volym glukos (tillsatt efter autoklavering) och 20 g / L agar (för tallrikar endast) ; sterilisera genom autoklavering och använda färsk på dagen för experimentet.
- Förbereda jäst minimal syntetisk definierade (SD) medium (som saknar leucin och tryptofan för att hålla selektivt tryck på båda bete och mål-plasmider) genom att blanda 6,7 g / L av jästkvävebas, 1,6 g / L dropout tillägg som saknar leucin och tryptofan, 2% vikt / volym glukos (tillsatt efter autoklavering) och 20 g / L agar (för tallrikar endast); sterilisera genom autoklavering och använda färsk på dagen för experimentet.
- Förbered 50% vikt / volym PEG (polyetylenglykol) 3350; sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid rumstemperatur.
- Förbered 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE), justerapH till 7,5, sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid RT.
- Förbereda en M litiumacetat (10x LiAc); justera pH till 7,5 med CH3COOH, sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid RT.
- Återuppliva Y2H stam (t.ex. Y190) genom utstrykning av en liten mängd av den frysta glycerolförråd på en YPD-platta. Inkubera vid 30 ° C tills jästkolonier når ~ 2 mm i diameter (vanligen 3 - 5 dagar, beroende på jäststammen).
- Ympa 0,5 ml YPD (i ett 1,5 ml rör) med en enda stor (2 - 3 mm i diameter) koloni. Skaka kraftigt för ~ 2 minuter för att skingra några klumpar.
- Överföra cellsuspension i en 500 ml kolv innehållande 50 ml YPD-medium. Inkubera vid 30 ° C under 16-18 h med skakning vid 250 varv per minut för jäst för att nå stationär fas.
- Överföring 4-5 ml av den över natten odlade kulturen i 200 ml YPD (i en 1 L konisk kolv) för att producera en optisk densitet vid 600 nm (OD 600, mättmed hjälp av en spektrofotometer) av 0,2 - 0,3 (200 ml kommer att vara tillräckligt för 20 transformationer).
- Inkubera vid 30 ° C med skakning vid 250 rpm tills cellerna är i mitten av log-fasen, dvs., OD 600 = 0,5 till 0,6 (vanligtvis 2-3 h).
- Skörd jäst genom centrifugering (i 50 ml rör) vid 1500 xg under 5 min vid RT. Kassera supernatanten, återsuspendera varje pellet i 5 ml sterilt H2O och pool tillsammans.
- Re-centrifug vid 1500 xg under 5 min vid RT och kassera supernatanten. Resuspendera jäst pelleten i 1 ml nyberedd, steril 1x LiAc / TE.
OBS: Använd kompetenta jästceller inom en timme av förberedelser. - Framställa plasmid-prover (i 1,5 ml rör) genom tillsats av 200 ng av plasmid-DNA för enstaka transformationer, eller 0,5-1 | ig av varje plasmid-DNA för co-transformationer, och 100 | j, g av sill testes bärar-DNA (kokades under 20 min och kyldes på is strax före användning).
OBS: Inkludera en positiv kontroll, t.ex. jäst.samtransformerade med pVA3 (kodning för GAL4 DNA-BD fusion med p53-protein) och pTD1 (kodning för GAL4 AD fusion med SV40 stort T-antigen). - Tillsätt 100 pl av den nyberedda, kompetenta jästsuspension (steg 1.1.8) och 600 pl av 1x LiAc / PEG-lösning (8 ml av stock PEG 3350, 1 ml av stam TE, 1 ml av lager LiAc), och virvel för ~ 30 sek. Inkubera vid 30 ° C under 30 min med skakning vid 200 rpm.
- Tillsätt 80 pl dimetylsulfoxid (10% v / v slutlig koncentration) och blanda väl genom att försiktigt vända. Värmechock under 15 minuter i ett 42 ° C vattenbad under blandning varje 2-3 min.
- Chill cellsuspensionen på is under 2 min och centrifugera vid 14.000 xg under 15 sek vid RT för att återhämta jäst.
- Resuspendera cellpelleten i 100 ^ 1 x TE och plattan på lämpliga minimala SD-mediumplattor för selektiv tillväxt (medium som saknade leucin och tryptofan för att hålla selektivt tryck på båda bete och mål-plasmider).
- Inkubera plattorna upp och ned på 30° C tills kolonier är ~ 2 mm i diameter (vanligtvis 4 - 5 dagar). Plattorna kan lagras vid 4 ° C i 2 - 3 veckor; längre lagring gör glycerollager och förvara vid -80 ° C.
OBS: Kontrollera att bete och målproteiner uttrycks i jäst genom immunoblotting 17, och att de inte har autonom reporter genaktivering när separat uttrycks i jäst (genom β-Gal-analys som beskrivs i avsnitt 1.3).
- Förbered följande media och buffertar:
- Koloni-lift filterpapper β-Gal-analys
- Förbered följande buffertar:
- Förbered Z-buffert innehållande 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4; justera pH till 7,4. Sterilisera genom autoklavering och förvaras vid RT.
- Förbereda X-Gal-buffert genom upplösning av 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid vid 20 mg / ml i N, N-dimetylformamid och lagra i mörker vid -20 ° C. Förbereda Z-buffert / X-Gal-lösning. gör buffertföre användning genom blandning av X-Gal vid 0,33 mg / ml och β-merkaptoetanol vid 0,27% volym / volym i Z-buffert. Använd 2,5 ml per prov.
