Summary
ここでは、定量的PCRにより検出された全血からのHIVプロウイルスDNAの簡単かつ迅速な紙ベースのDNA抽出方法を説明します。このプロトコルは、他の遺伝子マーカーを検出するか、代替的増幅方法を使用して使用するために拡張することができます。
Abstract
FINA、核酸の濾過分離は、2分未満で、全血からの細胞DNAを抽出するために分離膜と吸収パッドを介して垂直濾過を利用する新規な抽出方法です。血液検体は、洗剤混合簡単で処理し、分離膜にピペットによって適用されます。溶解物は、分離膜の表面上にゲノムDNAを捕捉する、毛細管作用ブロッティングパッドに発散します。抽出したDNAは、PCR阻害剤が吸収性ブロッティングパッドに邪悪である、簡単な洗浄工程の間に膜上に保持されています。捕捉されたDNAを含む膜は、その後、さらに精製せずにPCR反応に添加されます。この単純な方法は、実験装置を必要とせず、簡単で安価な実験用消耗品を用いて実施することができます。ここでは、早期でのモデルとして100μlの全血からのHIV-1プロウイルスDNAの高感度検出および定量するためのプロトコルを記述します容易に他の遺伝子のターゲットに適合させることができるHIVのFANT診断。
Introduction
いくつかの報告は、すべての利用可能な絶妙な感度および分子診断の特異性を作ることを目的に、ポイントオブケア（POC）機器1-5で使用するために紙-または膜ベースの抽出方法の開発について説明してきました。世界保健機関（WHO）性感染症の診断・イニシアティブは、POCの理想的な特性を記述するために（、、手ごろな価格に敏感な、具体的な、ユーザーフレンドリーな、迅速かつ堅牢な機器フリー、それを必要とする人々に配信）ASSURED用語を造語テスト6。これらのガイドラインの中で、設備のない特性は、分子診断のために達成することが特に困難です。しかし、フィールド内のすべての技術革新が最も必要としている人々に到達することを目標に進めていきます、と希望は、既存の技術7を適合させることにより、試験性能に短期的な改善のためにそこにあります。
ここでは、全血からDNAを抽出するための単純なプロトコルを記述するそれは、錯体化学や研究室の機器を必要としません。 FINA（核酸の濾過分離）試料調製方法は、当初のサンプルの回答ポイントオブケア（POC）定量的PCRの一部として、HIV-1プロウイルスを検出するために、全血からの白血球のDNAを抽出するために開発されました限られたリソースの設定8-11で使用するための（定量PCR）早期幼児診断（EID）プラットフォーム。 FINA抽出可逆カオトロピック剤12の存在下でDNAを結合するために、シリカ膜またはシリカ被覆常磁性粒子を用いる従来の精製方法とは異なります。その代わりに、FINAは、全血から直接細胞DNAを抽出するために、分離膜を介して垂直ろ過を使用しています。捕捉されたDNAを含む膜は、PCRチューブに直接配置し、いずれかのすぐ後で増幅9乾燥PCR反応または空気中で使用することができます。いいえカオトロピック剤、フェノール、またはアルコールをサンプル抽出に使用されていない、eliminaティン抽出プロセス13,14由来の強力な定量PCR阻害物質を除去するために必要な大規模な洗浄工程。
FINA膜は、試料が膜に追加される前に、細胞溶解11によって遊離細胞のいずれか9またはゲノムDNAを取り込むことができます。細胞捕獲のために、全血を膜に直接添加されます。細胞はその後10mMのNaOHを添加することにより、膜中に溶解されます。この方法の利点は、わずか3ステップ含むことである：1）サンプル添加を、定量PCRチューブ中2）細胞溶解/洗浄および3）フィルターディスクの配置。この方法の欠点は、膜が唯一の膜ディスクの直径に直接比例セルの定義された数を保持できることです。 EIDのために必要な検出限界に達するために、全血100μlを定量PCRチューブ内に配置するには大きすぎるフィルタを伴うサンプル入力のために必要とされます。コレクションに試料を添加する前に洗剤で血液細胞を溶解膜は、処理工程を追加し、同じサンプルサイズの小さいフィルタの使用を可能にします。我々は、高再現性、単一コピー検出し、この試験構成11を用いて血液100μlのからHIV-1プロウイルスDNAのわずか10コピーの定量化を実証することができました。
