Summary
Vi beskriver her en enkel og hurtig papirbaserte DNA-ekstraksjon fremgangsmåte for HIV proviralt DNA fra helblod detektert ved kvantitativ PCR. Denne protokollen kan utvides for bruk i å oppdage andre genetiske markører eller ved hjelp av alternative forsterkningsmetoder.
Abstract
FINA, filtrering isolering av nukleinsyrer, er en ny ekstraksjon fremgangsmåte som anvender vertikale filtrering via en separasjonsmembran og absorberende pute for å ekstrahere cellulært DNA fra fullblod i løpet av mindre enn 2 min. Den blodprøven behandles med vaskemiddel, kort blandet og anvendt med pipette til separasjonsmembran. Lysatet transporterer inn mot blotting puten på grunn av kapillarvirkning, fange det genomiske DNA på overflaten av separasjonsmembranen. Den ekstraherte DNA holdes tilbake på membranen i løpet av en enkel vasketrinn hvor PCR-inhibitorer er onde inn i den absorberende puten blotting. Membranen inneholdende innesluttet DNA blir deretter tilsatt til PCR-reaksjonen uten ytterligere rensing. Denne enkle metoden krever ikke laboratorieutstyr og kan enkelt implementeres med rimelige laboratoriet leverer. Her beskriver vi en protokoll for svært følsom påvisning og kvantifisering av HIV-1 proviralt DNA i 100 ul helblod som en modell for tidligFant diagnose av HIV som kan lett kan tilpasses til andre genetiske mål.
Introduction
Flere rapporter har beskrevet utviklingen av papir- eller membran-baserte ekstraksjonsmetoder for anvendelse i point-of-care (POC) anordninger 1-5 med sikte på å gjøre den utsøkte sensitivitet og spesifisitet av molekylær diagnose tilgjengelig for alle. Verdens helseorganisasjon (WHO) Seksuelt overførbare sykdommer Diagnostikk Initiative innførte begrepet FORSIKRET (rimelig, følsom, Specific, brukervennlig, rask og robust, Utstyr fritt og levert til de som trenger det) for å beskrive den ideelle egenskapene til en POC test 6. Av disse retningslinjene, er utstyret fritt karakteristisk spesielt utfordrende å oppnå for molekylær diagnostikk. Imidlertid vil alle innovasjon innen fremme målet er å nå de som er i de fleste behov, og det er håp for nær sikt forbedringer i testytelse ved å tilpasse eksisterende teknologi 7.
Her beskriver vi en enkel protokoll for å ekstrahere DNA fra fullblodsom ikke krever kompleks kjemi eller laboratorium instrumentering. FINA (filtrering isolering av nukleinsyrer) prøvepreparering fremgangsmåte ble opprinnelig utviklet for å ekstrahere leukocytt-DNA fra helblod for å påvise HIV-1 provirus som en del av en prøve-til-svar point-of-care (POC) kvantitativ PCR (qPCR) tidlig spedbarn diagnostisk (EID) plattform for bruk i begrensede ressursinnstillinger 8-11. FINA ekstraksjon skiller seg fra konvensjonelle rensemetoder som anvender silika membraner eller silika-belagte paramagnetiske partikler for å reversibelt binde DNA i nærvær av kaotropiske midler 12. I stedet bruker FINA vertikal filtrering gjennom et separasjonsmembran for å ekstrahere cellulært DNA fra helblod direkte. Membranen inneholdende innesluttet DNA kan plasseres direkte i en PCR-rør og enten umiddelbart anvendt i en PCR-reaksjon eller lufttørket for senere forsterkning 9. Det er ingen kaotropiske midler, fenol, eller alkoholer anvendes i prøven ekstraksjon, eliminating de omfattende vasketrinn for å fjerne potente qPCR hemmere avledet fra utpakkingen 13,14.
FINA Membranen kan fange enten cellene 9 eller genomisk DNA som frigjøres av 11 cellelyse før prøven ble tilsatt til membranen. For cellen fangst, blir fullblod tilsettes direkte til membranen. Cellene ble deretter lysert i membranen ved tilsetning av 10 mM NaOH. Fordelen med denne metoden er at den bare omfatter tre trinn: 1) prøvetilsetning; 2) cellelyse / vask og 3) filterskive plassering i qPCR rør. Ulempen med denne metoden er at membranen kan bare inneholde et definert antall celler direkte proporsjonale med diameteren av membranplaten. For å komme til påvisningsgrensen som er nødvendig for EID, blir 100 ul helblod som kreves for prøveinngang som medfører et filter som er for stor til å bli plassert i et rør qPCR. Lysering av blodlegemene med vaskemiddel før tilsetning av prøven til samlingenMembranen tilfører et behandlingstrinn, men tillater bruk av en mindre filter for den samme prøvestørrelse. Vi var i stand til å demonstrere høy reproduserbarhet, enkelt eksemplar deteksjon og kvantifisering av så lite som 10 kopier av HIV-1 førvirus DNA fra 100 mL av blod ved hjelp av denne testkonfigurasjon 11.