- Tillsätt 2,5 ml av nyberedd Z-buffert / X-Gal-lösning i en ren 100 mm platta och plats inuti ett cellulosafilterpapper.
- Placera en ny filterpapper över ytan av plattan med de jästkolonier som skall analyseras. gnugga försiktigt filterpapper på plattan med pincett och låt stå i ~ 5 minuter för kolonier att fästa.
OBS: Behandla den positiva kontrollen parallellt, dvs jäst samtransformerade med pVA3 och pTD1.. - Lyft filterpapper och dränka den (med pincett) i en pool av flytande kväve under 30 sekunder (flytande kväve bör hanteras med försiktighet, alltid bära tjocka handskar och skyddsglasögon). Låt frysta filterpapper tina vid RT under ~ 2 min.
- Placera filterpapper (med kolonisidan upp) på toppen av den i förväg indränkt filterpapper inuti 100 mm platta, och inkubera vid 30 ° C.
- Kontrollera med jämna mellanrum(Varje ~ 30 min) för uppkomsten av blå kolonier. Jäst Y190 samtransformerade med de positiva kontroll plasmider (pVA3 + pTD1) blir blå i 60 min (opublicerade observationer).
OBS: Svag bete: mål interaktioner kan ta flera timmar att producera en positiv blå signal (undvika långvarig inkubation (> 8 timmar) som kan ge falskt positiva resultat). För bästa resultat, använd nyligen co-transformerade kolonier, det vill säga, odlades vid 30 ° C under 4 -. Fem dagar, ~ 2 mm i diameter.
- Förbered följande buffertar:
- Flytande odlings β-Gal-analys
- Förbered följande buffertar:
- Förbered Z-buffert innehållande 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4; justera pH till 7,4, sterilisera i autoklav och lagra vid RT.
1 M Na 2 CO 3; lagra vid RT. - Förbereda Z-buffert / β-merkaptoetanol. Göra buffert före användning genom tillsats av β-merkaptoetanol vid 0,27% v /volym i Z-buffert; använda 700 l per prov. Förbered Z buffert / ONPG lösning. Göra buffert före användning genom blandning av ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid) vid 4 mg / ml och β-merkaptoetanol vid 0,27% volym / volym i Z-buffert; använda 160 l per prov.
- Förbered Z-buffert innehållande 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4; justera pH till 7,4, sterilisera i autoklav och lagra vid RT.
- Använda en enda koloni för att inokulera 5 ml av minimalt SD-medium (som saknar leucin och tryptofan för att hålla selektivt tryck på båda bete och mål-plasmider) och inkubera vid 30 ° C under 16-18 h med skakning vid 250 rpm.
OBS: Analys fem separata kolonier samtransformerade med samma bete och mål plasmider. - Överföra tillräckligt mycket av natten kultur i 10 ml färskt SD-medium för att framställa en OD 600 = 0,2 till 0,3. Inkubera vid 30 ° C med skakning vid 250 rpm tills cellerna är i mitten av log-fasen (OD 600 = 0,5-0,6).
- Överför 0,5 ml av jästkultur in i ett 1,5 ml rör och centrifugera vid 14.000 xg under 2 min vid rumstemperatur. Anteckna exakt OD 600 när skörd cells. Återsuspendera pelleten i 100 | il av Z-buffert; detta kommer att resultera i en 5-faldig koncentrationsfaktor.
- Placera röret i flytande kväve för ~ 1 minut (flytande kväve bör hanteras med försiktighet, alltid bära tjocka handskar och skyddsglasögon) och sedan i en 37 ° C vattenbad under 3 minuter för att tina. Upprepa denna frysnings-upptiningscykel ytterligare två gånger för att säkerställa celler bryts öppna.
- Inrätta ett tomt rör med 100 | il av Z-buffert.
- Lägg 700 pl Z-buffert / β-merkaptoetanol och 160 | il Z-buffert / ONPG till provet och blind rör; starta timern och lägg i en 30 ° C inkubator.
- Kontrollera med jämna mellanrum för gul färg utvecklas. Tillsätt 400 pl av 1 M Na 2 CO 3 för att stoppa färgutvecklingen och registrera förfluten tid i minuter. Jäst Y190 samtransformerade med de positiva kontroll plasmider (pVA3 + pTD1) blir gul inom 60 minuter ..
OBS: Svag bete: mål interaktioner kan ta flera timmar att producera en positiv gul signal för bästa retat, använd nyligen co-transformerade kolonier, det vill säga, odlades vid 30 ° C under 4 -. 5 dagar, ~ 2 mm i diameter. - Centrifugera vid 14.000 xg under 5 min vid RT för att pelletera cellrester och överför supernatanten till en ren kyvett.
- Användning av en spektrofotometer, mät absorbansen vid 420 nm (A 420) av proverna i förhållande till de tomma (värden bör vara mellan 0,02 till 1,0).
- Beräkna β-galaktosidas-enheter, med en enhet definieras som den mängd som hydrolyserar 1 | imol av ONPG till o-nitrofenol och D-galaktos per min per cell, i enlighet med följande formel:
= β-galaktosidas-enheter
Där: t: förfluten tid för inkubation (i minuter); . cf: koncentrationsfaktorn från steg 1.4.8, det vill säga, cf = 5; OD 600: när celler skördades.