本稿では、もともと実験室での使用のために開発されたようFINAプロトコルを記述します。 FINAサンプル調製モジュールとして知られている膜/フィルターサンドイッチは、大きなバッチで調製し、後の使用のために備蓄することができます。試験片は、このプロセスを抽出する場合に2分間かかり、大きさのバッチを変えることで行うことができます。定量PCRは、すぐに実行することができ、または定量PCRを実行するために便利になるまで埋め込まれたDNAを含有するフィルターを格納することができます。この方法は、低および高リソースの設定の両方における試料のルーチン分析のために非常に便利です。
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Protocol
倫理声明：本研究で使用した全血試料は、ヒトを対象とする調査であるとは考えられません。標本を満足し、臨床診断目的のために得られ、これらの試料の残りの部分は、FINA研究分析に供しました。標本は、研究者は容易に個人の身元を確認することができなかったようなコード化されました。
FINAのサンプル調製モジュールの作製
- 2.6ミリメートルの厚さの綿100％パッドの35×35ミリメートル2を切断することにより、ブロッティングパッドを準備します。試料ごとに一つのパッドをカットします。
- （50ミリメートル（ワット）で25ミリメートル（H））パラフィンフィルムの切断片によって裏紙テープでプラスチックパラフィンフィルムを作製した後、ハンマー駆動穴パンチを使用してテープの中央に7.14ミリメートルの直径の穴を打ち抜きます。検体につき1テープを準備します。
- 8.35ミリメートルの直径の円を打ち抜いて結合されたガラスの血液分離膜（捕捉膜）ディスクを用意ハンマー駆動穴パンチを使用して。試料ごとに1ディスクをパンチ。ディスクは、2.3ミクロンの粒子保持能力を有します。
- ピンセットを用いてブロッティングパッドの中心に捕獲ディスクを配置することによってFINAサンプル調製モジュールを組み立てます。パラフィンテープの穴が露出キャプチャディスクの中心を残すように、捕獲ディスク上にパラフィンフィルムテープを配置します。
- ブロッティングパッドをカバーするために、わずかにパラフィンテープを延伸すると、ディスクのすべてのエッジの周りのブロッティングパッドにそれを固執するしっかりとパラフィンテープを押して、ディスクおよびブロッティングパッドとの間の最大接触を確認してください。
- 将来の使用のための実験や備蓄のために必要な数のモジュールを作成します。
定量PCRチューブの作製
- 両面polyeの円を打ち抜いて蛍光検出をブロックから膜を防止するために、定量PCRチューブの側に細胞捕捉膜を固定します5.1ミリメートルテープディスクを準備しますテープのシートからパンチを駆動ハンマーで診断テープをSTER。試料ごとに1つのテープディスクを準備します。
- テープのステッカーライナーの片側を削除してください。片面に、チューブの底に向かってそれを貼り、200μlのPCRチューブにテープを配置します。第二のステッカーライナーを取り外します。チューブは現在、準備されたディスクを受信する準備ができています。
- 将来の使用のための実験や備蓄のために必要な数のチューブを生成します。
3.工夫血液試料
注意：本物の試験片を準備している場合は、手順4に進みます。
- ウイルス学品質保証研究所から得られたHIV-1プロウイルスの単一コピーを保有解凍8E5-LAV細胞15（VQA;ラッシュプレスビテリアン/セントルークスメディカルセンター、シカゴ、IL。）。
注：これらは、/μL4,000細胞の濃度で凍結した細胞ペレットとして保存されています。以前9に記載のように細胞数を確認しました。 - SERを準備1から/μlの400細胞の範囲の濃度を培地（90％ウシ胎児血清、10％のジメチルスルホキシド）を凍結でIAL希釈。
- マイクロ遠心チューブに連続希釈液のそれぞれからピペット10μlの細胞。 8E5-LAVコピー数10-4,000の標準曲線を作成するために、各チューブに新鮮なHIV-1陰性EDTA処理した全血サンプルの100μLを加えます。優しくチューブの底を5回フリックすることにより混合します。
4. FINA抽出を行います
- 110μlの全血およびステップ3.3からの細胞）の1％（11μlの10％のTriton-X100の最終濃度までのTriton-X100）を添加することによって溶解血液細胞。
- 優しくチューブの底を5回フリックすることにより混合します。血液は半透明の赤を有効にしてください。
- ピペットキャプチャディスクへの血液検体のすべて。
