يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دراسة دور السنخية الضامة في سرطان الثدي ورم خبيث

9.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54306

⸱

يونيو 26, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Science Center, 2Merck Research Labs, 3Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا نصف النموذج والنهج لدراسة وظائف البلاعم السنخية الرئوية في ورم خبيث سرطاني. لإثبات دور هذه الخلايا في ورم خبيث ، تم استخدام النموذج المتزاوي (4T1) لسرطان الثدي بالتزامن مع استنفاد البلاعم السنخية مع الجسيمات الشحمية كلودرونات

الملخص

تصف هذه الورقة تطبيق النموذج الزاوي لسرطان الثدي (4T1) على الدراسات حول دور البلاعم السنخية الرئوية في ورم خبيث للسرطان. تستخدم خلايا 4T1 التي تعبر عن GFP بالاشتراك مع التصوير والفحص المجهري متحد البؤر لمراقبة نمو الورم ، وتتبع الخلايا السرطانية المنتشرة ، وتحديد العبء النقيلي. يتم استكمال هذه الأساليب بعلم الأنسجة المرضي الرقمي الذي يسمح بالقياس الكمي الآلي وغير المتحيز للنقائل. في هذه الطريقة ، يتم مسح أقسام الرئة النسيجية المعدة بشكل روتيني ، والتي يتم تلطيخها بالهيماتوكسيلين واليوزين ، وتحويلها إلى شرائح رقمية يتم تحليلها بعد ذلك بواسطة برنامج التعرف على الأنماط المدرب ذاتيا. بالإضافة إلى ذلك ، نصف مناهج قياس التدفق الخلوي باستخدام علامات سطح خلية متعددة لتحديد البلاعم السنخية في الرئتين. لتحديد تأثير البلاعم السنخية على النقائل والمناعة المضادة للأورام ، يتم استنفاد هذه الخلايا باستخدام الجسيمات الشحمية المحتوية على الكلودرونات التي يتم إعطاؤها عن طريق الأنف للفئران الحاملة للورم. يؤدي هذا النهج إلى استنفاد محدد وفعال لهذه الخلايا على النحو الذي يؤكده قياس التدفق الخلوي. يتم تقييم أحجام الورم والنقائل الرئوية في الفئران المستنفدة من البلاعم السنخية ، لتحديد دور هذه الخلايا في التقدم النقيلي لسرطان الثدي.

المقدمة

يعد مكانة ما قبل النقائل عملية مهمة في ورم خبيث للسرطان تعرف على أنها مجموعة من التعديلات التي تحدث في الأعضاء التي تكون أهدافا للنقائل قبل وصول الخلايا السرطانية1،2. لذلك ، فإن الاستهداف العلاجي لهذه الخطوة من تطور السرطان قد يمنع النقائل إلى الأعضاء الحيوية التي تسبب ما يقرب من 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان. على الرغم من أن مفهوم مكانة ما قبل النقائل ، المعروف أيضا باسم نظرية "البذور والتربة" ، قد تم تقديمه منذ أكثر من قرن من الزمان ، إلا أنه لم يتم تقديم دليل تجريبي حتى وقت قريب ، عندما ثبت أن الخلايا المشتقة من نخاع العظام تساهم في التربة قبل النقائل1،3-7. على الرغم من هذه التطورات ، لا يزال مكانة ما قبل النقائل جانبا غير مدروس إلى حد كبير من الفيزيولوجيا المرضية للسرطان ، وهناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد اللاعبين الخلويين والآليات المعنية.

هنا نبلغ عن الأساليب في الجسم الحي لدراسة دور البلاعم السنخية في نقائل سرطان الثدي ومكانة الرئة قبل النقيلية. تصل البلاعم السنخية إلى الرئتين في وقت مبكر أثناء التطور الجنيني وتجدد ذاتيا هناك خلال مرحلة البلوغ8. لديهم أيضا وظائف مناعية مهمة ومتجانسة بما في ذلك حماية هذا العضو من الاستجابات الالتهابية غير المرغوب فيها للمستضدات البيئية غير الضارة9. لذلك ، نفترض أن الأورام تستغل هذا الكبت المناعي الفسيولوجي ، الذي تفرضه البلاعم السنخية ، وبالتالي ، تساهم البلاعم السنخية في مكانة الرئة قبل النقائل عن طريق قمع المناعة المضادة للأورام. هذه الفرضية مدعومة بتقريرنا الأخير الذي يوضح أن الاستنفاد المحدد لهذه الخلايا يقلل من نقائل الرئة ويعزز استجابات الخلايا التائية المضادةللأورام 10.

