Summary
Мы опишем здесь простой и быстрый на бумажной основе метода экстракции ДНК ДНК ВИЧ провирусной из цельной крови обнаружен с помощью количественной ПЦР. Этот протокол может быть расширен для использования в обнаружении других генетических маркеров или с использованием альтернативных методов амплификации.
Abstract
FINA, изоляция фильтрация нуклеиновых кислот, представляет собой новый способ экстракции, который использует вертикальную фильтрацию для извлечения ДНК клеток из цельной крови менее чем за 2 мин через разделительную мембрану и абсорбирующей прокладки. Образец крови обрабатывают с помощью моющих средств, смешанных кратко и наносится пипеткой на разделительной мембраны. Лизат фитили в промокательной площадку из-за капиллярного действия, захватив геномную ДНК на поверхности разделительной мембраны. Извлеченный ДНК удерживается на мембране во время простой стадии промывки, где ингибиторы ПЦР нечестивы в абсорбирующий блокнот с промокательной бумагой. Мембрана, содержащая захваченный ДНК затем добавляют в реакционную смесь для ПЦР без дополнительной очистки. Этот простой метод не требует лабораторного оборудования и могут быть легко реализованы с помощью недорогих лабораторных принадлежностей. Здесь мы опишем протокол для высокочувствительного обнаружения и количественного определения ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл цельной крови в качестве модели для раннейFant диагностика ВИЧ, которые могут быть легко адаптированы к другим генетическим целям.
Introduction
В ряде докладов были обсуждены вопросы развития бумажно или мембран на основе методов извлечения для использования в пункте оказания медицинской помощи (ПСУ) устройства 1-5 с целью сделать изящную чувствительность и специфичность молекулярной диагностики доступной для всех. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) венерических болезней Инициатива Диагностика ввел термин уверил (Бюджетное, Чувствительный, конкретные, Удобный, быстрый и надежная, оборудование свободные и доставляется к тем, кто в ней нуждается), чтобы описать идеальные характеристики ВОК тест 6. Из этих руководящих принципов, оборудование свободной характеристикой является особенно сложной задачей для достижения молекулярной диагностики. Тем не менее, каждое нововведение в области будет продвигать цель достичь тех , кто больше всего нуждается, и есть надежда на ближайшую перспективу улучшения в проведении испытания путем адаптации существующих технологий 7.
Здесь мы опишем простой протокол для экстракции ДНК из цельной кровичто не требует сложной химии или лабораторного оборудования. FINA (фильтрация выделение нуклеиновых кислот) способ подготовки проб был первоначально разработан для извлечения лейкоцитарной ДНК из цельной крови с целью выявления ВИЧ-1 провируса как часть образца до ответа точки оказания медицинской помощи (ПСУ) количественной ПЦР диагностики (ВИЗ) платформа детей раннего возраста (КПЦР) для использования в условиях ограниченных ресурсов 8-11. FINA добыча отличается от традиционных способов очистки , которые используют кремнеземные мембран или парамагнитные частицы диоксида кремния , покрытые обратимо связывать ДНК в присутствии хаотропных агентов 12. Вместо этого FINA использует вертикальную фильтрацию с помощью разделительной мембраны для извлечения клеточной ДНК из цельной крови непосредственно. Мембрана , содержащая захваченный ДНК может быть помещена непосредственно в пробирку для ПЦР , и либо непосредственно использовали в реакции ПЦР или сушат на воздухе в течение последующего усиления 9. Нет хаотропные агенты, фенол, или спирты не используются при экстракции образца, eliminaтин обширные стадии промывки , необходимые для удаления мощные ингибиторы КПЦР , полученные из процесса экстракции 13,14.
Мембрана FINA может выполнять захват либо клеток 9 или геномную ДНК , освобожденные от лизиса клеток 11 до того , как образец добавляется к мембране. Для захвата клетки, цельной крови добавляют непосредственно к мембране. Клетки затем лизируют в мембране путем добавления 10 мМ NaOH. Преимущество этого метода заключается в том, что она включает в себя только 3 шага: 1) образец дополнение; 2) лизис клеток / мытья и 3) размещение фильтра диска в КПЦР трубке. Недостаток этого метода состоит в том, что мембрана может содержать только определенное количество клеток прямо пропорционально диаметру мембранного диска. Для того, чтобы достичь предела обнаружения, требуемого для EID, 100 мкл цельной крови требуется для ввода образца, который влечет за собой фильтр, который слишком велик, чтобы быть помещенной в трубку КПЦР. Лизиса клеток крови с помощью моющего средства перед добавлением образца в коллекциюмембрана добавляет стадию обработки, но позволяет использовать меньший фильтр для того же самого размера образца. Мы смогли продемонстрировать высокую воспроизводимость, одного обнаружения копирования и количественно оценить всего лишь 10 копий ВИЧ-1 провирусной ДНК из 100 мкл крови с помощью этой тестовой конфигурации 11.