注：パラフィンテープと捕捉膜との間に水密シールは、血液が膜を通って流れることを確実にし、キャプチャメートルとの間の良好な接触embraneとブロッティングパッドアセンブリは、迅速なサンプル上がりを確実にします。 - サンプルはフィルタを介してソークすることを可能にします。
注：毛細管現象によるブロッティングパッドへの血液溶解物の芯を、捕獲ディスクの表面上のゲノムDNAを捕捉します。それはマットを表示されたときに、溶解物をディスクに浸しました。 - キャプチャディスクに600-1,000μlの10 mMの水酸化ナトリウム滴下を追加します。
注意：洗浄緩衝液はまた、600μlに一括追加として追加することができます。バッファは、疎水性パラフィンテープ上の液滴を形成し、約20秒でディスクに穴を通って吸い上げます。フィルタは、ヘモグロビンのクリアランスを示す赤から白に変更されます。 - 鉗子でブロッティングパッドからディスクを分離し、準備されたPCRチューブにテープにディスクを適用します。フィルター上に残って赤い色がある場合はチューブ内に配置する前にフィルタをクリアするには、洗浄緩衝液の50から100μlを添加します。
注：まれに、過剰な圧力は、調製時に適用されますブロッティングパッドから分離する際FINAモジュールの膜層の分割での結果。これらのディスクを破棄し、新しいサンプルを準備します。 - フィルタは、PCRチューブに入れた後、すぐにサンプルを分析します。また、硫酸カルシウム乾燥剤を含むボックス内の乾燥一夜は、その後の分析のための準備ができるまで、シリカ乾燥剤とストアとホイルポーチにキャップと場所。
5.定量PCR反応
- 以前9,11記載されているように、HIV特異的プライマーおよびプローブを用いて、反応あたり100μlの定量PCRマスターミックスを調製します。増幅阻害物質の存在を監視するために内部増幅コントロールを含めると負のサンプルが真の陰性であることを確認します。フィルタは完全にマスターミックスで、フィルターが反応全体のチューブの側面に固定されたままでいることを覆われていることを確認してください。
- 以前9に記載のようにリアルタイムPCR装置を使用して増幅を行います。
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Representative Results
8E5-LAV細胞でスパイクした全血からプロウイルスDNAを抽出するためのワークフローは、図1に示されている。 図2は、FINAサンプルモジュールを示し、定量PCRチューブを調製しました。不自然な標本の標準曲線（ 図3）に示すように、この方法は、異なるコピー数で8E5-LAV細胞からのHIV-1プロウイルスの効率的な増幅を可能にします。 PCRは、効率= -1 + 10（-1 /傾き）から計算されるように、103パーセントの効率を持っていました。直線の方程式は、R²= 0.996の相関と、= -3.25x + 27.95 yのでした。 HIVプロウイルスDNAの標準曲線を表1に明らかなように、再現性の高い増幅を持っている。また、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼは数にかかわらず、FINAと血液を抽出から生じる一切PCR阻害がないことを示すために存在する500コピーの内部統制を複製します現在のHIV-1プロウイルスのコピー（図4）。 ICの増幅を効率的に21.92±0.25の平均CQと1％のCVで、試験したすべての18の試料を得ました。
図1：全血からプロウイルスDNAを検出するためのワークフローは、定量PCRに8E5-LAV細胞でスパイク 。左から右へ、準備FINAモジュールから（A）、血液を捕捉膜および洗浄緩衝液を添加した後に添加された後。定量PCRマスターミックスと両面テープに貼り付けキャプチャディスクを持つ（B）定量PCRチューブが追加されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：FINAの社内モジュールおよび定量PCRチューブの準備。 >（A）栄ピペットによって溶解された血液の直接適用のための捕獲ディスク。 （B）5.1ミリメートル両面ポリエステル診断テープが200μlの定量PCRチューブの側面に貼付されています。テープの第二のライナーは、準備ができたら、キャプチャディスクを適用するための粘着性表面を露出させる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：HIV-1プロウイルスDNA工夫標本の標準曲線 4100μlのから得られた（A）の増幅プロットは、HIV-1のneを複製します500コピー/内部統制実線=増幅プロットの反応と4000、400、40、10 8E5-LAV細胞でスパイク全血をgative。