بالنسبة لهذه الدراسات ، نطبق نموذجا متزامنا راسخا لسرطان الثدي (4T1) ، والذي يحاكي المرحلة الرابعة من سرطان الثدي النقيلي11 ؛ وقد تم الإبلاغ عنه سابقا في دراسات المكانة قبلالنقيلية 6. لتتبع الخلايا السرطانية المنتشرة في الجسم الحي ، نستخدم خلايا 4T1 التي تعبر عن GFP (4T1-GFP) جنبا إلى جنب مع التصوير الحيواني والفحص المجهري متحد البؤر. نحن نركز على مكانة ما قبل النقائل في الرئة ، لأن هذا العضو هو أحد أكثر الأهداف شيوعا للنقائل الدموية للأورام الخبيثة البشرية12. للتحقيق في وظائف الضامة السنخية في مكانة ما قبل النقائل ، نستخدم الجسيمات الشحمية كلودرونات لاستنفاد هذهالخلايا 13. وتقييم تأثير هذا النضوب على نقائل الرئة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة تستنفد على وجه التحديد الضامة السنخية ولكن لا توجد خلايا بلعمية أخرى في الرئتين أو في الدورةالدموية 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من مركز تكساس للتكنولوجيا جامعة العلوم الصحية وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" نشرت من قبل المعاهد الوطنية للصحة. استخدام ثمانية إلى اثني عشر الاسبوع القديمة الإناث الفئران BALB / ج المتوفرة تجاريا. حقن 1 × 10 5 4T1 أو 1 × 10 5 4T1 الخلايا معربا عن GFP، والتي يمكن شراؤها من مختلف البائعين، في لوحة الدهون الثديية.

