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방법 논문

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54306

⸱

2016년 6월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Science Center, 2Merck Research Labs, 3Department of Surgery, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

이 논문에서

요약

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

초록

이 논문은 암 전이에서 폐포 대식세포의 역할에 대한 연구에 유방암의 syngeneic model(4T1)을 적용하는 방법을 설명합니다. 이미징 및 컨포칼 현미경과 함께 GFP를 발현하는 4T1 세포는 종양 성장을 모니터링하고, 전이된 종양 세포를 추적하고, 전이성 부담을 정량화하는 데 사용됩니다. 이러한 접근 방식은 전이의 자동화되고 편향되지 않은 정량화를 가능하게 하는 디지털 조직병리학으로 보완됩니다. 이 방법에서는 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색된 일상적으로 준비된 조직학적 폐 절편을 스캔하여 디지털 슬라이드로 변환한 다음 자체 학습된 패턴 인식 소프트웨어로 분석합니다. 또한 폐의 폐포 대식세포를 식별하기 위해 여러 세포 표면 마커를 사용하는 유세포 분석 접근 방식을 설명합니다. 폐포 대식세포가 전이 및 항종양 면역에 미치는 영향을 확인하기 위해 이러한 세포는 종양이 있는 마우스에 비강 내 투여된 클로드로네이트 함유 리포좀으로 고갈됩니다. 이 접근법은 유세포 분석으로 확인된 바와 같이 이 세포 집단의 특이적이고 효율적인 고갈로 이어집니다. 폐포 대식세포가 고갈된 마우스에서 종양 부피와 폐 전이를 평가하여 유방암의 전이성 진행에서 이러한 세포의 역할을 결정합니다.

서론

전이성 틈새(premetastatic niche)는 암 전이의 중요한 과정으로, 종양 세포가 도착하기 전에 전이의 표적이 되는 장기에서 발생하는 일련의 변화로 정의됩니다1,2. 그러므로, 암 진행의 이 단계를 치료적으로 표적으로 삼으면 암 관련 사망의 약 90%를 유발하는 중요한 장기로의 전이를 예방할 수 있습니다. "종자와 토양" 이론으로도 알려진 전이성 틈새(premetastatic niche)의 개념은 100여 년 전에 소개되었지만, 골수 유래 세포가 전이성 토양1,3-7에 기여하는 것으로 입증된 최근까지 실험적 증거가 제공되지 않았습니다. 이러한 발전에도 불구하고 전이성 틈새 시장은 암 병태생리학에서 크게 연구되지 않은 측면으로 남아 있으며 관련된 세포 플레이어와 메커니즘을 식별하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

여기에서는 유방암 전이 및 폐 전이전 틈새에서 폐포 대식세포의 역할을 연구하기 위한 생체 내 접근 방식을 보고합니다. 폐포 대식세포는 배아 발달 시기의 초기에 폐에 도착하고 성체가 되면 폐에서 자가 재생한다8. 그들은 또한 환경적 무해한 항원에 대한 원치 않는 염증 반응으로부터 이 기관을 보호하는 것을 포함하여 중요한 면역 조절 및 항상성 기능을 가지고 있습니다9. 따라서, 우리는 종양이 폐포 대식세포에 의해 가해지는 이러한 생리적 면역 억제를 이용하고, 결과적으로 폐포 대식세포가 항종양 면역을 억제함으로써 폐 전이성 틈새에 기여한다는 가설을 세웠습니다. 이 가설은 이러한 세포의 특이적 고갈이 폐 전이를 감소시키고 항종양 T 세포 반응을 향상시킨다는 것을 보여주는 최근 보고서에 의해 뒷받침됩니다10.

이 연구를 위해 우리는 IV기 전이성 유방암을 모방한 유방암(4T1)의 잘 정립된 syngeneic model(4T1)을 적용한다11; 그리고 이전에 전이성 틈새 6의 연구에서 보고되었다. 생체 내에서 전이되는 종양 세포를 추적하기 위해 동물 이미징 및 컨포칼 현미경 검사와 함께 GFP(4T1-GFP)를 발현하는 4T1 세포를 사용합니다. 우리는 폐 전이성 틈새(premetastatic niche)에 초점을 맞추는데, 이 기관은 인간 악성 종양의 혈액성 전이의 가장 흔한 표적 중 하나이기 때문이다12. 전이성 틈새(premetastatic niche)에서 폐포 대식세포(alveolar macrophage)의 기능을 조사하기 위해, 우리는 클로드로네이트 리포좀(clodronate liposome)을 사용하여 이러한 세포를 고갈시킨다13; 그리고 이러한 고갈이 폐 전이에 미치는 영향을 평가합니다. 주목할 점은 이 방법은 치조(alveolar) 대식세포를 특이적으로 고갈시키지만 폐나 순환계에 있는 다른 식세포(phagocytic cell)는 고갈시키지 않는다는 것이다10.