点線はしきい値を=。 Y軸は蛍光単位であり、X軸は定量PCRサイクル数です。 Cqの値の（B）標準曲線は、100μlの全血あたり8E5-LAV細胞のログコピー数に対する増幅プロットから計算しました。行の式：Y = -3.25x + 27.95; R²= 0.996; PCR効率= 103.23パーセント効率によって計算= -1 + 10（-1 /傾き） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 内部統制は、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ増幅対照プラスミドは、反応毎に添加しないのqPCR阻害 500のコピーがないことを示します。固体行=増幅プロット。点線はしきい値を=。 ICの平均はCqは21.92±0.25を=。 CQSは21.21から22.32までの範囲でした。変動係数（CV％）が1％=。 N = 18 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 8E5-LAV細胞/ | |||
| 100μlのWB | アベニューCQ | SD | 履歴書 （％） |
| 4,000 | 16.27 | 0.14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0.15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0.3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0.15 | 1 |
表1：FINA の抽出と8E5-LAVの標準曲線の4000、400、40、10コピーと、HIV-1特異的プライマーの平均Cqは、標準偏差（SD）および変動係数（CV％）とプローブ = 4. WB。N =全血。
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Discussion
迅速な治療へのアクセスに連結されたEIDは、HIV感染16による乳児死亡率を減少させることが実証されています。なぜなら乳児の血液中の母性抗体の持続性の、迅速なHIV抗体試験は、HIVに曝露された乳児の状態を決定する際に有用性が限られています。 WHOは、HIV-1陽性の母親から生まれたすべての乳児がウイルス学的検査17を使用して、4〜6週齢でテストされるべきであることをお勧めします。私たちは61南アフリカの乳幼児11の小さなフィールド評価で実証され、100％の感度と特異性を有する単一コピー検出が可能な全血検体中のHIV-1プロウイルスDNAの検出および定量のためのアッセイの開発を報告しています。全血の100マイクロリットル以上は指やかかとスティックを介して収集し、FINAモジュール18,19を介して処理することができます。これらの血液サンプルは、この方法IDEを行う増幅の前に少なくとも1ヶ月間保存することができますアルの研究室から離れている幼児をテストするため。
研究では、図3、HIV-1プロウイルスDNAが描かれている保有解凍した細胞でスパイクHIV-1陰性の全血からの不自然な標本の標準曲線に提示。この研究への警告をサンプルに添加した細胞のいくつかは既にによる潜在的標的の検出レベルを向上させている可能性が凍結/解凍に溶解している可能性があることです。より厳格な実験設計は、より正確に、全血を模倣しているだろうたての培養細胞を使用して試料を考案したとされていると思います。
FINAの試料調製方法は、限られたリソースの設定8で使用するために（開発中）EID POCのqPCR装置に組み込むために設計されました。しかし、ここで説明したマニュアルのフォーマットはまた、実験室での試料調製のポートフォリオに役立つ加えすることができます。 FINAは洗って、バインドを使用し、DRIで使用される戦略を溶出しません、抽出された核酸を希釈ED血液スポット及びその他の紙ベースの抽出システムは、おそらく準最適検出感度5に至ります。 FINAシステムは非常に柔軟であり、容易にプロウイルスHIV DNAの検出に加えて、他の遺伝子検査に適合させることができます。