1. ثقافة 4T1 و4T1-GFP الخلايا وإعداد ورم تعليق خلية لحقن 14

  1. 4T1 و4T1-GFP خلية ثقافة
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ما لم ينص على خلاف ذلك.
    1. الحفاظ على 4T1 و4T1-GFP الخلايا في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100 U / البنسلين ملG و 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتوميسين.
      ملاحظة: تحديد عدد مرور عن طريق عد كل trypsinization والطلاء من الخلايا. من المهم أن استخدام الخلايا التي تحتوي على نفس العدد بمرور جميع التجارب الماوس، وعدد من الممرات يؤثر tumorigenicity الخلايا وإمكانية النقيلي.
    2. قبل حقن الخلايا إزالة T75 سم 2 قارورة تحتوي على الخلايا السرطانية بنسبة 80٪ confluency، من وسيلة الحاضنة ونضح. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وتدوير القارورة بلطف لتغسل ما تبقى متوسطة، ثم نضح برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين مع EDTA إلى القارورة والميل إلى توزيع حل موحد على السطح واحتضان في حاضنة مرطب لمدة 3 دقائق في 37 مئوية مع 5٪ CO 2.
    4. اضغط على قارورة لتسهيل مفرزة من الخلايا وإضافة 8 مل من المتوسط ​​الطازجة. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل والحصول على تعليق خلية واحدة.
    5. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. في 500 x ج في RT.نضح طاف وغسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
    6. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل والحصول على تعليق خلية واحدة. أخذ 100 ميكرولتر من تعليق خلية وعدد الخلايا باستخدام محلل بقاء الخلية حسب تعليمات الشركة الصانعة.
    7. حساب عدد الخلايا المطلوبة لجميع الحقن باستخدام صيغة: 10 5 خلايا لكل الماوس س # الفئران المستخدمة في تجربة (دائما إعداد الخلايا الإضافية لتكون على الجانب الآمن).
    8. خلايا الطرد المركزي كما هو الحال في 1.1.5. إزالة طاف من خلال الطموح و resuspend الخلايا في كمية من برنامج تلفزيوني جديد المطلوبة للحصول على تركيز خلية النهائي من 1 × 10 6 خلية / مل. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى جاهزة للحقن.
  2. 4T1 أو 4T1-GFP خلية إجراءات حقن الفأر
    1. قبل يوم واحد حقن الخلايا السرطانية، تخدير الفئران في غرفة الاستقراء مع 3٪ الأيزوفلورين. مرة واحدة الفئران هي نائمة وتتنفس بانتظام، مكان رانه الماوس على وسادة الجراحية مع الأنف داخل مخروط الأنف، وذلك لربط المرذاذ الأيزوفلورين. الحفاظ على التخدير مع 2.5٪ الأيزوفلورين. قرصة اصبع القدم الماوس للتأكد من أن الفأر هو تخدير.
    2. تطبيق كريم إزالة الشعر باستخدام قطعة من القطن لموقع الحقن (الحق الصدرية الثدي وسادة دهنية) والانتظار لمدة 2 دقيقة. تنظيف الموقع باستخدام منشفة ورقية مبللة، ضع الماوس مرة أخرى في قفص ومراقبة حيوان حتى يستعيد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
    3. في يوم من الحقن، وتخدير الفئران كما هو الحال في 1.2.2 ووضع على لوحة العمليات الجراحية.
    4. دوامة أنبوب يحتوي على الخلايا السرطانية للحصول على تعليق خلية موحد. نضح 100 ميكرولتر من تعليق خلية، التي تحتوي على 1 × 10 5 الخلايا السرطانية، إلى حقنة الأنسولين 0.5 مل (29 G، 12.7 ملم طول إبرة).
    5. رفع الجلد باستخدام مؤشر الإبهام والإصبع بالقرب من الثانية 2 و 3 الثالثة الحلمة، إدراج إبرة الحقنة في معمر الذي كان ينتظرذ منصة الدهون أسفل الحلمة الثالثة تحت الجلد بين الأصابع وحقن الخلايا ببطء لتشكيل فقاعة (حقن تحت الجلد).
    6. ضع الماوس مرة أخرى في قفص بعد الحقن ومراقبة كما هو الحال في 1.2.2.
  3. نمو الأورام المراقبة
    1. القياسات الفرجار 14
      ملاحظة: المصبوبة 4T1 أو 4T1-GFP الخلايا تشكل العدوانية ورم الثدي. وعادة ما تظهر الأورام واضح ~ في يوم 4-5 بعد التلقيح الخلية. خلايا 4T1-GFP تشكل الأورام التي تنمو أبطأ وإعطاء الانبثاث في وقت لاحق. قياس الورم مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع. إذا الحالة السريرية للحيوانات تدهور والحيوانات تفقد أكثر من 10٪ من وزن الجسم، والأورام تتجاوز 10٪ من وزن الجسم، أو أن تصبح متقرحة، الموت ببطء الفئران على الفور.
      1. تخدير الفأر كما هو الحال في 1.2.1.، وزن، وضعها على لوحة الجراحية والرطب المنطقة مع 70٪ من الإيثانول.
      2. جس الورم في موقع الحقن (4 - 5 أيام بعد التلقيح الخلية).
        3. <لى> قياس أكبر قطر (D) وأصغر قطره (D1) مع الفرجار.
      3. حساب حجم الورم باستخدام الصيغة حجم = (DX D1 X D1) / 2 مم 3. رصد الانتعاش الماوس من التخدير كما هو الحال في 1.2.2.
    2. التصوير (فقط لل4T1 الخلايا GFP)
      1. تخدير الماوس كما هو الحال في 1.2.1. ضع الماوس على مرحلة المنقولة داخل الصك التصوير. الحفاظ على التخدير من خلال مخروط الأنف.
      2. تشغيل أداة التصوير ومصدر الضوء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. تحت عنوان "شراء" علامة التبويب انتقل إلى "الإضاءة" والتحول إلى موقف فارغة (لا يوجد فلتر) للضوء الأبيض. تأكد من أن المحرك الضوء على واختر "ترانس" في جدول خفيف.
      4. تحت علامة التبويب "مجهر"، حدد "مسح" تصفية الانبعاثات و0.5X التكبير. في علامة التبويب "الكاميرا"، تأكد من أن binning لالتقاط هو "1 × 1" والمعاينة "4 × 4".
      5. انقر على معاينة لتحديد موقع الورم في الضوء الأبيض، والتركيز للحصول على صورة واضحة، وانقر القبض عليه.
      6. انتقل إلى "شراء" علامة التبويب وتغيير الإضاءة لتصفية 1 (تصفية GFP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). في علامة التبويب "مجهر"، تغيير فلتر الانبعاثات إلى "GF 530/20". معاينة والتقاط الصور في قناة الخضراء. ضبط وقت التعرض للحصول على سطوع مناسبة.
      7. تطبيق pseudocolor إلى الصورة وحفظها في المجلد المناسب (الشكل 1).

