Summary
Vi beskriver her en enkel og hurtig papirbaserede DNA ekstraktionsmetode af HIV proviralt DNA fra helblod påvist ved kvantitativ PCR. Denne protokol kan udvides til anvendelse i detektion andre genetiske markører eller anvendelse af alternative amplifikationsmetoder.
Abstract
FINA, filtrering isolering af nukleinsyrer, er en hidtil ukendt ekstraktionsmetode, som anvender vertikal filtrering via en adskillelse membran og absorberende pude til at udtrække cellulært DNA fra helblod på mindre end 2 min. Blodprøven behandles med detergent, blandet kort og anvendes med pipette til adskillelse membran. Lysatet væger ind i blotting pad skyldes kapillarvirkning, fanger det genomiske DNA på overfladen af adskillelsen membran. Det ekstraherede DNA tilbageholdes på membranen under en simpel vask trin, hvor PCR-inhibitorer er suget ind den absorberende blotting pad. Membranen indeholdende det indesluttede DNA tilsættes derefter til PCR-reaktionen uden yderligere oprensning. Denne simple metode kræver ikke laboratorieudstyr og kan let gennemføres med billige laboratorium forsyninger. Her beskriver vi en protokol til meget følsom påvisning og kvantificering af HIV-1 proviralt DNA fra 100 pi fuldblod som en model for tidligt iFant diagnose af HIV, der kunne let tilpasses til andre genetiske mål.
Introduction
Flere rapporter har drøftet udviklingen af papirbaserede eller membran-baserede ekstraktionsmetoder til brug i point-of-care (POC) enheder 1-5 med det formål at gøre den udsøgte sensitivitet og specificitet af molekylær diagnostik til rådighed for alle. World Health Organization (WHO) seksuelt overførte sygdomme Diagnose Initiative opfandt udtrykket ASSURED (Affordable, følsom, Specifikke, Brugervenlig, Rapid og robust, Udstyr-fri og leveret til dem, der har brug for det) til at beskrive de ideelle egenskaber for en POC test 6. Af disse retningslinjer, udstyret-fri kendetegn er særligt udfordrende at opnå for molekylær diagnostik. Enhver innovation på området, vil imidlertid fremme målet om at nå dem i de fleste behov, og der er håb for kortsigtede forbedringer test ydeevne ved at tilpasse eksisterende teknologi 7.
Her beskriver vi en enkel protokol til ekstraktion af DNA fra helblodsom ikke kræver komplekse kemi eller laboratorium instrumentering. Den FINA (filtrering isolation af nukleinsyrer) prøveforberedelse metode blev oprindeligt udviklet til at udtrække leukocyt DNA fra fuldblod for at opdage HIV-1 provirus som en del af en prøve-til-svar point-of-care (POC) kvantitativ PCR (qPCR) tidlig spædbarn diagnostisk (EID) platform til brug i begrænsede ressource indstillinger 8-11. FINA ekstraktion adskiller sig fra konventionelle oprensningsmetoder, som anvender silica membraner eller siliciumoxid-belagte paramagnetiske partikler til reversibelt binde DNA i nærvær af chaotrope midler 12. I stedet FINA anvender vertikal filtrering via en separationsmembran at ekstrahere cellulært DNA fra helblod direkte. Membranen indeholdende det indesluttede DNA kan placeres direkte i et PCR-rør og enten umiddelbart anvendt i en PCR-reaktion eller lufttørret til senere amplifikation 9. Ingen chaotropiske midler, phenol, eller alkoholer anvendes i prøven udvinding, elimineringTing de omfattende vask nødvendige skridt for at fjerne potente qPCR hæmmere afledt fra udvinding proces 13,14.
FINA membran kan fange enten celler 9 eller genomisk DNA frigivet ved cellelyse 11 før prøven tilsættes til membranen. For cellen capture fuldblod tilsat direkte til membranen. Cellerne efterfølgende lyseret i membranen ved tilsætning af 10 mM NaOH. Fordelen ved denne metode er, at det indebærer kun 3 trin: 1) prøvetilsætning; 2) cellelyse / vask og 3) filterskive placering i qPCR rør. Ulempen ved denne metode er, at membranen kun kan holde et defineret antal celler direkte proportional med diameteren af membranen disk. For at nå detektionsgrænsen kræves til EID, er 100 pi helblod nødvendig for prøve input, som medfører et filter, der er for stor til at blive placeret i en qPCR rør. Lysering af blodceller med vaskemiddel, før du tilføjer prøven til samlingenmembran tilføjer et behandlingstrin, men tillader anvendelsen af et mindre filter til den samme prøve størrelse. Vi var i stand til at demonstrere høj reproducerbarhed, afsløring enkelt kopi, og kvantificering af så lidt som 10 eksemplarer af HIV-1 proviralt DNA fra 100 ul blod ved hjælp af denne test konfiguration 11.