I denne rapporten beskriver vi FINA protokoll som opprinnelig ble utviklet for laboratoriebruk. Membran / filter-sandwich kjent som FINA prøvepreparering modulen kan fremstilles i store serier og stockpiled for senere bruk. Når prøvene er som skal ekstraheres denne prosessen tar 2 min, og kan utføres i varierende størrelse grupper. QPCR kan kjøres umiddelbart eller filtrene som inneholdt det innebygde DNA kan lagres inntil det er praktisk å utføre qPCR. Denne metoden er svært praktisk for rutinemessig analyse av prøver i både lave og høye ressursinnstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Den fullblodprøver som brukes i denne studien er ikke ansett for å være forskning som omfatter mennesker. Prøvene ble oppnådd for kliniske diagnostiske formål, som ble oppfylt, og den gjenværende del av disse prøvene ble levert for FINA forskning analysen. Prøvene ble kodet slik at undersøkerne ikke var i stand til lett å fastslå identiteten av individer.
1. Utarbeidelse av FINA Prøvepreparering Module
- Forbered blotting puten ved å kutte en 35 x 35 mm 2 av en 2,6 mm tykk 100% bomull pad. Skjær en pute per eksemplar.
- Fremstille plastparafinfilm med et papir backing bånd av et skjære stykke av parafin film (25 mm (h) ved 50 mm (w)) og deretter punching en hulldiameter 7,14 mm i midten av båndet ved hjelp av en hammer drevet hulle. Forbered en tape per eksemplar.
- Forbered en bundet glass blod separator membran (capture membran) disk ved å stanse en sirkel 8,35 mm diameterved hjelp av en hammer drevet hulle. Punch en disk per eksemplar. Skiven har en partikkel retensjon evnen til 2,3 um.
- Monter FINA prøveopparbeidelse modulen ved å plassere fangst disk i midten av blotting pad bruker tang. Plasser parafin film tape over fangst disken slik at hullet av parafin tape forlater midten av fangst disk utsatt.
- Sikre maksimal kontakt mellom disken og blotting puten ved å strekke parafin tape litt for å dekke blotting pad og trykke på parafin tape fast å feste den til blotting puten rundt alle kantene på disken.
- Lag så mange moduler som trengs for eksperimentet eller beredskapslager for fremtidig bruk.
2. Utarbeidelse av qPCR Tube
- Fremstille en 5,1 mm tape disk som vil forankre celle fange membranen til den side av qPCR røret for å forhindre at membranen fra blokkerer fluorescenspåvisning ved å stanse en sirkel av dobbelt-belagte Polyester diagnostisk bånd med en hammer drevet slag fra et ark av båndet. Forbered en tape disk per eksemplar.
- Fjern den ene siden av tape klistremerke liner. Plassere kassetten inn i en 200 ul PCR-rør, stikker det på den ene siden, og mot bunnen av røret. Fjern den andre klistremerke liner. Røret er nå klart til å motta forberedt disk.
- Produsere så mange rør som er nødvendig for forsøket eller beredskapslager for senere bruk.
3. pønsker Blood Specimen
Merk: Hvis en ekte test prøven er under utarbeidelse, fortsett til trinn 4.
- Tine 8E5-LAV celler 15 husing ett eksemplar av de HIV-1 provirus hentet fra Virology Quality Assurance Laboratory (VQA, Rush Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.).
Merk: De blir lagret som frosne cellepelleter ved en konsentrasjon på 4000 celler / mL. Celletall ble bekreftet som beskrevet tidligere ni. - Forbered serial fortynning i frysemedium (90% føtalt bovint serum, 10% dimetylsulfoksyd) til konsentrasjoner i området fra 1 til 400 celler / mL.