2. إدارة الطريق الأنفي من الليبوزومات 10

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. في يوم 6 بعد حقن الخلايا السرطانية تخدير الفئران كما هو الحال في 1.2.1.
  2. دوامة clodronate أو التحكم (PBS) الحويصلية تعليق تم الحصول عليها من الشركة المصنعة. يستغرق 60 ميكرولتر الحويصلية الصورةuspension باستخدام معقم طرف ماصة.
  3. ببطء الافراج عن حل الحويصلية (5 ميكرولتر في كل مرة) بالقرب من الخياشيم مما يسمح الماوس للتنفس في الحل، كرر حتى يدار جرعة كاملة من 60 ميكرولتر.
  4. دع الماوس يستعيد وعيه قبل وضعه مرة أخرى في قفص.
  5. إدارة الحويصلية كرر وضحى كل 3 أيام حتى الفئران. لا إدارة الجسيمات الشحمية في يوم النحر.

3. التضحية ماوس ومجموعة الأنسجة

ملاحظة: استخدام تعقيمها وأدوات معقمة للتشريح الفأر. الموت ببطء الفئران وتحت التخدير عن طريق استنزاف وإزالة الأعضاء الحيوية.

  1. في يوم 22 (ل4T1 الخلايا) أو يوم 26 (للخلايا 4T1-GFP) بعد حقن الخلايا السرطانية تخدير الماوس كما هو الحال في 1.2.1. ووضع على لوحة الجراحية مع مخروط الأنف متصلة المرذاذ، والحفاظ على التخدير كما هو الحال في 1.2.1. قرصة واحدة من أصابع القدم للتأكد من أن م[أوس] فاقد الوعي.
  2. دبوس أصابع باستخدام الإبر إلى لوحة تشريح. رذاذ الايثانول على الجلد الماوس.
  3. رفع الجلد باستخدام ملقط وجعل شق مع مقص جراحي. ببطء فضح الصفاق ومواصلة قطع الجلد من خلال القفص الصدري حتى الرقبة.
  4. باستخدام مقص جراحي إجراء شق في الغشاء البريتوني وفضح بعناية الأجهزة مع نصائح القطن تجنب الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية.
  5. نقل الأجهزة إلى جانب واحد وفضح الوريد الأجوف السفلي. ثقب الوريد وجمع الدم مع حقنة الانسولين 29 G. وضع الدم التي تم جمعها في أنبوب وترك على الجليد لمزيد من المعالجة.
  6. قطع الحجاب الحاجز لفضح القفص الصدري والرئتين والقلب. خفض ببطء القفص الصدري على كلا الجانبين باستخدام قطع العظام ورفع الجزء العلوي من القفص الصدري. الاستيلاء على القلب مع ملقط وقطع النسيج الضام الذي يربط بين القلب والرئتين إلى تجويف الصدر.
  7. وضع الرئتين في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني في 60 ملمطبق بتري على الجليد حتى جاهزة للتصوير ومزيد من المعالجة لأقسام المجمدة للفحص المجهري مناعي أو الأنسجة الروتينية [بما في ذلك الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ].