- Förbered följande buffertar:
= β-galaktosidas-enheter 2. Protein Expression i en däggdjurscellinje
- Förbered följande media och buffertar:
- Förbereda tillväxtmedium genom att blanda DMEM med 4,5 g / L glukos, 10% vol / vol fetalt bovint serum och 2 mM L-glutamin; sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid 4 ° C.
- Förbereda 2x Hepes-buffrad saltlösning (2x HBS) genom att blanda 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 12 mM glukos, 50 mM Hepes; justera pH till 7,05, sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid -20 ° C. Förbered 2,5 M CaCl 2. Sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid -20 ° C.
- En dag före transfektion, utsäde 1 - 2 x 10 6 HEK293 celler i en 100 mm petriskål för att vara 60-70% sammanflytande följande dag. Odling under 16-18 h vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2.
- På dagen för transfektion, ta bort de gamla medel och foderceller med 10 ml färskt tillväxtmedium.
NOTERA: Antibiotika är utelämnade från odlingsmediet under transfektion eftersom de kan öka celldöd.- Späd 24 | j, g av plasmid-DNA (för samtransfektioner, en lika molförhållande av de två plasmiderna) och 60 | il av 2,5 M CaCl2 i 600 | j, l total volym (gjord med sterilt avjoniserat H2O) inuti ett 1,5 ml rör; virvel att blanda.
OBS:. För högsta transfektionseffektiviteten bör plasmid-DNA vara av högsta renhet, dvs har en Abs 260 / Abs 280 ratio = ~ 1,8.- Tillsätt plasmid-DNA / kalciumlösning droppvis in i en 50 ml rör innehållande 600 | il av 2x HBS under konstant och kraftig blandning genom att vortexa. Inkubera under 20 min vid RT för att medge bildning av kalciumfosfat / plasmid-DNA-komplex.
- Efter 20 minuters inkubering, kortfattat virveln och tillsätta lösningen droppvis på cellerna för att täcka hela ytarean av 100 mm petriskål.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO
- Skörda cellerna 24 h efter transfektion genom centrifugering vid 1000 xg i 3 min vid RT och kassera supernatanten. Cellpelletar kan lagras vid -80 ° C tills de behövdes.
OBS: Expression toppar vanligen 24-72 timmar efter transfektion.- Förbered följande media och buffertar:
- Förbered följande buffertar:
- Förbereda Co-IP homogeniseringsbuffert genom att blanda 150 mM NaCl, 20 mM Tris; justera pH till 7,4 och lagra vid 4 ° C.
- Förbered Tvärbindnings homogeniseringsbuffert genom att blanda 5 mM Hepes, 0,3 M sackaros; justera pH till 7,4 och lagra vid 4 ° C (filter före användning för att avlägsna eventuella partiklar). Komplettera med proteashämmare före användning.
- Tillsätt 250 | il av glaspärlor (425 - 600 mikron) inuti ett 1,5 ml rör och tvätta med 500 ul av homogeniseringsbuffert. Pelletglaspärlor med en kort centrifugeringpuls (1000 xg under 5 sek) och avlägsna supernatanten. Upprepa detta tvättsteg en gång till.
- Resuspendera cellpelleten (från steg 2.1.8) i 500 | il iskall homogeniseringsbuffert och överföra cellsuspensionen in i glaspärlor innehållande rör.
- Homogenisera cellerna på is med 20 passager genom en fin nål (23 G, 0,6 x 30 mm) som är knutna till en 1 ml spruta. Med röret kapsylen stängd, tränga igenom igenom det med nålen och dispergera cellsuspensionen kraftigt genom glaspärlor.
- Centrifugera vid 1500 xg under 10 min vid 4 ° C för att avlägsna kärnor och obrutna celler och kasta pelleten. Spara supernatanten som representerar den post nukleära fraktionen och fortsätta direkt till co-IP eller tvärbindning som är lämpligt.
3. In vitro biokemiska metoder
- Co-immunoprecipitation
- Förbered följande buffertar:
- Förbered Co-IP homogeniseringsbuffert som beskrivs i sektion 2.2.1.1. Förbereda IP-buffert genom att blanda 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% (vikt / volym) CHAPS, 2 mM ditiotreitol (valfritt; ditiotreitol kan inkluderas för att reducera proteinaggregat som kan ha bildats på grund av luftoxidation); justera pH till 7,4 och lagra vid 4 ° C.
- Förbereda 2% vikt / volym CHAPS i sam-IP homogeniseringsbuffert; lagra vid 4 ° C.
- Framställa protein-laddningsbuffert genom att blanda 60 mM Tris, 2% vikt / volym SDS, 10% vol / vol glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% vikt / volym bromfenolblått, 2% volym / volym β-merkaptoetanol (valfritt); justera pH till 6,8 och förvara vid RT.
- Homogenisera cellerna från ett sammanflytande 100 mm petriskål (~ 8 x 10 6 celler om HEK293, räknades med användning av en hemocytometer) som beskrivs i avsnitt 2.2.