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프로토콜

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 발표 한 "실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"에 설명 된 지침을 기관 동물 관리 및 텍사스 테크 대학 보건 과학 센터의 사용위원회의 승인을 이어왔다. 상업적으로 사용할 수있는 팔주 십이 세 여성 BALB / c 마우스를 사용합니다. 주사 1 × 10 5 4T1 또는 1 × 유방 지방 패드로 다양한 업체에서 구입할 수 있습니다 GFP를 표현하는 10 5 4T1 세포.

1. 4T1의 문화와 4T1-GFP 세포 및 주사 (14)에 대한 종양 세포 현탁액의 준비

  1. 4T1 및 4T1-GFP 세포 배양
    참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.
    1. RPMI 배지에서 4T1 및 4T1-GFP 세포는 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린를 유지한다G 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염.
      주 : 셀의 모든 트립신 처리 및 도금을 계산하여 통로 번호를 확인합니다. 통로의 수는 세포의 발암 및 전이성 전위 영향으로는, 모든 마우스 실험 동일한 통로 번호 세포를 사용하는 것이 중요하다.
    2. 세포 주입에 앞서 인큐베이터 및 흡 배지에서 80 % 컨 플루 언시에 종양 세포를 함유하는 상기 2 cm T75 플라스크를 제거한다. PBS의 10 ML을 추가하고 나머지 매체를 씻어 부드럽게 플라스크를 회전 한 후 PBS를 대기음.
    3. 플라스크에 EDTA와 0.25 % 트립신 2 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2로 37 ℃에서 3 분 동안 습한 인큐베이터에서 표면에 균일 용액을 분산 및 배양 기울.
    4. 세포의 분리를 용이하게하고 신선한 매체의 8 ml에 추가 할 수있는 플라스크를 누릅니다. 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.
    5. 5 분 동안 원심 분리기 세포. 실온에서 500 XG에.뜨는을 기음과 PBS 10ml에 세포를 씻는다.
    6. 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 제조자의 지시에 따라 세포 생존력 분석을 이용하여 세포 수를 계산.
    7. 실험에 사용 된 마우스의 마우스 X 번호 당 10 5 세포 (항상 안전을 위해 여분의 세포를 준비) : 공식을 사용하여 모든 주사에 필요한 세포의 수를 계산합니다.
    8. 1.1.5에서와 같이 원심 분리기 세포. 신선한 PBS의 양 흡입 재현 탁하고 세포를 통해 상청액을 제거하여 1 × 106 세포 / ml의 최종 세포 농도를 얻기 위해 필요한. 주입을위한 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
  2. 4T1 또는 4T1-GFP 세포 주입 마우스 절차
    1. 종양 세포 주입 전날, 3 % 이소 플루 란 유도 챔버 마우스 마취. 마우스가 잠 정기적으로 호흡하면, 장소 t그는 코 콘 내부 코 수술 패드 마우스와 이소 플루 란 기화기에 연결합니다. 2.5 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다. 마우스가 마취되어 있는지 확인하기 위해 마우스 발가락을 꼬집어.
    2. 주사 부위에 면봉 (오른쪽 가슴 유방 지방 패드)를 사용하여 제모 크림을 적용하고 2 분 동안 기다립니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 사이트를 청소, 다시 케이지에 마우스를 놓고는 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
    3. 주사 당일 1.2.2과 쥐를 마취하고 수술 용 패드 위에 놓는다.
    4. 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 종양 세포를 함유하는 튜브를 소용돌이. 대기음 0.5 ml의 인슐린 주사기에 1 × 105 개 종양 세포를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕ (29 G 12.7 mm 바늘 길이).
    5. 2 차 및 3 차 젖꼭지 근처에 엄지 손가락 인덱스를 사용하여 피부를 들어 올려 mammar에 주사기의 바늘을 삽입Y 지방 그냥 손가락 사이의 피부 아래에 세 번째 젖꼭지 아래 패드와 주입 세포는 천천히 거품 (피하 주사)을 형성한다.
    6. 다시 주입 후 케이지에 마우스를 놓고 1.2.2에서와 같이 모니터링 할 수 있습니다.
  3. 모니터링 종양 성장
    1. 캘리퍼스 측정 (14)
      참고 : 4T1 주조 또는 4T1-GFP 세포는 공격적인 유방 종양을 형성한다. 세포 접종 후 5 - 일반적으로 만져서 알 수있는 종양은 4 일에서 ~ 나타납니다. 4T1-GFP 세포는 느리게 성장하고 나중에 전이를 제공 종양을 형성한다. 종양을 2 ~ 3 배 일주일을 측정합니다. 동물의 임상 적 상태가 악화되면 동물 종양 체중의 10 %를 초과하거나 즉시 마우스를 안락사, 궤양되고, 10 % 이상의 체중을 잃는다.
      1. . 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취 수술 패드 장소 무게와 70 % 에탄올로 영역을 적시고.
      2. (- 오일 세포 접종 후 4) 주사 부위에 종양이 만져.
        3. <리> 캘리퍼와 가장 큰 직경 (D) 및 작은 직경 (D1)을 측정한다.
      3. 식 볼륨 = (DX (D1)의 X의 D1) / 2mm 3를 사용하여 종양 체적을 계산합니다. 1.2.2에서와 같이 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다.
    2. 이미징 (전용에 대한 4T1 GFP 세포)
      1. 1.2.1와 같이 마우스를 마취. 이미징 기기 내부의 가동 단계에 마우스를 놓습니다. 코 콘을 통해 마취를 유지한다.
      2. 이미징 기기 및 제조업체의 지침에 따라 광원을 켭니다.
      3. 탭 "취득"에서 "조명"으로 이동하여 백색광의 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 빛 엔진이 켜져 있는지 확인하고 라이트 테이블에 '트랜스'를 선택합니다.
      4. 탭 "현미경"에서 "지우기"배출 필터와 0.5X 배율을 선택합니다. "카메라"탭에서 캡처 비닝하는 '1 × 1'미리보기 '는 4 × 4'인지 확인하십시오.
      5. 흰색 빛 종양의 위치를​​ 미리보기를 클릭 선명한 영상을 얻을 수 초점을 캡처을 클릭합니다.
      6. 1 (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터링 "취득"탭을 변경 조명으로 이동합니다. 은 "현미경"탭에서 "20분의 530의 GF"에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다.
      7. 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더 (그림 1)에 저장합니다.