4. الانبثاث تقييم الرئة

  1. عد وتسجيل النقاط الانبثاث السطحية
    1. وضع طبق بتري مع الرئتين تحت المجهر تشريح. التركيز على الحصول على رؤية واضحة للسطح الرئة.
    2. باستخدام مجهر تشريح مراقبة سطح الرئة. عدد الانبثاث على الأمامي والخلفي الجانبين من كلا الرئتين.
      ملاحظة: إن رئة طبيعية مبيضة أو وردي والتي يسهل اختراقها ولها اسفنجة مثل هيكل. الانبثاث 4T1 صلبة وغير مسامية، يبدو في بعض الأحيان أن تكون مماثلة لقطرة من السائل (الشكل 2A).
  2. تصوير الرئة
    1. وضع طبق بتري مع الرئتين على المسرح المنقولة داخل الصك التصوير.
    2. بدوره على الصك وبيولايت مصدر متعدد الأطياف. فتح البرنامج. تحت علامة التبويب "الاستحواذ"، انتقل إلى "الإضاءة"، والتحول إلى موقف فارغة (لا يوجد فلتر) للضوء الأبيض. محرك خفيف -> ON، الجدول ضوء -> برنامج التحصين الموسع. تحت "مجهر" التبويب اختر 'مسح' تصفية الانبعاثات و1.66X التكبير. في علامة التبويب "الكاميرا"، تأكد من أن binning لالتقاط هو "1 × 1" والمعاينة "4 × 4".
    3. انقر على معاينة والتركيز للحصول على صورة واضحة من الرئتين في الضوء الأبيض وانقر القبض عليه.
    4. انتقل إلى "شراء" علامة التبويب والتغيير إلى تصفية 1 (تصفية GFP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). في علامة التبويب "مجهر"، تغيير فلتر الانبعاثات إلى "GF 530/20". معاينة والتقاط الصور في قناة الخضراء. ضبط وقت التعرض للحصول على سطوع مناسبة.
    5. تطبيق pseudocolor إلى الصورة وحفظها في المجلد المناسب.
    6. الوجه الرئتين للحصول على صورة من الجانب الآخر بنفس الطريقة. هذا بروكedure يولد صورا لالانبثاث-GFP الإيجابي الذي يمكن زيادة كميا باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 2B) 14.
  3. مناعي المجهر
    1. إصلاح الرئتين في 4٪ امتصاص العرق، في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في الظلام.
    2. يغسل النسيج مرتين مع 10 مل برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لإزالة تثبيتي. نقل إلى 18٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
    3. إزالة الأنسجة من السكروز وربت من أي فائض.
    4. اتخاذ cryomold، وتغطي الطبقة السفلية مع أكتوبر المتوسطة. وضع الأنسجة في أكتوبر المتوسطة. ملء القالب مع أكتوبر المتوسطة لتغطية كامل الأنسجة ومكان على الثلج الجاف.
    5. كتلة مخزن في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء.
    6. إعداد 5 ميكرون أبواب سميكة مع ناظم البرد ومكان على الشرائح المشحونة.
    7. تخزين الشرائح غير المستخدمة في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
    8. الهواء الجاف الشرائح لمدة 7 دقائق. ويغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة أكتوبر WIPالبريد الشريحة مع نسيج أو منشفة ورقية لإزالة فائض من المياه، جبل زلات غطاء مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي وتصور مع مرشح GFP تحت المجهر.
    9. تحديد الانبثاث GFP (الشكل 3A) باستخدام البرنامج المناسب (14).
  4. علم الأنسجة وعلم الأمراض الرقمية
    1. انقر على زر تحميل يدوية تحت علامة التبويب البداية وانتظر الشريحة عقد رف لإخراج من الماسح الضوئي.
    2. خذ قسم الأنسجة H & E الملون، وتنظيفه مع النسيج لإزالة أية أوساخ، ووضعه بشكل آمن في رف الشريحة القابضة.
    3. أدخل وصف الشرائح في الإطار برزت المتابعة.
    4. حدد علامة التبويب مسح المنطقة على إطار وحدة التحكم SS التصوير وضبط الساحة الخضراء لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي يتم مسحها ضوئيا.
    5. اسحب معايرة الماس الأزرق لجزء واضح من الشريحة، حيث الأنسجة غير موجودة، ومع ذلك، في العائد على الاستثمار.
    6. بعد ذلك، حدد التركيز Points التبويب وانقر على زر لصناعة السيارات حدد للحصول على عدة نقاط التركيز (علامة زائد الصفراء) على الأنسجة في العائد على الاستثمار.
    7. إذا لزم الأمر، ضع نقطة التركيز إضافية يدويا عن طريق النقر المزدوج في العائد على الاستثمار.
    8. انتقل إلى علامة التبويب معايرة وحدد زر معايرة لبدء المعايرة الشرائح عند نقطة المعايرة الماس الأزرق. وبعد الانتهاء من معايرة يتم عرض صورة من وجهة المعايرة.
    9. تفقد هذه الصورة لضمان أن تكون واضحة وخالية من الأوساخ أو التحف.
    10. انتقل إلى علامة التبويب مسح ضوئي واختر بدء المسح الضوئي لبدء المسح الضوئي من العائد على الاستثمار. يتم تحويل قسم النسيجي الممسوحة ضوئيا إلى شريحة رقمية (الشكل 3B و 4A)
    11. قياس العبء المنتشر كما هو موضح سابقا (الشكل 4B) 14.