В этом докладе мы опишем FINA протокол, первоначально разработанный для использования в лабораториях. Сэндвич мембрана / фильтр известен как FINA модуль подготовки пробы может быть получен в больших количествах и складированы для последующего использования. При проведении анализа проб должны быть извлечены этот процесс занимает 2 мин и может быть выполнена в различных партий размера. КПЦР может быть запущена немедленно или фильтры, содержащие внедренный ДНК могут быть сохранены до тех пор, пока удобно выполнять КПЦР. Этот метод очень удобен для рутинного анализа образцов в обоих параметрах низких и высоких ресурсов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Весь образцы крови, используемые в данном исследовании не рассматриваются как исследования с участием человека. Образцы были получены в клинических диагностических целей, которые были удовлетворены, а оставшаяся часть этих образцов была предоставлена для FINA исследований анализа. Образцы были закодированы таким образом, что следователи не смогли легко установить личность лиц.
1. Получение FINA образца модуля подготовки
- Приготовьте промокательную прокладку путем разделки 35 х 35 мм 2 из 2,6 мм толщиной 100% хлопок колодки. Отрежьте один прокладки в образце.
- Приготовьте пластмассовую парафиновой пленки с бумажной защитной ленты режущей части парафиновой пленки (25 мм (h) на 50 мм (w)) и затем пробивать отверстие диаметром 7,14 мм в центре ленты с помощью молотка приводом дырокола. Подготовьте одну ленту на образец.
- Приготовьте сепаратор мембраносвязанными стекла крови (захват мембраны) диск путем пробивки круга диаметром 8,35 ммс помощью молотка приводом дырокола. Удар один диск на образце. Диск имеет удерживающую способность частиц 2,3 мкм.
- Собирают модуль подготовки проб FINA путем размещения захвата диска в центре блоттинга колодки с помощью щипцов. Поместите парафиновой пленки ленту над диском захвата так, чтобы отверстие парафинового ленты покидает центр диска захвата открытой.
- Обеспечить максимальный контакт между диском и промокательной прокладки, слегка растягивая парафиновую пленку, чтобы покрыть промокательной площадку и нажав на парафиновую пленку твердо придерживаться ее на промокательной прокладки вокруг всех краев диска.
- Сделать столько модулей, сколько необходимо для эксперимента или штабеля для использования в будущем.
2. Получение КПЦР Tube
- Подготовьте ленточный диск 5,1 мм, что якорь мембраны захвата клеток к стороне трубки КПЦР, чтобы предотвратить мембрану от блокирования посредством флуоресцентной детекции путем пробивки круг двойной оболочкой ПолеSter диагностическую ленту с молотка приводом удар из листа ленты. Подготовьте один ленточный диск на образце.
- Удалите одну сторону наклейки лайнера ленте в. Поместите ленту в 200 мкл ПЦР-пробирку, приклеить ее на одну сторону, и в сторону нижней части трубы. Удалите вторую наклейку лайнера. Трубка теперь готова получить подготовленный диск.
- Производить столько трубок, сколько необходимо для эксперимента или штабеля для использования в будущем.
3. изловчиться образцы крови
Примечание: Если настоящий испытательный образец готовится, перейдите к шагу 4.
- Оттепель клетки 8e5-LAV 15 , несущие одну копию провируса ВИЧ-1 , полученные из лаборатории вирусологии обеспечения качества (VQA; Rush Presbyterian / St медицинский центр Луки, Чикаго, Иллинойс.).
Примечание: Они хранятся в виде замороженных гранул клеток в концентрации 4000 клеток / мкл. Количество клеток проверено , как описано выше 9. - Подготовка серМВЛ разведение в замораживании среды (90% эмбриональной бычьей сыворотки, 10% диметилсульфоксиде) в диапазоне концентраций от 1 до 400 клеток / мкл.
- Пипеткой 10 мкл клеток от каждого из серийных разведений в микроцентрифужных трубки. Добавьте 100 мкл свежей ВИЧ-1 отрицательный ЭДТА обработанной пробы цельной крови в каждую пробирку, чтобы создать стандартную кривую числа копий 8e5-LAV 10-4,000. Смешайте, аккуратно стряхивая нижней части трубы 5 раз.