리포좀 10 2. 비강 관리

참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.

  1. 종양 세포 주입 후 6 일째 1.2.1에서와 같이 마우스 마취.
  2. 제조업체에서 얻은 클로드 또는 제어 (PBS) 리포좀 현탁액을 소용돌이. 리포좀의 μL (60)를 타고uspension 멸균 피펫 팁을 사용.
  3. 천천히, 마우스 용액에 숨을 쉴 수 있도록 콧 구멍 근처 (5 ㎕를 각 시간) 리포좀 솔루션을 출시 60 μL의 전체 용량이 투여 될 때까지 반복합니다.
  4. 마우스가 케이지에 다시 배치하기 전에 의식을 회복하자.
  5. 반복 리포좀 관리는 마우스까지 3 일마다 희생된다. 희생의 날에 리포좀을 관리하지 마십시오.

3. 마우스의 희생과 조직 컬렉션

참고 : 사용 멸균 및 마우스 해부에 대한 무균 악기. 동안 중요한 장기의 방혈 및 제거를 통해 마취 쥐를 안락사.

  1. 일 22 또는 일 (4T1 셀) (26) 종양 세포 주입 후 (4T1-GFP 세포) 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취. 그리고, 기화기에 연결된 코 콘 수술 패드에 배치 1.2.1에서와 같이 마취를 유지한다. m 개의 않도록 발가락 중 하나를 꼬집어여러개 의식이다.
  2. 해부 보드에 바늘을 사용하여 발가락을 고정. 마우스 피부에 에탄올을 스프레이.
  3. 집게를 사용하여 피부를 들어 올려 수술 가위로 절개를합니다. 천천히 복막을 노출하고 목까지 흉부 피부를 통해 절단을 계속합니다.
  4. 수술 가위를 사용하여 복막에 절개를하고, 혈관의 손상을 방지면 팁 신중 장기 노출.
  5. 한쪽으로 장기를 이동하고 하대 정맥을 노출. 정맥에 구멍과 29 G 인슐린 주사기로 피를 수집합니다. 튜브에 수집 된 혈액을 놓고 추가 처리를 위해 얼음에 둡니다.
  6. 흉곽, 폐와 심장을 노출 다이어프램을 잘라. 천천히 뼈 커터를 사용하여 양쪽의 갈비뼈를 잘라 흉곽의 상단을 들어 올립니다. 집게로 마음을 잡고 흉강에 심장과 폐를 연결하는 결합 조직을 잘라.
  7. 60 mm 단위 PBS 소량의 폐 배치면역 형광 현미경 또는 [헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 포함] 루틴 조직학에 대한 동결 절편에 이미징 및 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 얼음에 페트리 접시.

4. 폐 전이 평가

  1. 표면 전이 계산 및 채점
    1. 해부 현미경으로 폐와 페트리 접시를 놓습니다. 폐 표면의 밝은 전망을 얻기 위해 초점을 맞 춥니 다.
    2. 해부 현미경을 사용하여 폐 표면을 관찰한다. 모두 폐의 전방 및 후방 측면에 전이를 계산합니다.
      주 : 정상적인 폐는 약간 흰 또는 분홍빛 및 다공성 구조와 같은 스폰지가 있습니다. 4T1 전이 종종 액체 (도 2A) 한 방울과 유사하게 나타나, 단단하고 비 다공성이다.
  2. 폐 영상
    1. 이미징 기기 내부의 이동식 무대에서 폐와 페트리 접시를 놓습니다.
    2. 악기와 켭니다멀티 스펙트럼 소스를 biolite. 소프트웨어를 엽니 다. 탭에서, "취득", "조명"로 이동하여 백색광 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 라이트 엔진 -> ON, 라이트 테이블 -> 에피. 탭 '현미경'에서 '지우기'방출 필터와 1.66X 배율을 선택합니다. "카메라"탭에서 캡처 비닝하는 '1 × 1'미리보기 '는 4 × 4'인지 확인하십시오.