I denne rapport beskriver vi den FINA protokol som oprindeligt blev udviklet til laboratoriebrug. Membranen / filter sandwich kendt som den FINA prøveforberedelse modul kan tilberedes i store partier og oplagret til senere brug. Når enhederne skal ekstraheres denne proces tager 2 min og kan udføres i varierende størrelse batches. QPCR kan køres straks eller filtrene indeholdende den integrerede DNA kan opbevares, indtil det er bekvemt at udføre qPCR. Denne metode er meget bekvemt for rutinemæssig analyse af prøver i både lave og høje indstillinger ressource.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Hele blodprøver anvendt i denne undersøgelse anses ikke for at være forskning med mennesket som forsøgsperson. Prøverne blev opnået for kliniske diagnostiske formål, som blev opfyldt, og den resterende del af disse prøver blev bestemt for den FINA forskning analysen. Prøverne blev kodet således, at undersøgerne ikke var i stand til let bestemme identiteten af individer.
1. Udarbejdelse af FINA Prøveforberedelse Module
- Forbered blotting pad ved at skære en 35 x 35 mm 2 af en 2,6 mm tyk 100% bomuld pad. Skær en pude per prøve.
- Forbered plast paraffin film med en bagside papir tape af et skærende stykke paraffin film (25 mm (h) med 50 mm (w)) og derefter presse et hul diameter 7.14 mm i midten af båndet ved hjælp af en hammer drevet hulning. Forbered en tape per prøve.
- Forbered en bundet glas blod separator membran (capture membran) disk ved at presse et cirkel diameter 8,35 mmved hjælp af en hammer drevet hulning. Punch én disk per prøve. Skiven har en partikel retentionsevne på 2,3 um.
- Saml FINA prøveforberedelse modul ved at placere capture disk i midten af blotting pad med pincet. Placer paraffin film tape over capture disk, således at hullet i paraffin båndet forlader midten af capture disk blotlagt.
- Sikre maksimal kontakt mellem skiven og blotting pad ved at strække paraffin båndet lidt for at dække blotting pad og trykke paraffin tape fast at holde det til blotting pad rundt om alle kanter af disken.
- Lav så mange moduler som er nødvendig for forsøget eller lager til fremtidig brug.
2. Udarbejdelse af qPCR Tube
- Der fremstilles en 5,1 mm tape disk, der vil forankre celleindfangningsanordningen membranen til den side af qPCR røret for at forhindre membranen i at blokere fluorescens detektion ved udstansning en kreds af dobbelt-coated PolyeSter diagnostisk bånd med en hammer drevet punch fra et ark af båndet. Forbered et bånd disk per prøve.
- Fjern den ene side af båndets klistermærke liner. Placer båndet i en 200 pi PCR-rør, stikning det på den ene side og mod bunden af røret. Fjern den anden mærkat liner. Røret er nu klar til at modtage tilberedte disk.
- Fremstil så mange rør som er nødvendig for forsøget eller lager til fremtidig brug.
3. udtænke Blood Specimen
Bemærk: Hvis en ægte test prøve er under udarbejdelse, fortsæt til trin 4.
- Optø 8E5-LAV celler 15 huser en enkelt kopi af de HIV-1 provirus opnået fra Virologi Kvalitetssikring Laboratory (VQA; Rush Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.).
Bemærk: De opbevares som frosne cellepellets i en koncentration på 4.000 celler / ul. Celletal blev verificeret som tidligere 9 beskrevet. - Forbered serial fortynding i frysemedium (90% kalvefosterserum, 10% dimethylsulfoxid) til koncentrationer i intervallet fra 1 til 400 celler / ul.
- Pipetter 10 pi celler fra hver af de serielle fortyndinger i et mikrocentrifugerør. Tilsæt 100 pi frisk behandlet prøve af helblod HIV-1 negativ EDTA til hvert rør for at skabe en standardkurve for 8E5-LAV kopiantal 10-4,000. Bland ved forsigtigt at knipse bunden af røret 5 gange.