- Solubilisera den post-nukleära sub-cellulär fraktion med 0,5% CHAPS (med hjälp av 2% stock) och inkubation under ≥2 h vid 4 ° C med konstant blandning. Centrifugera vid 20.000 xg under 10 min vid 4 ° C för att pelletera olösliga material och kasta pelleten. Spara supernatanten kallas cellysatet.
OBS: Införandet av en detergent och avlägsnande av det olösliga materialet är absolut nödvändigt för att minimera icke-specifik bindning. . Mellanliggande detergenter, t.ex. CHAPS eller Triton X-100, vid en koncentration av 0,2 - 1%, är den mest använda. - Förbered två separata 1,5 ml rör och tillsätt ~ 20 ^ (beroende på IgG-bindningsförmåga) av 6 mg / ml protein-A eller protein-G-agaros (eller Sepharose) pärlor. Tvätta med 200 fil av IP-buffert.
OBS: Välj lämplig Ig-bindande harts beroende på djurart som används för att höja immunoprecipitating antikroppen. Protein-G binder ett bredare utbud av Ig subtyper jämfört med protein-A. - Återvinna pärlorna genom centrifugering vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Upprepa tvätta en gång med IP-buffert, resuspendera sedan pärlor i 200 pl IP buffert.
- Tillsätt 1 | ig (5 ng / | j, l) av immunoprecipitating antikropp eller icke-immunt IgG (tilltjäna som negativ kontroll) i två separata protein-A / G innehåller rör. Inkubera under ≥2 h vid 4 ° C med konstant blandning.
OBS: alltid behandla en negativ kontroll med användning av icke-immun IgG upp i samma djurart som immunoprecipitating antikroppen. - Återvinna pärlorna genom centrifugering vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C och försiktigt kassera supernatanten genom pipettering.
- Överföra 200 pl av cell-lysat (från steg 3.1.3) i vardera av de två rören med antikropp och protein-A / G-pärlor. Inkubera under ≥2 h vid 4 ° C med konstant blandning för att tillåta antigen-antikroppsbindning.
- Återskapa pärlor och tvätta med 200 ul IP buffert; inkubera i 10 min vid 4 ° C under blandning. Återskapa pärlor och tvätta två gånger (undvik flera tvättar som kommer att minska både den specifika och icke-specifik bindning). Noggrant kassera supernatanten genom pipettering.
- Tillsätt 30 pl av protein-laddningsbuffert för att eluera immunoprecipitated proteiner. Centrifugera vid 1500 xg under 2 minuter vid 4 ° C, kassera pärlorna och spara supernatanten innehållande den eluerade co-IP prov.
- Att kontrollera framgångsrik protein X nederbörd, ladda en liten mängd (1/10, 3 l) av co-IP provet på en SDS-PAGE-gel som skall analyseras genom immun 17 med antikropp som är specifik för protein X. Inkludera en delmängd av cellysatet att kontrollera protein X uttryck i ditt prov.
- För att testa med avseende på närvaro av samutfällda protein Y, ladda resten (10/09: e, 27 | j, l) av det sam-IP prov på en separat SDS-PAGE-gel som skall analyseras genom immunoblotting 17 med antikropp som är specifik för protein Y. inkludera en delmängd av cellysatet att kontrollera protein Y uttryck i ditt prov.
- Förbered följande buffertar:
- Kemisk tvärbindning
- Förbered följande buffertar:
- Tvärbindnings homogeniseringsbuffert som beskrivs i avsnitt 2.2.1.1.
- Förbereda 5x protein-laddningsbuffert genom att blanda 300 mM Tris, 10% vikt / volym SDS, 50% vol / vol glycerol, 25 mM EDTA, 0,05% vikt / volym bromfenolblått, 10% vol / vol β-merkaptoetanol (valfritt); justera pH till 6,8 och förvara vid RT; varm vid 50 ° C före användning.
- Homogenisera cellerna från ett sammanflytande 100 mm petriskål (~ 8 x 10 6 celler om HEK293, räknades med användning av en hemocytometer) som beskrivs i avsnitt 2.2.
OBS: Sackaros (vid 0,3 M) används för att skapa en iso-osmotisk buffert. Salt, t.ex., 120 till 150 mM NaCl eller KCl kan användas i stället, beroende på den oligomera proteinkomplex av intresse. - Centrifugera den post-nukleära sub-cellulär fraktion vid 20.000 xg under 10 min vid 4 ° C för att pelletera proteinaggregat och spara supernatanten. Ta åtta portioner av 20 pl vardera (vanligtvis ~ 20 pg protein) i separata 0,5 ml rör.
- Lägg 0,0025% v / v glutaraldehyd till alla prover och starta timern. Låt var och en av de åtta proven reagerar med glutaraldehyde vid RT i: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min.
OBS: Glutaraldehyd har två aldehydgrupper som reagerar med fria aminer. Undvik att använda pH-buffertar eller andra ämnen med primära aminogrupper eftersom de kommer att släcka glutaraldehyd reaktionen. - Stoppa glutaraldehyd reaktion vid den angivna tiden med 2% v / v hydrazin och tillsätt 5 pl 5x proteinladdningsbuffert för att denaturera proteiner.
- Fortsätt till SDS-PAGE och immunoblotting 17.