5. التدفق الخلوي (FACS) تحليل السنخية الضامة في الرئتين

  1. إعداد أنظمة التعليق خلية واحدةعلى
    1. بعد التصوير والعد الانبثاث، وغسل الرئتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ووضع على طبق بيتري. جعل 1 - 2 قطعة ملم من الرئتين باستخدام مقص جراحي وملقط.
    2. ونقل القطع الرئة إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 3 مل من العازلة الهضم تحتوي على 1 ملغ / مل كولاجيناز P، 0.04mg / مل الدناز الأول، و 10 ميكروغرام / مل مثبط التربسين حل المتوسطة RPMI (عقيمة).
    3. احتضان أنبوب مخروطي على شاكر الدورية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    4. إزالة المخروطية أنبوب من الحاضنة وماصة الحل صعودا وهبوطا لفصل الأنسجة.
    5. تمرير حل من خلال مصفاة 40 ميكرون لتجنب كتل والحصول على تعليق خلية واحدة. إذا لزم الأمر، لتتفكك أفضل للهضم أنسجة الصحافة الأنسجة ضد مصفاة الخلية بمساعدة الغواص حقنة.
    6. عندما تم التوصل إلى تعليق خلية واحدة، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وليز خلايا الدم الحمراء مع2 مل من العازلة ACK لمدة 10 دقيقة في RT. ثم، ويغسل بيليه مرتين في 8 مل من RPMI.
    7. خلايا Resuspend في 3 مل من المتوسط ​​RPMI الكامل والمضي قدما إلى الخلية عد باستخدام محلل بقاء الخلية حسب تعليمات الشركة الصانعة.
  2. تلطيخ للخلايا الرئة لعلامات السطحية
    ملاحظة: تنفيذ جميع حضانات في 4 درجات مئوية. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج و 4 درجات مئوية.
    1. ماصة 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر من العازلة FACS (1٪ FBS في برنامج تلفزيوني) إلى الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا-V السفلي. باستخدام 96 لوحة جيدا-V أسفل يسهل تسليم عينات متعددة.
    2. قبل احتضان تعليق الخلية مع 1 ميكروغرام ماوس التيسير كتلة تنقية مكافحة فأر CD16 / CD32 في 100 ميكرولتر من FACS العازلة لمدة 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي ال 96 لوحة جيدا-V السفلي لتكوير الخلايا وإزالة طاف بواسطة التقليب لوحة والسماح للاستنزاف حل.
    3. لتلطيخ السطح، مقدما، يخفف من الأجسام المضادة لmurinمستضدات الإلكترونية في أنبوب واحد (مزيج الرئيسي): BV605 CD45 (30 F11)، والمؤسسة العامة CD11b (M1 / 70)، والمؤسسة العامة / Cy7 F4 / 80 (BM8)، APC / Cy7 CD11c و(N418)، PerCPCy5.5 أنا A / أنا E (MHCII) (M5 / 114،152)، والمؤسسة العامة CD80 (16-10A1)، AF 647 CD86 (GL-1) إلى التركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل في المخزن FACS تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من التيسير كتلة CD16 / CD32 الأجسام المضادة.
      ملاحظة: هذه مجموعة من الأجسام المضادة هو مفيد لتحديد وتقييم والحالة الوظيفية للالضامة السنخية والخلايا الجذعية.
    4. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف (مزيج الرئيسي) إلى الآبار من 96 لوحة جيدا-V القاع واحتضان عند 4 مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي في 500 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    6. أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإضافة صبغة الجدوى مخففة في برنامج تلفزيوني (1: 1000). احتضان لمدة 20 دقيقة على 4 ج.
    7. أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. يغسل مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لوحة مرة أخرى.
    8. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 1٪ امتصاص العرق وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى اكتساب أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية. قبل تعليق خلية نقل الاستحواذ على أنابيب البولي بروبلين نظام مراقبة الأصول الميدانية.

6. تحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية: استراتيجيات المحاصرة وتحديد الفئات السكانية خلية

  1. لتحليل FACS كما ذكرت سابقا 10. حصلت بوابة خلية / الأحداث على أساس forward- (FSC) والجانب مبعثر (SSC)؛ ثم بوابة الحية وCD45 + الخلايا. لتحديد بلعم السنخية، بوابة CD11b سلبية ومن ثم الخلايا CD11c و+ F4 / 80 +. (الشكل 5A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حقن الخلايا السرطانية 4T1-GFP في لوحة الدهون الثديية يؤدي إلى تكوين أورام الماوس (الشكل 1A) أن ألخص انتشار النقيلي سرطان الثدي البشري، كما تتشكل الانبثاث بسرعة في الرئتين (الشكل 2)، والكبد والعظام ودماغ الفئران 11. ترنسفكأيشن مستقرة من 4T1 الخلايا مع GFP يسهل رصد نمو الورم (الشكل 1B)، وتتبع المتفاقمة الخلايا السرطانية وقياس العبء المنتشر (الشكل 2B، 3B). وبالإضافة إلى ذلك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تؤدي الرؤى الحديثة في بيولوجيا السرطان والعوامل المسببة المشاركة في التسرطن وتطور الورم إلى تطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) للسرطان ، حيث تنمو الأورام تلقائيا ، عادة على مدى عدة أشهر15. على الرغم من أن نماذج الورم هذه تبدو وكأنها تعكس بشكل أفضل التاريخ الطبيعي للأورام الخبيثة البشرية من الطعوم الغريبة أو النماذج الاصطناعية ، إلا أن الكثير من الوقت المطلوب لتطور الورم ودرجات مختلفة من اختراق النمط الظاهري الخبيث تحد من استخدام هذه الأساليب في الدراسات الميكانيكية. لذلك ، فإن النماذج التي تستخدم الفئران...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا البحث من قبل وزارة الدفاع منح TSA 140010 لعضو الكنيست وق 111038 إلى MMM آراء ووجهات نظر، والتأييد من قبل المؤلف (ق) لا تعكس آراء من الجيش الأمريكي أو وزارة الدفاع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4T1 خط الخلية مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCRL 2539الخلايا السرطانية
4T1-GFP خط الخلاياالفرجار علوم الحياة / بيركين إلمر ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةBW128090الخلايا السرطانية
RPMICorning ، Corning ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية10-040-CMMedia
Heatated FBSGibco (Thermo Scientific) ، الولايات المتحدة الأمريكية10082147Media
Penicillin Streptomycinفيشر ساينتفيك ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةMT-300-02-CIMedia
PBSFisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةBP399-20مخفف بالماء المقطر
Trypsin 0.25٪ مع EDTAHyclone ، لوجان ، يوتا ، الولايات المتحدة الأمريكيةSH30042.02إمدادات زراعة الأنسجة
T75 سم 2< / sup> قارورةفيشر العلمية ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية12-565-32مستلزمات
15 مل أنبوب مخروطيBD الصقر ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية352096إمدادات زراعة الأنسجة
50 مل أنبوب مخروطيBD Falcon ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية352098لوازم زراعة الأنسجة
60 مم 2 طبق بتريفيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةAS4052لتصوير الرئة   ؛
Isoflurane (Isothesia)بتلر شاين لصحة ، دبلن ، أوهايو ، الولايات المتحدة الأمريكيةNDC 11695-6776-2تخدير الفأر
كلودرونات الجسيمات الشحميةFormumax Scientific Inc ، بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةF70101C-Nالبلاعم التحكم في استنفاد
الجسيمات الشحميةFormumax Scientific Inc ، بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةF70101-NControl PBS-liposomes
29 محاقن الأنسولين قياس 29 (سعة 12.7 مم و 0.5 مل)- Reli-OnWalmart ، بنتونفيل ، AR ، الولايات المتحدة الأمريكيةلحقن الخلايا السرطانية
كريم إزالة الشعر (Nair) Walmart، Bentonville ، AR ، الولايات المتحدة الأمريكية
محلول Paraformaldehyde (4٪)Affymetrix ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية19943-I Ltتمييع إلى 4٪ أو 1٪ باستخدام 1x PBS
OCT مركبفيشر Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية230-730-571لتجميد الأنسجة في قوالب التبريد
Fluoro-Gel-II معDAPI علوم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية17985-51تركيب متوسط
السكروزسيجما ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةS-9378الكولاجيناز بالتبريد
Pروش ، بازل ، سويسرا11249002001مكونات المخزن المؤقت لهضم الأنسجة
Dnase IRoche ، بازل ، سويسرا10104159001مكونات المخزن المؤقت لهضم الأنسجة