4. Выполните FINA Extraction
- Клетки Лизируйте крови путем добавления Triton-X100) до конечной концентрации 1% (11 мкл 10% Тритона-X100 до 110 мкл цельной крови и клеток со стадии 3.3).
- Смешайте, аккуратно стряхивая нижней части трубы 5 раз. Кровь должна превратить полупрозрачный красный.
- Пипетируйте образца крови на диске захвата.
Примечание: водонепроницаемое уплотнение между парафином лентой и мембраной захвата гарантирует, что кровь течет через мембрану, и хороший контакт между захвата мembrane и промокательной площадку сборки обеспечивает быстрый образец затекание. - Разрешить образец, чтобы впитать через фильтр.
Примечание: лизата крови фитили Into промокательной площадку из-за капиллярного действия, захватив геномную ДНК на поверхности диска захвата. Лизат впиталась в диск, когда он появляется матовость. - Добавить 600-1000 мкл 10 мМ NaOH по каплям на диск захвата.
Примечание: Промывочный буфер также может быть добавлен в качестве сыпучего добавлением 600 мкл. Буфер будет образовывать капли на гидрофобной парафиновой ленту и фитиль через отверстие в диске примерно за 20 сек. Фильтр будет меняться от красного до белого с указанием зазора гемоглобина. - Отделить диск из промокательной прокладки с пинцетом и нанесите диск на ленту в подготовленную для ПЦР пробирку. Если есть красный цвет, оставленный на фильтре добавляют 50-100 мкл промывочного буфера, чтобы очистить фильтр перед размещением в трубке.
Примечание: Нечасто, избыточное давление, применяемое в ходе подготовкиФИНА модулей приводит к разделения мембранных слоев во время отделения от промокательной прокладки. Выбросьте эти диски и готовить свежий образец. - После того, как фильтр помещают в пробирку для ПЦР, анализируют образцы сразу. В качестве альтернативы, сухой в течение ночи в коробке, содержащей сульфат кальция осушителя, а затем колпачок и поместить в пакет из фольги с диоксидом кремния осушителя и хранят до готовности для анализа.
5. КПЦР реакции
- Подготовьте 100 мкл КПЦР мастер смеси в реакции с использованием ВИЧ - специфических праймеров и зондов , как описано выше 9,11. Включите внутренний контроль усиления для контроля за наличием ингибиторов амплификации и убедиться, что отрицательный образец является истинным отрицательным. Убедитесь, что фильтр полностью покрыт мастер-смеси и что фильтр остается фиксированной на стороне трубки в течение всей реакции.
- Выполнение амплификации с использованием ПЦР в реальном времени устройство , как было описано выше 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс для извлечения провирусной ДНК из цельной крови с добавленными 8e5-LAV клеток показано на рисунке 1. На рисунке 2 показан модуль образца FINA и подготовил КПЦР трубку. Этот метод позволяет эффективно амплификации ВИЧ-1 провируса из 8e5-LAV клеток при различных значениях числа копий, как показано на стандартной кривой надуманных образцов (рисунок 3). ПЦР была эффективность 103%, как рассчитано с КПД = -1 + 10 (-1 / наклон). Уравнение линии было у = -3.25x + 27,95, с соотношением r² = 0,996. Провирусная стандартной ДНК кривой ВИЧ размножается также имеют высокую воспроизводимую усиление, о чем свидетельствует в таблице 1. Кроме того, внутренний контроль в 500 экземпляров Hydroxypyruvate редуктазы присутствует , чтобы показать , что не существует никакого ингибирования ПЦР в результате извлечения крови с FINA, не зависит от числа копий ВИЧ-1 провируса присутствующих (Рисунок 4). ИК-амплификацию эффективно получены во всех 18 испытанных образцов, при среднем Cq из 21,92 ± 0,25 и CV 1%.