- Förbered följande buffertar:
Representative Results
I Y2H systemet, betet: är rov interaktion initialt testas genom jästtillväxt selektion i medium som saknar (tryptofan, leucin och) histidin och därefter bedöms av β-Gal enzymatisk aktivitetsanalyser (Figur 1). Jäst odlas i medium som saknar histidin har långsam tillväxthastighet som beror på styrkan av betet: proteininteraktion byten. Den β-Gal-analys utförs i jäst (odlades i medium som saknar endast tryptofan och leucin) antingen växer på fast bärare (agarplattor) eller i flytande kultur, med de senare avkastnings kvantitativa resultat. Vi har framgångsrikt använt Y2H att identifiera domän-domän interaktioner inom RyR2 samt nya proteinpartners 2-4,12,21,22. Till exempel, skärmad vi en serie överlappande konstrukt som spänner över hela längden av RyR2 peptidsekvensen för interaktion med ett N-terminalt fragment (AD4L: RyR2 resterna 1-906 smält med GAL4 AD). 3 Colony-lift filterpappers β-Gal-analyser producerade levande blåfärgad jästkolonier endast för BT4L: AD4L paret (figur 2A), vilket visade att AD4L interagerar med sig själv, nämligen BT4L konstruera (RyR2 resterna 1-906 smält med GAL4 DNA-BD). Blekblå kolonier upptäcktes för BT8: AD4L par tyder på en sekundär svagare association med den extrema C-terminaldomän (BT8), medan jäst samtransformerade med någon annan konstruktion förblev vita och därför negativt för bete: byte av proteininteraktioner. Kvantitativa resultat, erhållna genom flytande β-Gal-analyser (Figur 2B), indikerade robust BT4L: AD4L interaktion ekvivalent i styrka med det kända sambandet mellan p53-proteinet (pVA3) och SV40 stort T-antigen (pTD1), medan BT8: AD4L interaktion var väsentligt svagare (<10% jämfört med kontroll).
Vi utför rutinmässigt ut co-IP experiment (Figur 3) ffter övergående uttryck i en cellinje från däggdjur (HEK293), som en oberoende biokemisk analys för att förstärka Y2H resultaten 2-4,12-14,21-24. Att kontrollera RyR2 N-terminal själv interaktion, två separata plasmider som kodar för RyR2 resterna 1-906 taggade med antingen cMyc eller HA peptidepitop (BT4L och AD4L, respektive), samtransfekterades i HEK293-celler med användning av kalciumfosfatfällningsmetoden 3. Den post-nukleära fraktionen av homogeniserade celler solubiliserades med detergenten CHAPS, och det olösliga materialet avlägsnades genom centrifugering för att producera cellysatet. Cellysatet, behandlades med reduktionsmedlet ditiotreitol, inkuberades sedan med Ab HA och protein-A-Sepharose-pärlor för att immunoprecipitera HA-tagged AD4L. Co-IP prover eluerade med SDS-innehållande buffert, laddades på två separata SDS-PAGE-geler (1/10 och 9/10: e split) och analyserades genom immunoblotting med Ab HA och Ab cMyc, respectively. Framgångsrik direkt IP för AD4L (~ 100 kd) av Ab HA kontrollerades genom immunoblotting, men inte i den negativa kontrollen med hjälp av icke-immun kanin IgG (figur 4A). Viktigare, cMyc-taggade BT4L (~ 100 kDa) utvanns endast i Ab HA IP, och inte i den negativa kontrollen i frånvaro av immunoutfällt AD4L (Figur 4B).
Y2H och co-IP-analyser förutsatt samstämmiga uppgifter för RyR2 N-terminal själv interaktion, men de har inte informera om oligomerisering status N-terminal domän, det vill säga huruvida det utgör endast dimerer eller högre komplex. Det bör noteras att komplex dissocierar och endast de innefattande subenheter kommer att detekteras genom SDS-PAGE på grund av SDS och värme-inducerad proteindenaturering avskaffa protein-proteininteraktioner. För att övervinna detta använder vi tvärbindning (Figur 5) som är kemiskt och stabilt binder ihop befintliga protein oligomerer, vars molekylvikt kan sedan granskas av SDS-PAGE storleksseparation 2-5. Till exempel, HEK293-cellhomogenat som uttrycker cMyc-BT4L, behandlades med reduktionsmedlet ditiotreitol, bringades att reagera med glutaraldehyd och analyserades genom SDS-PAGE och immunoblotting med användning av Ab cMyc (Figur 6). Förutom monomeren (~ 100 kDa), en hög molekylmassa proteinband på ~ 400 kDa detekterades på ett tidsberoende sätt, vilket indikerar RyR2 N-terminalen tetramer bildning 3. Anmärkningsvärt tetramer var de dominerande oligomera species, med minimal dimer och trimer band observeras. För att bestämma dess skenbara molekylvikt, var BT4L oligomeren separeras genom 4-15% gradient SDS-PAGE-geler 3. Vi producerade massan / gel retardation standardkurva molekyl använder proteinstandarder med en rad 30-460 kDa, och vi beräknat oligomeren vara 358 kd 15 (n = 4). Denna uppenbara molekylmassa överensstämmer med en BT4L tetramer anordnade i ensluten cirkulärt sätt snarare än i linjär form, som väntat från arrangemanget av de fyra underenheterna inom den nativa RyR2 kanalen.