4. Udfør FINA Extraction
- Lyse blodceller ved at tilføje Triton-X100) til en endelig koncentration på 1% (11 pi 10% Triton-X100 til 110 pi helblod og celler fra trin 3.3).
- Bland ved forsigtigt at knipse bunden af røret 5 gange. Blodet skal vende gennemsigtig rød.
- Pipetter alle blodprøven onto indfangning disk.
Bemærk: En vandtæt forsegling mellem paraffin tape og indfangning membran sikrer, at blodet strømmer gennem membranen, og god kontakt mellem capture membrane og blotting bremseklodsenhed sikrer hurtig prøve fugtspredende. - Tillad prøven at suge gennem filteret.
Bemærk: Blodet lysat væger ind i blotting pad grund kapillarvirkning, opfange det genomiske DNA på overfladen af indfangning disk. Lysatet har gennemblødt ind i disken, når den vises mat. - Tilføj 600-1.000 pi 10 mM NaOH dråbevis på capture disk.
Bemærk: vaskebuffer kan også tilføjes som en bulk tilsætning af 600 pi. Bufferen vil danne en dråbe på den hydrofobe paraffin tape og væge gennem hullet til disken i ca. 20 sek. Filteret skifter fra rød til hvid angiver clearance af hæmoglobin. - Adskil disken fra blotting pad med pincet og anvende disken til båndet i den forberedte PCR-rør. Hvis der er nogen rød farve efterlades på filteret tilføje 50-100 pi vaskepuffer for at fjerne filteret, før anbringelse i røret.
Bemærk: Sjældent, påført overtryk under udarbejdelsen afDen FINA moduler resulterer i opdeling af membran lag under adskillelse fra blotting pad. Kassér disse diske og forberede en frisk prøve. - Efter filtret er anbragt i PCR-rør, prøverne analysere det samme. Alternativt tørre natten over i en kasse med calciumsulfat tørremiddel, så cap og sted i en foliepose med silica tørremiddel og opbevares indtil den er klar til analyse.
5. qPCR Reaction
- Forbered 100 pi qPCR Master Mix per reaktion under anvendelse af HIV-specifikke primere og prober som tidligere 9,11 beskrevet. Omfatte en indvendig forstærkning kontrol at overvåge for tilstedeværelse af amplifikationsinhibitorer og at kontrollere, at en negativ prøve er en sand negativ. Sørg for, at filteret er helt dækket med master mix og at filteret forbliver fastgjort til siden af røret gennem hele reaktionen.
- Udføre amplifikation under anvendelse af et realtids-PCR-enhed som tidligere beskrevet 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsgangen til ekstraktion proviralt DNA fra helblod tilsat 8E5-LAV-celler er vist i figur 1. Figur 2 viser FINA prøven modulet og forberedt qPCR rør. Denne fremgangsmåde muliggør effektiv amplifikation af HIV-1 provirus fra 8E5-LAV-celler ved forskellige kopiantal, som vist i standardkurven for konstruerede prøver (figur 3). PCR havde en effektivitet på 103%, som beregnes ud fra Effektivitet = -1 + 10 (-1 / hældning). Ligning af linjen var y = -3.25x + 27,95, med en korrelation på R = 0,996. HIV provirale DNA standardkurve Den kopierer også har meget reproducerbar forstærkning, som det fremgår af tabel 1. Derudover en intern kontrol af 500 eksemplarer Hydroxypyruvate reduktase er til stede for at vise, at der ikke er PCR-hæmning som følge af udvinding blod med FINA, uafhængigt af antallet af kopier af HIV-1 provirus tilstedeværende (Figur 4). IC forstærkning blev effektivt opnået i alle 18 undersøgte prøver, med en gennemsnitlig Cq af 21,92 ± 0,25 og en CV på 1%.