Рисунок 1: Процедура для обнаружения провирусной ДНК из цельной крови с добавленными 8e5-LAV клеток к кПЦР. (А) Слева направо, подготовленную FINA модуль, после того, как кровь добавляется к мембране захвата и после того, как промывочный буфер был добавлен. (B) КПЦР трубки с захватом дисков приклеились двойным покрытием ленты с мастер КПЦР смеси добавляют. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: FINA в доме модуль и подготовка КПЦР трубки. (А) захвата Диаметр мембранного диска 8,35 мм был зажат между квадратным 707 блоттинга колодкой и тонкий лист парафиновой ленты , содержащей отверстие диаметром 7,14 мм , диаметр в центре таким образом, что отверстие парафинового ленты была сосредоточена на захват диска для непосредственного применения лизированной крови по пипеткой. (B) 5,1 мм двойной покрытием диагностическая лента полиэфирная застревает на стороне 200 мкл КПЦР трубки. Второй вкладыш ленты удаляется подвергать липкую поверхность для нанесения захвата диска , когда будете готовы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: стандартная кривая ВИЧ-1 провирусной ДНК умудрялся образцов (A) Amplification участки , полученные из 100 мкл 4 размножается ВИЧ-1 Нефисключаемых цельной крови с добавленными с 8e5-LAV клеток 4000, 400, 40 и 10 500 копий / реакция внутреннего контроля сплошными линиями = усилительных участков; Пунктирная линия = порог. Y-ось единицы флуоресценции и X-ось КПЦР номер цикла. (B) Стандартные кривые значений Cq рассчитывается амплификации участка по сравнению с лог числа копий 8e5-LAV клеток на 100 мкл цельной крови. Уравнение линии: у = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; Эффективность ПЦР = 103,23% рассчитывали с помощью КПД = -1 + 10 (-1 / наклон) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Внутренний контроль указывает на отсутствие КПЦР ингибирования 500 копий контрольной плазмиды Hydroxypyruvate редуктазы Amplification добавлены на реакцию.. твердое тело= линии усиления участков; Пунктирная линия = порог. Средняя Cq СК = 21,92 ± 0,25. CQS колебалась от 21,21 до 22,32. Коэффициент вариации (CV%) = 1%; N = 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| 8e5-LAV клеток / | |||
| 100 мкл WB | Проспект Cq | SD | РЕЗЮМЕ (%) |
| 4000 | 16.27 | 0,14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0,15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0,3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0,15 | 1 |
Таблица 1: Средние Cq, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV%) из 4000, 400, 40 и 10 копий стандартной кривой 8e5-LAV с FINA экстракции и ВИЧ-1 специфических праймеров и зонды. N = 4. WB = цельной крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ВИЗ связан с быстрым доступом к лечению было продемонстрировано для снижения детской смертности из - за ВИЧ - инфекции 16. Из-за сохранения материнских антител в крови младенца, экспресс-тесты на ВИЧ антитела имеют ограниченную полезность в определении статуса ВИЧ младенцев. ВОЗ рекомендует , чтобы все дети , рожденные от ВИЧ-1 - инфицированных матерей должны быть испытаны в возрасте 4-6 недель, используя вирусологический тест 17. Мы сообщили о разработке анализе для обнаружения и количественного определения ВИЧ-1 провирусной ДНК в цельной крови , который способен одной копии обнаружения с продемонстрированной чувствительностью 100% и специфичность в небольшой полевой оценки 61 южноафриканских младенцев 11. Сто микролитров или более цельной крови может быть собрана с помощью пальца или пятки палку и обработаны с помощью ФИНА модулей 18,19. Эти образцы крови могут храниться в течение по крайней мере за один месяц до усиления делает этот метод язьаль для тестирования детей, которые далеки от лабораторий.
В исследовании , представленном на рисунке 3, со стандартной кривой надуманных образцов от ВИЧ-1 отрицательных цельной крови подсыпали оттаивают клетки , несущие ВИЧ-1 провируса изображен. Предостережение для этого исследования состоит в том, что некоторые из клеток, добавленных к пробе может уже лизируют из-за замораживания / оттаивания, которое могло бы потенциально улучшить уровень обнаружения цели. Более строгие экспериментальные разработки было бы ухитрились образец с использованием свежих культивируемых клеток, которые бы более точно имитировали цельной крови.