- Pipetter 10 ul celler fra hver av de serielle fortynninger inn i et mikrosentrifugerør. Tilsett 100 ul av frisk HIV-1 negativ EDTA behandlet helblodprøve til hvert rør for å skape en standardkurve av 8E5-LAV kopiantall 10-4,000. Bland forsiktig ved å smekke på bunnen av røret 5 ganger.
4. Utfør FINA Extraction
- Lyse blodceller ved å legge Triton-X100) til en sluttkonsentrasjon på 1% (11 ul 10% Triton-X100 i 110 pl fullblod og celler fra trinn 3.3).
- Bland forsiktig ved å smekke på bunnen av røret 5 ganger. Blodet skal slå gjennomskinnelig rød.
- Pipet alle blod prøven på fangst disk.
Merk: En vanntett tetning mellom parafin båndet og fangst membranen sikrer at blod strømmer gjennom membranen, og god kontakt mellom fangst membrane og blotting puteenhet sikrer rask prøve wicking. - Tillat prøven å suge gjennom filteret.
Merk: blod lysat veker inn i blotting pad på grunn av kapillær virkning, fange genomisk DNA på overflaten av fangst disk. Lysatet har flommet inn disken når det vises matt. - Legg 600-1,000 mL 10 mM NaOH dråpevis på fangst disk.
Merk: vaskebuffer kan også legges som en bulk tilførsel av 600 mikroliter. Bufferen vil danne en dråpe på den hydrofobe parafin båndet og veken gjennom hullet til disken i omtrent 20 sek. Filteret vil endre seg fra rød til hvit indikerer klarering av hemoglobin. - Skill disken fra blotting pad med pinsett og bruke disken til tape i den utarbeidede PCR rør. Hvis det er noen rød farge igjen på filteret legger 50-100 ul vaskebuffer for å fjerne filteret før de legges i røret.
Merk: Sjelden, overtrykk brukt under utarbeidelsen avFINA moduler resultater i partisjonering av membransjikt under separasjon fra blotting pad. Kast disse diskene og forberede en ny prøve. - Etter at filteret er plassert i PCR-rør, analysere prøvene med en gang. Alternativt, tørke over natten i en eske som inneholder kalsium sulfat tørkemiddel, deretter hetten og plasser i en foliepose med silica tørkemiddel og lagre inntil klar for analyse.
5. qPCR reaksjon
- Forbered 100 mL qPCR Master Mix per reaksjon ved hjelp av HIV spesifikke primere og prober som beskrevet tidligere 9,11. Omfatter en intern forsterkning kontroll for å overvåke tilstedeværelsen av forsterknings-inhibitorer og for å verifisere at en negativ prøve er en sann negativ. Være sikker på at filteret er fullstendig dekket med konsentrat-blanding og at filteret forblir festet til siden av røret gjennom hele reaksjonen.
- Utføre amplifikasjon ved anvendelse av en real-time PCR anordning som tidligere beskrevet ni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den arbeidsflyt for ekstrahering av proviralt DNA fra fullblod tilsatt 8E5-LAV-celler er vist i figur 1. Figur 2 viser FINA prøvemodul og fremstilt qPCR rør. Denne metoden gjør det mulig for effektiv amplifikasjon av HIV-1-provirus fra 8E5-LAV-celler ved forskjellige kopiantall, som vist i standardkurve for contrived prøver (figur 3). PCR hadde en effektivitet på 103%, beregnet fra Effektivitet = -1 + 10 (-1 / skråning). Ligningen for linjen var y = -3.25x + 27.95, med en korrelasjon på Ri = 0,996. HIV proviralt DNA standardkurve replikerer har også meget reproduserbar forsterkning, som dokumentert i tabell 1. I tillegg har en intern kontroll av 500 kopier Hydroxypyruvate reduktase er til stede for å vise at det ikke er noen PCR-inhibering som skyldes ekstrahere blod med FINA, uavhengig av antallet kopier av HIV-1 provirus stede (Figur 4). IC-amplifisering ble effektivt oppnådd i alle 18 prøvene som ble testet, med en gjennomsnittlig Cq av 21,92 ± 0,25 og en CV på 1%.