Figur 1: Arbejdsgang for detektering proviralt DNA fra helblod tilsat 8E5-LAV celler til qPCR. (A) Fra venstre til højre, den forberedte FINA modul, efter blod sættes til indfangning membran og efter vaskebuffer tilsat. (B) qPCR rør med capture diske stak til dobbelt-belagt tape med qPCR Master Mix tilføjet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FINA in-house-modul og qPCR rør forberedelse. (A) En capture diameter membranskive 8,35 mm blev indlagt mellem en firkant 707 blotting pad og en tynd plade af paraffin tape indeholdende et hul 7,14 mm diameter i midten, således at hullet i paraffin båndet blev centreret om indfangning disk til den direkte anvendelse af lyseret blod med pipette. (B) En 5,1 mm dobbelt-belagt polyester diagnostisk tape sidder fast på siden af 200 pi qPCR rør. Den anden liner tape er fjernet for at eksponere klæbrig overflade til at anvende capture disk når de er klar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Standardkurve for HIV-1 proviral DNA udtænkt prøver (A) Amplification plots opnået fra 100 pi 4 replikater HIV-1 neunderbalance fuldblod tilsat 4000, 400, 40 og 10 8E5-LAV celler med 500 kopier / reaktion af de interne kontrol- optrukne linjer = forstærkning plots; Stiplede linje = tærskel. Y-aksen er fluorescensenheder og X-aksen er qPCR cyklus nummer. (B) Standardkurver af CQ-værdier beregnes ud fra amplifikationsplot mod log kopital af 8E5-LAV celler pr 100 pi helblod. Ligning af linjen: y = -3.25x + 27,95; R = 0,996; PCR effektivitet = 103,23% beregnet via Effektivitet = -1 + 10 (-1 / hældning) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Intern kontrol angiver ingen qPCR hæmning 500 eksemplarer Hydroxypyruvate reduktase Amplification kontrol plasmid tilføjet per reaktion.. Solidlinjer = forstærkning plots; Stiplede linje = tærskel. Gennemsnitlig Cq IC = 21,92 ± 0,25. CQS varierede fra 21.21 til 22,32. Variationskoefficient (CV%) = 1%; N = 18. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 8E5-LAV celler / | |||
| 100 pi WB | Ave. Cq | SD | CV (%) |
| 4.000 | 16.27 | 0,14 | 1 |
| 400 | 19,54 | 0,15 | 1 |
| 40 | 22,56 | 0,3 | 1 |
| 10 | 24,83 | 0,15 | 1 |
Tabel 1: Gennemsnitlig Cq, standardafvigelse (SD) og variationskoefficienten (CV%) af 4.000, 400, 40 og 10 kopier 8E5-LAV standardkurve med FINA ekstraktion og HIV-1-specifikke primere og prober. N = 4. WB = fuldblod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EID knyttet til hurtig adgang behandling har vist sig at reducere børnedødeligheden på grund af HIV-infektion 16. På grund af den fortsatte eksistens af maternelle antistoffer i et spædbarn blod, har hurtige hiv-antistof-test begrænset anvendelighed til bestemmelse af status af HIV-eksponerede børn. WHO anbefaler, at alle børn født af HIV-1-positive mødre bør testes ved 4-6 ugers alderen, ved hjælp af en virologisk test 17. Vi har rapporteret udvikling af et assay til påvisning og kvantificering af HIV-1 proviralt DNA i hele blodprøver, der er i stand til enkelt kopi påvisning med påvist 100% følsomhed og specificitet i et lille felt evaluering af 61 sydafrikanske spædbørn 11. Et hundrede mikroliter eller mere af fuldblod kan indsamles via finger eller hæl stick og behandles via de FINA moduler 18,19. Disse blodprøver kan da opbevares i mindst en måned før amplifikation gøre denne metode ideal til test spædbørn, der er langt fra laboratorier.
I undersøgelsen præsenteret i figur 3, en standardkurve for konstruerede prøver fra HIV-1 negativ helblod tilsat optøede celler huser HIV-1 proviral DNA er afbildet. En advarsel til denne undersøgelse er, at nogle af cellerne til prøven kunne allerede lyseret på grund af frysning / optøning, som potentielt kunne have forbedret detektionsniveauet af målet. En mere stringent eksperimentelt design ville have været at have udtænkt prøven ved hjælp af frisk dyrkede celler, som ville have mere præcist efterlignede fuldblod.