    3. 미리보기를 클릭하고 흰색 빛 폐의 명확한 그림을 얻을 캡처를 클릭하여 초점을 맞 춥니 다.
    4. (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터 1 "취득"탭과 변화에 이동합니다. 은 "현미경"탭에서 "20분의 530의 GF"에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다.
    5. 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더에 저장합니다.
    6. 유사한 방식으로, 다른 쪽의 화상을 얻기 위해 폐 플립. 이 PROCedure 더 적절한 소프트웨어 (그림 2B) (14)를 사용하여 정량화 할 수있다 GFP 양성 전이의 이미지를 생성합니다.
  3. 면역 형광 현미경
    1. 어두운 곳에서 4 시간 동안 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 폐 수정.
    2. 완전히 정착을 제거하기 위해 5 분 동안 10 ml의 PBS로 두 번 조직을 씻으십시오. PBS의 18 % 자당에 전송하고 4 ℃에서 O / N을 품어.
    3. 자당에서 조직을 제거하고 초과를 줘봐.
    4. cryomold을 가지고, 간섭 단층 매체와 바닥 층을 커버한다. 간섭 단층 매체에 조직을 놓습니다. 완전히 드라이 아이스의 조직과 장소를 커버하는 간섭 단층 매체와 금형을 입력합니다.
    5. 절편 때까지 -80 ° C에서 보관 블록.
    6. 충전 슬라이드에 저온 유지 장치와 장소 5 μm의 두께 섹션을 준비합니다.
    7. 또한 사용 때까지 -80 ° C에서 사용되지 않는 슬라이드를 저장합니다.
    8. 공기는 7 분 동안 슬라이드를 건조. 및 OCT를 제거하는 PBS로 세척. WIP전자 조직이나 종이 타월로 슬라이드 물을 초과를 제거 DAPI를 포함하는 매체를 장착하여 커버 슬립을 탑재하고 현미경으로 GFP 필터를 시각화한다.
    9. 적절한 소프트웨어 (14)의 사용과 GFP 전이 (도 3A)을 정량화.
  4. 조직학 및 디지털 병리학
    1. 시작 탭에서 수동로드 버튼을 클릭하고 스캐너에서 배출 랙을 들고 슬라이드를 기다립니다.
    2. 의 H & E 염색 조직 절편을 가지고있는 먼지를 제거 티슈로 청소하고, 슬라이드 들고 랙에 안전하게 배치합니다.
    3. 팝 업 창에서 슬라이드 설명을 입력합니다.
    4. 친위대 영상 콘솔 창에서 스캔 영역 탭을 선택하고 관심 (ROI)의 영역 스캔 할을 정의 할 수있는 녹색 사각형을 조정합니다.
    5. 조직이 투자 수익 (ROI) 내에서, 그러나, 결석 슬라이드의 명확한 부분에 푸른 교정 다이아몬드를 드래그합니다.
    6. 다음으로, 초점 P를 선택oints 탭은 ROI의 조직에 여러 개의 초점 포인트를 얻을 수있는 자동 선택 버튼 (노란색 더하기 기호)를 클릭합니다.
    7. 필요한 경우, 투자 수익 (ROI) 내에서 두 번 클릭하여 수동으로 추가 초점 포인트를 놓습니다.
    8. 교정 탭으로 이동하고 푸른 교정 다이아몬드 포인트에서 슬라이드 교정을 시작하기 위해 보정 버튼을 선택합니다. 교정이 완료된 후, 교정 포인트의 이미지가 표시된다.
    9. 이 명확하고 먼지 나 유물이 없는지 확인하기 위해이 이미지를 검사합니다.
    10. 스캔 탭으로 이동하고, 투자 수익 (ROI)의 스캔을 시작하기 위해 스캔 시작을 선택합니다. 스캔 조직 학적 섹션은 디지털 슬라이드로 변환된다 (그림 3B 및 4A)
    11. 이전에 (그림 4B) (14) 설명에 따라 전이성 부담을 정량화.