Figur 1. Y2H flödesschema. Jäst, samtransformerade med bete och mål plasmider, väljs för tillväxt i medium som saknar histidin och / eller analyseras för β-Gal enzymatisk aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Y2H föreslår RyR2 N-terminal domän Själv interaktion. (A) Schematisk skildrar (bete) rad mänskliga RyR2 överlappande protein som testades i Y2H systemet för fragment interaktion med RyR2 N-terminal AD4L (byte) konstruktion. Kvalitativa resultat som erhållits genom kolonilyft filterpapper β-Gal analyser anges i "+" multiplar eller "-" för negativ interaktion (B) Kvantitativ flytande β-Gal analyser normaliserades mot den positiva kontrollen (pVA3 kodar för GAL4 DNA-BD. fusion med p53-proteinet, pTD1 kodar för GAL4 AD fusion med SV40 stort T-antigen). Modifierad från 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Co-IP Flödesschema. Däggdjursceller, samtransfekterade med plasmider X och Y, är homogeniseras och detergent-solubiliserade för att producera cellysatet användes i sam-IP-analysen, följt av SDS-PAGE och immunoblotting.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Co-IP Indikerar RyR2 N-terminal Domain Själv interaktion i däggdjursceller. HEK293-celler samtransfekterades för transient samexpression av cMyc-taggade (BT4L) och HA-tagged (AD4L) RyR2 N-terminal domän ( resterna 1-906). AD4L immunutfälldes med Ab HA från CHAPS-solubiliserade och ditiotreitol behandlade HEK293 lysat, medan som negativ kontroll, co-IP-analyser genomfördes med icke-immun kanin IgG. Immunoprecipiterade proteinerna upphettades vid 85 ° C under 5 min och lösas på 20 mA under 3 h genom separata 6% SDS-PAGE-geler laddade med 10/01: e eller 9/10: e av IP-prover. Efter proteinöverföring vid 80 V under 2 timmar på polyvinylidene difluorid-membran, blev immunoblotting analys utfördes med användning av (1: 1000 spädning) Ab HA (A) eller Ab cMyc (B), respektive, följt av pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-mus-IgG (1: 10000 utspädning) och förbättrad detektering kemiluminescens (1 min exponering). En portion av cellysat, 1/50: e volymen bearbetas i IP prover, ingick också att fungera som molekylvikt standard. Modifierad från 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Tvärbindning flödesschemat. Däggdjursceller, transfekterade med plasmid X, homogeniseras och utsätts för reaktion med glutaraldehyd i tvärbindningsanalys, följt av SDS-PAGE och immunoblotting. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Tvärbindning Indikerar RyR2 N-terminal domän Tetramer Formation HEK293-celler transfekterades för transient uttryck av cMyc-märkt (BT4L) RyR2 N-terminal domän (rester 1 - 906).. Cellhomogenat, behandlades med reduktionsmedlet ditiotreitol, inkuberades med glutaraldehyd under de indikerade tidpunkterna. Proverna upphettades vid 85 ° C under 5 min och upplöstes genom SDS-PAGE (6% gel) vid 20 mA under 3 timmar. Efter proteinöverföring vid 80 V under 2 h på polyvinylidendifluoridmembran ades immunoblotting analys utfördes med användning av (1: 1000 spädning) Ab cMyc, följt av pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-mus-IgG (1:10000 utspädning) och förstärkt kemiluminescens detektions (1 min exponering). Monomer (M: ~ 100 kDa) och tetramer (T) former indikeras av pilarna. Modifierad från 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Bildningen av protein homooligomerer är en grundläggande biologisk process som reglerar aktiviteten av transkriptionsfaktorer, enzymer, jonkanaler och receptorer 25,26. Viktigt har protein oligomerisering även patologiska konsekvenser inklusive neurodegeneration och arytmogena hjärtsjukdom 4,27. De metoder som beskrivs i denna artikel används för att identifiera domän domän interaktioner förmedlar protein självassociation och oligomerisering. Nedan pekar vi på kritiska steg inom varje protokoll, och vi diskutera viktiga överväganden, begränsningar och felsökning.
Den Y2H Systemet kan användas först för att screena för potentiella interagerande protein partner på grund av dess relativt high throughput screening, användarvänlighet och mycket reproducerbara resultat. Y2H procedurer utförs i en mikrobiologiskt laboratorium med standard (platta eller shaker) inkubatorer och rum inneslutning anläggningar. Användning av freshly framställda kompetenta celler (steg 1.1.8) är avgörande för hög effektivitet jäst omvandling, medan för bästa resultat i β-Gal-analyser, nyligen vuxit jästkolonier (upp till 5 dagar gamla) bör användas (steg 1.2.3). System baserade på andra än GAL4 och / eller ytterligare / alternativa reportergener transkriptionsfaktorer finns, och därför bete och bytes plasmider bör matchas med lämplig Y2H stammen.