Den FINA prøve prep metode er designet til indbygning i en EID POC qPCR enhed (under udvikling) til brug i begrænsede ressource indstillinger 8; dog kan den her beskrevne manuelle format også være et nyttigt supplement til et laboratorium stikprøve prep portefølje. FINA bruger ikke binder, vaske og elueres strategi, der anvendes i dried blod pletter og andre papirbaserede udsugningsanlæg, der udvander de udtrukne nukleinsyrer, muligvis kan føre til suboptimal afsløring følsomhed 5. FINA system er meget fleksibel og let kan tilpasses til andre genetiske tests udover proviralt HIV-DNA-detektion. Lavere mængder blod eller andre biologiske prøver kan behandles for rigelige mål og større mængder for mindre rigelige dem. I vores oprindelige udførelsesform af FINA systemet, vi fange celler fra fuldblod under anvendelse af en blodsepareringsmembran og derefter lyserer dem ved tilsætning af 10 mM NaOH 9. Denne version har den fordel, en mindre bruger trin, men celleantallet volumen / blod, som kan behandles, er mindre. Foruden den bundne glas membran anvendt i denne rapport, har andre blod separation eller blodprøvetagning filterpapir været anvendt med succes med denne metode, og flere forskellige kvantitative PCR instrumenter har også vist sig at forstærke skabelon indlejret i filter skive 9. Den eneste betingelse er, at filteret ikke blokerer fluorescens aflæsning af real-time PCR instrument.
En væsentlig begrænsning af FINA ekstraktion er, at der er en størrelse begrænsning af diameteren af indfangning membran. En skive med en membran større end 9 mm, ikke kan anbringes i et 200 pi qPCR rør uden membranen overlapning i røret, som begrænser overfladeareal udsat for reaktionsblandingen. Derudover større diameter disken, bliver den mere qPCR reaktionsvolumenet nødvendig til dækning af filter, som øger omkostningerne og turn-around-tid af assayet. Hvis filteret er for lille til effektivt at indfange DNA'et i prøven, kan det tilstoppe forhindre effektiv vask.
Brug af det bundne glas capture membran, var vi i stand til at indfange kun HIV-1 proviral DNA og ikke viral RNA fra fuldblodsprøver (data ikke vist). Vi ved ikke, om alternative membraner eller puffere kan anvendes to fremme isolering af RNA i stedet for eller som supplement til DNA. Hvis læseren ønsker at kun isolere DNA fra prøven denne protokol kræver ikke enzymatisk fjernelse af RNA påkrævet med nogle protokoller. Detektere både HIV-1 RNA og DNA i kliniske prøver ville forbedre følsomheden af EID og denne mangel på RNA detektion er en begrænsning i vores diagnostisk test.
Det mest kritiske trin i tilpasning af FINA processen i et nyt assay er at validere størrelsen af filteret til at rumme den mængde DNA, dvs antallet af celler, i prøven, der skal testes. Generelt FINA ekstraktion virker bedst med prøver med et mindre antal celler, således at der kan anvendes mindre capture diske. For at bestemme bindingskapacitet af filteret, blot tilføje et andet filter disk til FINA modul stablet under indsamlingen membran. Tilføj prøven og vask membranerne som i trin 4.1-4.5. Placer hver af DNA capture diske i separate qPCR rør og amplify. Ved hjælp af en standard kurve bestemmes procenten af indført DNA indfanges på hvert filter. Størrelsen af filteret kan optimeres til behovene i assayet. For FINA provirale DNA-analysen beskrevet her, er mere end 99% af humant genomisk DNA fanget når cellelysat føjes til filteret (upublicerede observationer) gør det muligt overlegne sporingskapaciteten.
Udover EID, kan fremtidige anvendelser af FINA omfatter påvisning og kvantificering af proviral DNA som en biomarkør for HIV-1 sygdom overvågning med patienter, der har opnået viral suppression på grund af antiretroviral behandling. Behandling overvågning rettet mod udryddelse HIV kan udføres ved screening af andre indgange udover perifert blod til reservoirer for HIV-1-inficerede celler. HIV provirale testning kunne også anvendes til at screene vaccine forsøgspersoner for sand infektion. Blodprøverne er stabile under opbevaring på FINA moduler og kan indsamles under markforhold til senere forsendelse til central laboratorier for PCR-analyse gør denne metode ideel til epidemiologiske undersøgelser. Foruden HIV-1 påvisning, kan dette meget fleksibel fremgangsmåde også anvendes til at amplificere præcision medicin mål findes i biologiske prøver såsom farmakogenetik screening eller andre SNP detektering eller for hurtig genotypebestemmelse af dyremodeller. Isotermiske amplifikationsfremgangsmåder såsom helicase amplifikation (HDA) eller loop-medieret isotermisk amplifikation (LAMP) kan også anvendes med FINA ekstraheret skabelon eller DNA-embedded på filteret kunne anvendes som template for konventionel PCR-amplifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al.
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D.
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