폐의 폐포 대 식세포 5. 유동 세포 계측법 (FACS) 분석

  1. 단일 셀 Suspensi의 준비...에
    1. 이미징 및 전이 계산 한 후, 멸균 PBS로 폐를 씻어 페트리 접시에 놓습니다. 수술 가위와 집게를 사용하여 폐의 2mm 조각 - 1을 확인합니다.
    2. (3) 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나 P, 0.04mg / ㎖의 DNase I을 함유하는 분해 완충액 ㎖, 10 μg의 / ㎖ 트립신 용해 억제제 RPMI 배지 (멸균)과 15ml의 원뿔형 튜브에 폐 조각을 전송.
    3. 40 분 동안 37 ° C의 배양기에서 회전 진탕 기에서 인큐베이션 원추형 튜브.
    4. 조직을 떼어 놓다 아래로 인큐베이터에서 튜브 원뿔을 제거하고 솔루션을 피펫합니다.
    5. 덩어리를 방지하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수있는 40 μm의 여과기를 통해 솔루션을 전달합니다. 필요한 경우, 주사기 플런저의 도움으로 셀 스트레이너에 대해 더 잘 소화 조직 프레스 조직을 분해합니다.
    6. 단일 세포 현탁액이 달성되면, 원심 분리하여 세포를 수집하고으로 적혈구를 용해시키기RT에서 10 분 동안 ACK 완충액 2 ㎖. 그 후, RPMI 8 ml의 펠릿 두 번 세척 하였다.
    7. 전체 RPMI 배지 3 ㎖와에 재현 탁 전지는 제조업체의 지침에 따라 세포 생존 분석기를 사용하여 계산 셀로 진행합니다.
  2. 표면 마커에 대한 폐 세포의 염색
    참고 : 4 ° C에서 모든 배양을 수행합니다. 500 XG, 4 ℃에서 원심 분리기 판.
    1. 피펫 V 바닥 96 웰 플레이트의 각각의 웰을 FACS 완충액 (PBS에 1 % FBS) 100 ㎕에 1 × 106 세포. V 자 바닥 96 웰 플레이트를 사용하면 여러 샘플을 나눠을 용이하게한다.
    2. 1 μg의 마우스와 차단 된 Fc 세포 현탁액을 사전 부화 15 분 동안 FACS 완충액 100 ㎕의 CD32 / 항 - 마우스 CD16 정제. 세포 펠렛과 판을 뒤집기 및 솔루션 드레인을 시켜서 뜨는을 제거하는 V 바닥 96 웰 플레이트를 원심 분리기.
    3. 표면 얼룩의 경우, 사전에 murin에 대한 항체를 희석하나의 튜브 (마스터 믹스)에 전자 항원 : BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b를 (/ 70 M1), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7의 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / 된 Fc 블록 CD16 10 ㎍ / ml를 함유 FACS 완충액 중 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도 I E (MHCII) (M5 / 114.152) PE CD80 (16-10A1) AF 647 CD86 (GL-1) / CD32 항독소.
      참고 : 항체의이 세트는 식별 및 폐포 대 식세포와 수지상 세포의 기능 상태를 평가하는 데 유용합니다.
    4. V 자 바닥 96 웰 플레이트에 희석 항체 (마스터 믹스) 100 μl를 추가하고 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다.
    5. 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거하기 위해 플레이트를 원심 분리기. 5 분 동안 500g에 FACS 버퍼 200 μL, 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거합니다. 및 PBS 200 ㎕의 세포를 재현 탁.
    6. PBS (1,000 일)에 희석 가능성 염료를 세포 펠렛을 추가 할 수있는 판을 원심 분리기. 4 ℃에서 20 분 동안 품어.
    7. 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거 할 수있는 판을 원심 분리기. PBS 200 μL로 세척하고 다시 접시를 원심 분리기.
    8. FACS 악기에 의해 인수 될 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드 및​​ 저장 100 ㎕에 재현 탁 세포. 폴리 프로필렌 FACS 튜브에 수집 전송 세포 현탁액에 앞서.