Vissa stammar bör odlas i närvaro av 3-amino-1,2,4-triazol, en kompetitiv inhibitor av HIS3-proteinet, för att släcka eventuella konstitutivt uttryck av HIS3-reportergenen 7,8. Expression av bete och mål fusionsproteiner bör kontrolleras genom immun 17. I fall bete / rov fusionsproteiner är giftiga för jäst, kan lägre tolererbara proteinnivåer åstadkommas genom kloning i olika vektorer där betes / rov expression drivs av en annan promotor. Vidare är det viktigt att se till thatt bete / byte fusionsproteiner visas inte självständig reporter genaktivitet. Autonoma reporter genaktivering kan räddas genom att modifiera konstruktionen för att ta bort den ansvariga regionen, eller genom att byta GAL4 DNA-BD och AD fusioner för de två testade proteinerna. Dessutom är transmembrandomäner bättre utelämnas från bete / rov konstruktioner, eftersom de kan orsaka felveckning eller mislocalization av fusionsproteiner i intracellulära membran fack. I själva verket är den största nackdelen med Y2H systemet att betet och målproteiner är lokaliserade i jästkärnan bort från deras fysiologiska subcellulär lokalisering och potentiellt saknar specifika posttranslationella modifieringar, vilket resulterar i falskt positiva eller falskt negativa interaktioner 6-9 .
Däggdjurs heterologa expressionssystem är bättre lämpade för studier av däggdjurs integrerade membranproteiner i form av konformation, post-translationella modifieringar och subcellulär lokalisering.En av de mest använda cell transfektion metoder är kalciumfosfatutfällning, främst på grund av den minsta utrustning och reagenser krävs 11,15. Alternativa metoder, nämligen elektroporering, liposomer, katjoniska lipider och polymerer, kan ge högre transfektionseffektivitet beroende på cellinje och konstruktion som används. I allmänhet är de primära faktorer som påverkar transfektionseffektiviteten är plasmid-DNA-kvalitet och cell hälsa / viabilitet. De bästa resultaten uppnås när plasmid-DNA av högsta renhet (260 nm / 280 nm absorbans förhållande av ~ 1,8) och aktivt delande celler används. Celler bör därför transfekteras vid ej mer än 60 - 70% sammanflytning (steg 2.1.2), eftersom förmågan att ta upp främmande DNA är relaterad till ytarean av cellen exponeras för mediet 11. Dessutom är införandet av antibiotika i odlingsmediet under transfektion (steg 2.1.3) rekommenderas inte på grund av ökad celldöd 15.
Feller kalciumfosfatutfällning särskilt noggranna förberedelser och pH-justering (till 7,05 exakt) i 2x HBS-lösning (steg 2.1.1), och korrekt bildning av plasmid DNA / kalcium / fosfatkomplex av kraftig omblandning (steg 2.1.5) är kritiska steg för högeffektiv transfektion. Typiskt proteinuttryck genom transient transfektion toppar inom 24-72 timmar.
När cellerna skördas, måste efterföljande procedurer utföras vid 4 ° C för att minimera proteasaktivitet, och tillsats av proteashämmare rekommenderas. Cell homogenisering bör följas av ett centrifugeringssteg för att avlägsna kärnor eftersom kromosomalt DNA kan öka lösningsviskositet och öka icke-specifik bindning. Således är homogenisering på mekanisk väg i en iso-osmotisk buffert föredras, vanligtvis i (0,3 M) sackaros eller (150 mM) NaCl. I allmänhet är sackaros-baserade buffertar känd för att öka proteinstabilitet och reducera potentiell icke-nativt protein aggregation, men på grund av preferential hydratisering på proteinytan, är elektrostatiska protein-proteininteraktioner gynnas. Omvänt, saltbaserade buffertar påverkar nettoladdningen av laddade grupper aminosyrasido på proteinytan, vilket har en slagsida mot flera hydrofoba baserade interaktioner 28.
Co-IP är den mest vanligtvis används biokemisk analys för att bedöma protein-proteininteraktioner i synnerhet från naturliga vävnaden. Dess huvudsakliga nackdelen är kravet på mycket specifika antikroppar validerade för användning i IP och immunoblotting 10,16,18. Sålunda är rekombinanta proteiner ofta märkta med en peptid-epitop, t ex., Influensa hemagglutinin (YPYDVPDYA) eller humant cMyc (EQKLISEEDL), för vilka med hög affinitet specifika antikroppar är kommersiellt tillgängliga. Om så önskas kan immunoprecipitating antikroppen kemiskt konjugerad på Protein-A harts för att undvika dess eluering och detektion under immunoblotting stadiet som kan skymma co-utfällda protein 16; För att uppnå detta har vi framgångsrikt använt kemiska tvärbindare 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. Det är absolut nödvändigt att en lämplig detergent ingår i IP-buffert och det olösliga materialet av homogeniserade celler avlägsnas genom centrifugering för att minimera icke-specifik bindning (steg 3.1.3). Valet och koncentrationen av rengöringsmedel är viktiga faktorer: starkare rengöringsmedel och / eller högre koncentrationer skulle avsevärt minska icke-specifik bindning men kan också upphäva X: Y proteininteraktion, medan lägre koncentrationer eller mildare rengöringsmedel kan tillåta en svag växelverkan som skall iakttas, men kan resultera i överdriven icke-specifik bindning. Mellanliggande hållfasthets detergenter är föredragna, t.ex. Triton X-100 vid 0,5 -. 1% koncentration. För att ytterligare minska icke-specifik bindning, en neutral protein (t.ex. bovint serumalbumin vid 100 | ig / ml) kan inkluderas i IP-buffert, och / eller cellysatet kan förinställas Cleared med föregående inkubering med protein-A enbart harts. Antalet tvättar bör optimeras för X: Y par testas, vanligtvis tre 10-minuterstvättar med IP-buffert (steg 3.1.9). I varje fall bör en co-IP-prov med icke-immun-IgG som den immunoprecipitating antikropp alltid behandlas parallellt för att fungera som negativ kontroll (steg 3.1.6).