Figur 1: Arbeidsflyt for å påvise førvirus DNA fra fullblod tilsatt 8E5-LAV celler til qPCR. (A) Fra venstre til høyre, den preparerte FINA modulen, etter at blodet tilsettes til fangst membranen og etter vaskebuffer ble tilsatt. (B) qPCR rør med fangst disker stakk til dobbel-belagt tape med qPCR Master Mix til. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: FINA in-house-modul og qPCR tube forberedelse. (A) En 8,35 mm fange diameter membranplate ble klemt mellom en kvadratisk 707 blotting puten og et tynt ark av parafin bånd inneholdende en 7,14 mm diameter hull i midten slik at hullet i parafin båndet ble sentrert fangst disken for direkte anvendelse av lysert blod ved pipette. (B) En 5,1 mm dobbel-belagt polyester diagnostisk tape er fast på siden av 200 ul qPCR tube. Den andre liner av tapen er fjernet for å eksponere klebrig overflate for å søke opptak disk når du er klar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Standardkurve av HIV-1 proviralt DNA tilrådet prøver (A) Amplification plottene oppnådd fra 100 ul av 4 replikerer HIV-1 negative fullblod tilsatt 4000, 400, 40 og 10 8E5-LAV celler med 500 kopier / reaksjon av de interne kontroll heltrukne linjer = forsterkning tomter; Stiplet linje = terskel. Y-aksen er fluorescensenheter og X-aksen er qPCR syklus nummer. (B) Standard-kurver av CQ-verdier beregnet fra amplifikasjon plottet som funksjon av log kopiantallet av 8E5-LAV celler per 100 ul helblod. Ligningen for linjen: y = -3.25x + 27,95; Ri = 0,996; PCR effektivitet = 103,23% beregnet via Effektivitet = -1 + 10 (-1 / skråning) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Internkontroll indikerer ingen qPCR hemming 500 eksemplarer Hydroxypyruvate reduktase Amplification kontroll plasmid lagt per reaksjon.. Fastlinjer = forsterkning tomter; Stiplet linje = terskel. Gjennomsnittlig Cq av IC = 21,92 ± 0,25. Cqs varierte 21,21 til 22,32. Variasjonskoeffisient (CV%) = 1%; N = 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 8E5-LAV celler / | |||
| 100 mL WB | Ave. Cq | SD | CV (%) |
| 4000 | 16.27 | 0,14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0,15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0.3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0,15 | 1 |
Tabell 1: Gjennomsnittlig Cq, standardavvik (SD) og variasjonskoeffisienten (CV%) av 4000, 400, 40 og 10 kopier av 8E5-LAV standardkurve med FINA ekstraksjon og HIV-1 spesifikke primere og prober. N = 4. WB = helblod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EID knyttet til rask behandling tilgang har vist seg å redusere barnedødeligheten på grunn av HIV-infeksjon 16. På grunn av utholdenhet av mors antistoffer i et barns blod, har raske HIV-antistofftester begrenset nytte i å bestemme status for HIV-utsatte spedbarn. WHO anbefaler at alle barn født av HIV-1-positive mødre bør testes ved 4-6 ukers alder, ved hjelp av en virologiske test 17. Vi har rapportert utvikling av en analyse for påvisning og kvantifisering av HIV-1 førvirus DNA i fullblodprøver som er i stand til enkelt eksemplar deteksjon med påvist 100% sensitivitet og spesifisitet i en liten feltevaluering av 61 sørafrikanske spedbarn 11. Ett hundre mikroliter eller mer av fullblod kan hentes via finger eller hæl stokk og bearbeides via FINA modulene 18,19. Disse blodprøver kan deretter lagres i minst en måned før amplifikasjon gjør denne metoden ideal for testing spedbarn som er langt fra laboratorier.
I studien vist i figur 3, en standardkurve for contrived prøver fra HIV-1 negativ fullblod tilsatt tinte celler som HIV-1 proviralt DNA er avbildet. En påminnelse til denne studien er at noen av cellene tilsatt til prøven kan allerede ha lysert på grunn av fryse / tine-, som kunne ha potensielt forbedret deteksjonsnivået av målet. En strengere eksperimentell design ville ha vært å ha contrived prøven med fersk dyrkede celler som ville ha mer nøyaktig etterlignet fullblod.