مثبط التربسينسيجما ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT9253مكونات عازلة هضم الأنسجة
40 ميكرون مصافي الخلايافيشر العلمية ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية22-363-547تستخدم في هضم الأنسجة لإزالة الكتل
Trustain FcX-Fc Block (CD16 / CD32)Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية101320الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
BV605 CD45Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية103139الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
PE CD11bBiolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية101207الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
PE Cy7 F4 / 80   ؛Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية123113الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
APC / Cy7 CD11cBiolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية117323الأجسام المضادة لقياس التدفق
الخلوي PerCPcy5.5 IA / IE (MHCII)   ؛Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية107625الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
PE CD80Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية104707الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي
AF647 CD86Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية105019الأجسام المضادة لقياس التدفق
الخلوي قابلية الإصلاح صبغ eflour 506eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية65-0866الأجسام المضادة لقياس
التدفق الخلويCryostatLeica Biosystems ، Buffalo Grove ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةCM1850Cryosectioning
UVP iBox ExplorerUVP Inc ، Upland ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةالتصوير الفلوري للفأر والرئة
Aperio Scanscope CSLeica Biosystems ، Buffalo Grove ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةعلم الأمراض الرقمي
BD LSRFortessa  ؛BD Biosciences ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةقياس التدفق الخلوي / الحصول على البيانات
نيكون A1 مجهر TE2000 متحد البؤرنيكون إنكسون إنسترومنتس ، ميلفيل ، نيويورك 11747-3064 ، الولايات المتحدة الأمريكية.تصوير وقياس مضان GFP في المقاطع البردية للرئة
برنامج UVP visionworks (الإصدار 7.1RC3.38)UVP Inc ، Upland ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةبرنامج التصوير لبرنامج iBOX
Aperio Imagescope (v12.1.0.5029)  Leica Biosystems ، Buffalo Grove ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكيةبرنامج التصوير لتحليل الشرائح الرقمية
برنامج Flow JO (الإصدار 9.8.1)Flow JO LLC ، Ashland ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكيةتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
NIS عناصر AR (الإصدار 4.20.01) 64 بتNikon Instruments Inc. ، ميلفيل ، نيويورك 11747-3064 ، الولايات المتحدة الأمريكية.اقتناء وتحليل عمليات القطع بالتبريد للرئة ل GFP & nbsp ؛
زراعة الأنسجة

المراجع

  1. Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  4. Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
  5. Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
  6. Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
  7. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
  8. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).
  9. Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
  10. Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
  11. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
  12. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
  13. Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
  14. Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
  15. Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
  16. Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
  17. Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
  18. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

قياس التدفق الخلويالمجهر البؤريعلم الأمراض النسيجية الرقميليبوزومات الكلودروناتنموذج ورم 4T1تقدير كمية النقائل الرئويةحقن الخلايا الورميةعلامات سطح الخلية
دراسة دور السنخية الضامة في سرطان الثدي ورم خبيث
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.