Den största fördelen med kemisk tvärbindning är att den informerar om den stökiometriska sammansättningen av proteinet homo-oligomer. Glutaraldehyd är ett vanligt använt tvärbindningsmedel, eftersom det inte kräver någon specialutrustning och det genererar termiskt och kemiskt stabila tvärbindningar mellan interagerande proteiner 19,20. Föreningar med fria aminogrupper bör utelämnas från analysbuffertar (steg 3.2.1) eftersom de kommer att släcka den kemiska reaktionen. Glutaraldehyd koncentration och reaktionstiden (steg 3.2.4) bör optimeras för den oligomera proteinkomplex av intresse. Den huvudsakliga nackdelen med denna teknik, especibundsförvant när det utförs på hela cellpreparat, är den icke-specificiteten av den kemiska reaktion som skulle kunna ge artificiella proteinaggregat som saknar biologisk betydelse.
Alternativt in vivo (t ex., Fluorescensresonansenergiöverföring, bi-molekylära fluorescens eller luminescens komplemente) och in vitro-tekniker (t.ex.., Storleksuteslutande kromatografi, analytisk ultracentrifugering, isotermisk titrering kalorimetri) är tillgängliga för karakterisering av proteinsjälvassociation och bedömning av oligomerisering stökiometri 29,30. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar, och det kan vara mer lämpade för studier av ett specifikt protein, beroende på proteinrening / stabilitet och utrustning / reagens tillgänglighet. De tre kompletterande metoder som beskrivs här i detalj, nämligen Y2H, co-IP och tvärbindning, har använts i kombination för att ge övertygande bevis för RyR2 homo-oligomer bildning i isolering och i en levande cell.
Disclosures
Författarna har ingenting att förklara.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av British Heart Foundation stipendier till SZ (FS / 08/063 och FS / 15/30/31494).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PART 1 yeast two-hybrid | |||
| Plate incubator | Hereaus | B6120 | Used at 30 °C |
| Orbital shaker incubator | New Brunswick Scientific | INNOVA 4300 | Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm |
| Spectrophotometer | Perkin Elmer | Lambda Bio+ | To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay |
| Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit | Takara Clontech | K1604-1 | Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2 and yeast strain Y190 |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y0626 | To prepare minimal SD growh medium |
| Dropout supplement lacking leucine and tryptophan | Sigma-Aldrich | Y0750 | To prepare minimal SD growh medium |
| Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine | Sigma-Aldrich | Y2001 | To prepare minimal SD growh medium |
| Herring testes carrier DNA | Takara Clontech | 630440 | For yeast transformation |
| Whatman filter paper Grade 5 | Sigma-Aldrich | WHA1005070 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
| X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | B4252 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | N1127 | for use in liquid b-Gal assay |
| PART 2. Protein expression in a mammalian cell line | |||
| HEK293 cell line | ATCC | ATCC® CRL-1573™ | |
| Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) | SANYO | MCO-18AIC | To culture mammalian cells |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) | Invitrogen (ThermoFisher) | 41966 | To prepare growth medium for mammalian cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (ThermoFisher) | 10500 | To prepare growth medium for mammalian cells |
| Glass beads | Sigma-Aldrich | G8772 | To homogenise cells |
| Needle 23 G (0.6 x 30 mm) | BD Microlance | 300700 | To homogenise cells |
| Protease inhibitor cocktail (Complete) | Roche | 11873508001 | To prevent proteolysis |
| PART 3. In vitro biochemical methods | |||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) | Bio-Rad | 1658000EDU | For polyacrylamide gel electrophoresis |
| Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) | Bio-Rad | 1703940 | For electrophoretic transfer |
| Compact X-ray film processor | Xograph | X4 | For use in immunoblotting |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | For use in chemical cross-linking |
| Protein-A sepharose beads | GE Healthcare Life Sciences | 17-5280-01 | For use in co-IP assay |
| Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | For use in co-IP assay |
| Non-immune rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | For use in co-IP assay |
| Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | For use in immunoblotting |
| Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) | Covance | MMS-101P | For use in immunoblotting |
| Anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | For use in immunoblotting |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare Life Sciences | 28906836 | For use in immunoblotting |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce (ThermoFisher) | 32106 | For use in immunoblotting |
References
- Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Structural and functional interactions within ryanodine receptor. Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).
- Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels. Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).
- Zissimopoulos, S., et al. N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).
- Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors. Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).
- Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail. Biochem J. 376, 795-799 (2003).
- Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).
- Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits. Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).
- Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
- Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).
- Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. , (2003).
- Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein. FEBS letters. , (2013).
- Zissimopoulos, S., Lai, F. Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain. J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).
- Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease. Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes. Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).
- Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis. Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).
- Zissimopoulos, S., Lai, F. Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6. Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).
- Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin. J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).
- Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein. J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).
- Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart. J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).
- Ali, M. H., Imperiali, B.
- Hashimoto, K., Panchenko, A. R. Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).
- Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).
- Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. The detection and quantitation of protein oligomerization. Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).
- Kaczor, A. A., Selent, J. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).