FINA Prøven prep metode er designet for inkorporering i en EID POC qPCR anordning (under utvikling) for bruk i begrensede ressursinnstillinger 8; men kan den manuelle formatet som er beskrevet her også være et nyttig tillegg til laboratoriets prøve prep portefølje. FINA bruker ikke bind, vaske og elueres strategi som brukes i dried blodflekker og andre papirbaserte utvinning systemer som utvanner de utpakkede nukleinsyrer, kan muligens føre til sub-optimal følsomhet 5. FINA Systemet er meget fleksibelt og kan lett tilpasses for andre genetiske tester i tillegg til proviralt HIV-DNA gjenkjenning. Lavere volum av blod eller andre biologiske prøver kan behandles for rikelig mål og økte volumer for mindre rike funn. I vårt opprinnelige utførelse av FINA systemet fanger vi cellene fra helt blod ved hjelp av en blodseparasjonsmembran og deretter lysere dem ved tilsetning av 10 mM NaOH 9. Denne versjon har den fordel at man bruker færre trinn, men det cellenummer / blodvolumet som kan behandles er mindre. I tillegg til den bundne glassmembran som brukes i denne rapporten har andre blod separasjons- eller blodoppsamlingsfilterpapir vært brukt med hell med denne metoden, og flere forskjellige kvantitative PCR instrumenter har også blitt vist å forsterke mal innstøpt i fIlter disk ni. Den eneste betingelse er at filteret ikke blokkerer fluorescens lesing av real-time PCR instrument.
En betydelig begrensning av FINA utvinning er at det er en begrensning på størrelsen av diameteren av fangst membranen. En disk med en membran som er større enn 9 mm kan ikke plasseres i en 200 mL qPCR rør uten membranen overlapping i røret som begrenser overflateareal eksponeres til reaksjonsblandingen. Dessuten, jo større disken diameter, og mer qPCR reaksjonsvolumet nødvendig for å dekke filteret som øker kostnadene og turn-around-tiden av forsøket. Hvis filteret er for liten til effektivt å fange DNA i prøven, kan det tette hindre effektiv vasking.
Bruk av bundne glass fangst membran, vi var i stand til å fange bare HIV-1 førvirus DNA og ikke viral RNA fra fullblod (data ikke vist). Vi vet ikke om alternative membraner eller buffere kan brukes to fremme isolering av RNA i stedet for eller i tillegg til DNA. Dersom leseren ønsker å bare isolere DNA fra prøven denne protokollen krever ikke den enzymatiske fjerningen av RNA er nødvendig med noen protokoller. Detektering av både HIV-1-RNA og DNA i kliniske prøver ville forbedre følsomheten til EID og denne mangel på RNA-påvisning er en begrensning av vår diagnostisk test.
Den mest kritiske trinnet i å tilpasse FINA prosessen til en ny analyse er å validere størrelsen på filteret for å tilpasse mengden av DNA, dvs. antallet celler i prøven som skal testes. Generelt FINA ekstraksjon fungerer best med prøver med mindre antall celler, slik at mindre fangst-plater kan anvendes. For å bestemme bindingskapasiteten til filteret, er å legge en andre filterskiven til den FINA modulen stablet under samlingen membranen. Tilsett prøven og vaske membranene som i trinn 4.1-4.5. Plasser hver av de DNA-fangst disker i separate qPCR rør og amplify. Ved hjelp av en standardkurve, bestemme prosent av input DNA fanges på hvert filter. Størrelsen av filteret kan optimaliseres til behovene til analysen. For FINA førvirus DNA-analysen som beskrives her, er mer enn 99% av humant genomisk DNA fanget når cellelysat legges til filteret (upubliserte observasjoner) som muliggjør overlegen deteksjon.
I tillegg til EID, kan fremtidige anvendelser av FINA omfatter påvisning og kvantifisering av førvirus DNA som en biomarkør for HIV-1 sykdom overvåking med pasienter som har oppnådd viral undertrykkelse på grunn av antiretroviral terapi. Behandling overvåking rettet mot HIV utrydding kan bli utført ved screening av andre innganger i tillegg til perifert blod for reservoarer av HIV-1 infiserte celler. HIV førvirus testing kan også brukes til å screene vaksine forsøkspersonene for ekte infeksjon. Blodprøvene er stabile under lagring på FINA moduler og kan samles under feltforhold for senere forsendelse til central laboratorier for PCR-analyse gjør denne metoden ideell for epidemiologiske studier. I tillegg til HIV-1-deteksjon, kan dette meget fleksibel fremgangsmåte også benyttes til å forsterke presisjon medisin mål som finnes i biologiske prøver slik som Pharmacogenetics screening eller annen SNP påvisning eller for hurtig genotyping av dyremodeller. Isotermiske amplifiseringsmetoder som helikase avhengig forsterkning (HDA) eller sløyfe-mediert isoterm amplifisering (lampe) kan også brukes med FINA ekstrahert mal eller DNA-innebygd på filteret kan bli anvendt som templat for konvensjonell PCR-amplifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al.
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D.
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