Метод приготовления проб FINA был разработан для встраивания в устройство ВИЗ СПЭ КПЦР ( в стадии разработки) для использования в условиях ограниченных ресурсов 8; Тем не менее, руководство формат, описанный здесь также может быть полезным дополнением к образца приготовительный портфеля лаборатории. FINA не использует привязку, помыть и элюции стратегию, используемую в сушкоред пятна крови и других бумажных систем добычи , которые разбавляет распакованные нуклеиновых кислот, что может привести к неоптимальным чувствительности 5 обнаружения. FINA система является очень гибким и может быть легко адаптирован для других генетических тестов помимо выявления ДНК ВИЧ провирусной. Снижение объемов крови или других биологических образцов могут быть обработаны для целей обильными и более высоких объемах менее обильными из них. В нашем первоначальном варианте системы FINA, мы фиксируем клетки из цельной крови с использованием мембраны разделения крови и затем лизируют их добавлением 10 мМ NaOH 9. Этот вариант имеет то преимущество, что один меньше шагов пользователей, а число клеток объем / крови, который может быть обработан меньше. В дополнение к связанному стеклянной мембраны, используемой в настоящем докладе, другие разделения крови или сбора крови фильтровальной бумаги были успешно использованы с этим методом, и несколько различных инструментов количественной ПЦР, также было показано, чтобы усилить шаблон внедренный в FМСДЭНИ диск 9. Единственным условием является то, что фильтр не блокирует чтение флуоресценции ПЦР в реальном времени инструмента.
Существенным недостатком экстракции FINA является то, что существует ограничение размера от диаметра мембраны захвата. Диск с мембраной, более чем на 9 мм, не может быть помещен в 200 мкл КПЦР трубки без мембранного перекрытия в трубе, которая ограничивает площадь поверхности, обнаженную к реакционной смеси. Кроме того, чем больше диаметр диска, тем больше КПЦР объем реакционной смеси требуется для покрытия фильтр, что повышает стоимость и оборачиваемости времени анализа. Если фильтр слишком мал, чтобы эффективно захватывать ДНК в образце, он может засорить предотвращая избыточную мойку.
Использование связанного мембраны захвата стекла, мы смогли захватить только ВИЧ-1 провирусной ДНК и не вирусную РНК из образцов цельной крови (данные не показаны). Мы не знаем, если альтернативные мембраны или буферы могут быть использованы то способствуют изоляции РНК вместо или в дополнение к ДНК. Если читатель хотел бы только выделить ДНК из образца этот протокол не требует удаления ферментную РНК, необходимой с некоторыми протоколами. Обнаружение как ВИЧ-1 РНК и ДНК в клинических образцах позволит повысить чувствительность Ид и это отсутствие обнаружения РНК является ограничением нашего диагностического теста.
Наиболее важным шагом в процессе адаптации процесса FINA к новому анализа является обоснование размера фильтра , чтобы приспособить количество ДНК, то есть число клеток, в тестируемой пробе. В общем FINA экстракции лучше всего работает с образцами с меньшим числом клеток, таким образом, что могут быть использованы меньшие диски захвата. Для определения связывающей способности фильтра, просто добавить второй фильтрующий диск к FINA модуль сложенных под мембраной сбора. Добавить образец и промыть мембраны, как на этапах 4.1-4.5. Поместите каждый из дисков захвата ДНК на отдельные КПЦР трубки и усилителявыделяющие. С помощью стандартной кривой, определяют процент ввода ДНК захваченной на каждом фильтре. Размер фильтра может быть оптимизирована для нужд анализа. Для анализа FINA провирусной ДНК, описанной здесь, более чем на 99% из геномной ДНК человека захватывается, когда клеточный лизат добавляется к фильтру (неопубликованные данные), позволяющие превосходные возможности обнаружения.
В дополнение к Эйд, будущие заявления FINA могут включать обнаружение и количественное определение провирусной ДНК в качестве биомаркеров для мониторинга заболеваний ВИЧ-1 с пациентами, которые достигли снижения вирусной нагрузки благодаря антиретровирусной терапии. Мониторинг лечения, направленных на борьбу с ВИЧ может быть выполнена путем скрининга других входов, кроме как периферической крови для резервуаров ВИЧ-1 инфицированных клеток. тестирование провирусная ВИЧ также может быть использован для скрининга испытания вакцины темы для истинной инфекции. Образцы крови стабильны при хранении на FINA модулей и могут быть собраны в полевых условиях для последующего отправки в CEntral лаборатории для ПЦР-анализа делает этот метод идеально подходит для эпидемиологических исследований. В дополнение к обнаружению ВИЧ-1, это очень гибкий метод также может быть использован для амплификации целевых показателей точности медицины, найденные в биологических образцах, таких как фармакогенетике скрининга или другого обнаружения SNP или для быстрого генотипирования животных моделей. Изотермические способы амплификации, такие как геликазной зависимой амплификации (HDA) или петлевой опосредованную изотермической амплификации (LAMP), также могут быть использованы с FINA извлеченный шаблон или ДНК-внедренный на фильтре может быть использован в качестве матрицы для обычной ПЦР-амплификации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al.
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D.
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