6. FACS 데이터의 분석 : 게이팅 전략과 세포의 부분 집단의 식별

  1. 이전에 (10)를보고 FACS 분석을 수행합니다. 게이트 셀 포워드 (FSC)을 기반으로 / 이벤트 및 측면 산란 (SSC)를 취득; 다음 라이브 게이트와 CD45 + 세포. 폐포 대 식세포 식별, 게이트 부정적인 CD11b를-다음의 CD11c + F4 / 80 + 세포. (도 5a).

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결과

전이가 빠르게 폐 (도 2), 간, 뼈 형성으로 유방 지방 패드로 4T1-GFP 종양 세포의 주입은, 인간 유방암 전이 확산 요점을 되풀이 마우스 종양 (도 1a)의 형성을 유도 와 마우스 (11)의 뇌. GFP와 4T1 세포의 안정한 형질 감염은 종양 성장의 모니터링을 용이하게한다 (도 1B), 전이되는 종양 세포의 추적 및 전이성 부담 (도 2B, 3B)을 정량화. 또한, 종양의 영상은 종양 세포 사멸 및 종양 맥관 여러 병리학 적 특성에 관한 추가 정보를 제공한다. 밝은 녹색 형광 (그림 1B-중간 패널) 일반적으로 가능한 종양 실질과 연관된 높은 GFP 발현을 나타냅니다. 일부 종양 영역에서는 GFP의 부족 (종양 세포 사망을 나타낼 수있는 반면 그림 1B-오른쪽 패널). G...

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토론

암 생물학 및 발암 및 종양 진행과 관련된 원인 요인에 대한 최근의 통찰력은 종양이 일반적으로 몇 달에 걸쳐 자발적으로 성장하는 암의 유전자 조작 마우스(GEM) 모델의 개발로 이어집니다15. 이러한 종양 모델은 이종이식편이나 동계 모델보다 인간 악성 종양의 자연사를 더 잘 반영하는 것으로 보이지만, 종양 발생에 필요한 많은 시간과 다양한 정도의 악성 표현형 침투율로 인해 기계론적 연구에서 이러한 접근법의 사용이 제한됩니다. 따라서 동계 세포를 동소적으로 주입한 면역 적격 마우스를 활용하는 모델은 완벽하지는 않지만 종양 미세 환경 및 암에서 면역 체계의 역할과 관련된 기계론적 질문을 해결하는 데 여전히 도움이 됩니다. 4T1 모델은 인간의 IV기 전이성 유방암을 요약하기 때문에 이러한 목적으로 광범위하게 사용되었습니다11.