血液または他の生物学的標本の下のボリュームがあまり豊富なもののために豊富なターゲットと高いボリュームのために処理することができます。 FINAシステムの独自の実施形態では、血液分離膜を用いて全血から細胞を捕捉した後、10mMのNaOHで9を添加することによってそれらを溶解します。このバージョンでは、1つ少なく、ユーザのステップの利点を有するが、処理することができる細胞数/血液量が小さくなります。本報告書で使用され、結合したガラス膜に加えて、他の血液分離または血液採取濾紙は、この方法で正常に使用されており、いくつかの異なる定量的PCR機器はまた、Fに埋め込まれたテンプレートを増幅することが示されていますILTERディスク9。唯一の規定は、フィルタは、リアルタイムPCR機器の蛍光読み取りをブロックしないということです。
FINA抽出の重要な制限は、捕捉膜の直径の大きさの制約が存在することです。 9ミリメートルよりも大きい膜とディスクが反応混合物に露出面積を制限し、チューブ内膜重複せずに、200μlの定量PCRチューブに配置することはできません。また、ディスクの直径が大きいほど、より多くのqPCR反応容量は、コストを増加させ、ターンアラウンド時間アッセイをフィルターを覆うために必要とされます。フィルタを効率的に検体中のDNAを捕捉するには小さすぎる場合には、効率的な洗浄を防止する目詰まりすることができます。
結合したガラス捕捉膜を使用して、我々は、全血サンプルからのみHIV-1プロウイルスDNAはなく、ウイルスRNAを捕捉することができた（データは示さず）。代替膜またはバッファがトンを使用することができるのかどうかもわかりませんOの代わりに、またはDNAに加えて、RNAの単離を促進します。読者が唯一の標本からDNAを分離したい場合、このプロトコルは、いくつかのプロトコルで必要なRNAの酵素的除去を必要としません。 EIDの感度およびRNA検出の欠如を改善する臨床サンプル中のHIV-1 RNAとDNAの両方を検出することは、当社の診断テストの制限事項です。
新しいアッセイFINAプロセスを適応における最も重要な工程は、試験される試料中、すなわち 、DNAの量を収容する細胞の数を、フィルタのサイズを確認することです。小さいキャプチャディスクを使用することができるように一般FINA抽出では、細胞の小さい番号の標本に最適です。フィルタの結合能を決定するために、単にコレクション膜の下に積み重ねFINAモジュールに第二のフィルターディスクを追加します。サンプルを追加し、ステップ4.1から4.5のように膜を洗浄します。個別の定量PCRチューブおよびアンプにDNA捕獲ディスクのそれぞれを配置lify。標準曲線を用いて、各フィルター上に捕捉された入力DNAの割合を決定します。フィルタのサイズは、アッセイのニーズに最適化することができます。細胞溶解物をフィルター優れた検出能力を可能にする（未発表の観察）に追加されたときに、ここで説明FINAプロウイルスDNAのアッセイのために、ヒトゲノムDNAの99％以上が捕捉されます。
EIDに加えて、FINAの将来のアプリケーションが原因で抗レトロウイルス療法へのウイルス抑制を達成している患者とHIV-1疾患のモニタリングのためのバイオマーカーとしてのプロウイルスDNAの検出および定量を含むことができます。 HIVの根絶を目的とした治療の監視は、HIV-1感染細胞のリザーバのための末梢血の他に、他の入力をスクリーニングすることによって実施することができます。 HIVプロウイルス検査はまた、真の感染のワクチン試験の被験者をスクリーニングするために使用することができます。血液サンプルは、FINAモジュールの貯蔵中に安定であり、CEに後で出荷場条件下で回収することができますPCR分析のためのntral研究所が疫学的研究のために、この方法に最適です。 HIV-1の検出に加えて、この非常に柔軟な方法はまた、薬理遺伝学スクリーニングまたは他のSNP検出として、または動物モデルの迅速な遺伝子型決定のための生物学的標本に見られる精密薬標的を増幅するために使用することができます。 FINAテンプレートを抽出またはDNA組み込みフィルタでは、従来のPCR増幅のための鋳型として使用することができるとともに、そのようなヘリカーゼ依存性増幅（HDA）またはループ媒介等温増幅（LAMP）等の等温増幅方法を使用することもできます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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