형광 단백질을 발현하는 4T1 종양 세포의 사용은 동물 이미징을 통해 종양 성장, 종양 세포 생존력의 변화 및 전이를...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 미국 육군이나 국방부 분들을 반영하지 않습니다 저자 (들)에 의해 뷰와의 의견 및 보증을 MMM하는 MK와 BC 111,038에 TSA 140,010을 부여 국방부에 의해 지원되고있다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4T1 세포주 American Type Culture Collection, Manassas, VA, USACRL 2539종양 세포
4T1-GFP 세포주캘리퍼 생명 과학/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USABW128090종양 세포
RPMICorning, Corning, NY, USA10-040-CM미디어
열 비활성화 FBSGibco (Thermo Scientific), 미국10082147미디어
페니실린 스트렙토마이신Fisher Scientific, Waltham, MA, USAMT-300-02-CIMedia
PBSFisher Scientific, Waltham, MA, USABP399-20EDTA
Trypsin 0.25%로, Logan, Utah, USASH30042.02조직 배양 용품
T75 cm2 플라스크Fisher Scientific, Waltham, MA, USA12-565-32조직 배양 용품
15 ml 원뿔형 튜브BD 팔콘, 프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국352096조직 배양 용품
50 ml 원추형 튜브BD 팔콘, 프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국352098조직 배양 용품
60 mm2 페트리 접시Fisher Scientific, Waltham, MA, USAAS4052폐 이미징용 
이소플루란(이소피지)Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USANDC 11695-6776-2마우스 마취
클로드로네이트 리포솜Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USAF70101C-N대식세포 고갈
제어 리포솜Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USAF70101-NControl PBS-리포
솜 29게이지 인슐린 주사기(12.7mm 및 0.5ml 용량)- Reli-OnWalmart, Bentonville, AR, USA종양 세포 주입용
제모 크림(Nair)Walmart, Bentonville, AR, USA
파라포름알데히드 용액(4%)Affymetrix, Santa Clara, CA, USA19943-ILt 1x PBS OCT 화합물을 사용하여 4% 또는 1%로 희석
Fisher Scientific, Waltham, MA, USA230-730-571cryomolds의 조직 동결용
DAPI 전자 현미경 과학을 사용한 Fluoro-Gel-II, Hatfield, PA, USA17985-51장착 매체
Sigma, St. Louis, MO, USAS-9378Cryopreservation
Collagenase PRoche, Basel, Switzerland11249002001조직 소화 완충액의 구성 요소
Dnase IRoche, Basel, Switzerland10104159001조직 소화 완충액의 구성 요소
트립신 억제제Sigma, St. Louis, MO, USAT9253조직 소화 완충액
40 미크론 세포 여과기의Fisher Scientific, Waltham, MA, USA22-363-547덩어리를 제거하기 위해 조직 소화에 사용
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)Biolegend, San Diego, CA, USA101320유세포 분석
BV605 CD45Biolegend, San Diego, CA, USA103139유세포
CD11bBiolegend, San Diego, CA, USA101207유세포분석 PE
Cy7 F4/80Biolegend, San Diego, CA, USA123113유세포분석용 항체
APC/Cy7 CD11cBiolegend, San Diego, CA, USA117323유세포분석 항체
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) Biolegend, San Diego, CA, USA107625유세포분석용 항체
PE CD80Biolegend, San Diego, CA, USA104707유세포분석용 항체
AF647 CD86Biolegend, San Diego, CA, USA105019유세포분석용 항체
Fixable viability Dye eflour 506eBioscience, San Diego, CA,USA65-0866유세포
분석용 항체CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USACM1850냉동 절편
UVP iBox ExplorerUVP Inc, Upland, CA, USA마우스 및 폐 형광 이미징
Aperio Scanscope CSLeica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA디지털 병리학
BD LSRFortessa BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA유세포 분석/데이터 수집
Nikon A1 컨포칼 TE2000 현미경Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.폐 동결 절제에서 GFP 형광 이미징 및 정량화
UVP visionworks 소프트웨어(버전 7.1RC3.38)UVP Inc, Upland, CA, USAiBOX
Aperio Imagescope 소프트웨어용 이미징 소프트웨어(v12.1.0.5029) Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA디지털 슬라이드 분석을 위한 이미징 소프트웨어
Flow JO 소프트웨어(버전 9.8.1)Flow JO LLC, Ashland, OR, USA유세포 분석
데이터 분석 NIS Elements AR(버전 4.20.01) 64비트Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.GFP 를 위한 폐 동결절편의 수집 및 분석;
Hyclone으로 증류수 희석 구성 요소 분석 PE 용 항체

참고문헌

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  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  4. Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
  5. Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
  6. Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
  7. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
  8. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).
  9. Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
  10. Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
  11. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
  12. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
  13. Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
  14. Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
  15. Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
  16. Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
  17. Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
  18. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).

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