Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Texas Tech University Health Sciences Center en volgde de in de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren", gepubliceerd door de National Institutes of Health richtlijnen. Met acht tot twaalf weken oude vrouwelijke BALB / c muizen die commercieel verkrijgbaar zijn. Injecteer 1 x 10 5 4T1 of 1 x 10 5 4T1-cellen die GFP, die kunnen worden gekocht van verschillende leveranciers, in het uiervet pad.
1. Cultuur van 4T1 en 4T1-GFP Cells & Voorbereiding van de Tumor Cell Suspension voor injecties 14
- 4T1 en 4T1-GFP Cell Culture
OPMERKING: Voer alle stappen met behulp van steriele oplossingen in een laminaire luchtstroom (LAF) bioveiligheid kast, tenzij anders vermeld.- Handhaven 4T1 en 4T1-GFP-cellen in RPMI medium aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal bovien serum en 100 U / ml penicillineG en 100 ug / ml streptomycine sulfaat.
OPMERKING: Bepaal een passage nummer door het tellen van elke behandeling met trypsine en de beplating van de cellen. Het is belangrijk om cellen te gebruiken met hetzelfde aantal passages alle muisexperimenten, het aantal passages cel tumorgeniciteit en metastatische potentieel beïnvloedt. - Vóór cel injecties verwijderen T75 cm2 kolf, bevattende tumorcellen bij 80% confluentie, vanuit een incubator en zuig medium. Voeg 10 ml PBS en draai de kolf zachtjes uit te spoelen de resterende medium en vervolgens zuigen PBS.
- Voeg 2 ml van 0,25% trypsine met EDTA aan de kolf en kantelen om de oplossing gelijkmatig te verdelen op het oppervlak en incuberen in een bevochtigde incubator gedurende 3 min bij 37 ° C met 5% CO2.
- Tik op de kolf met detachement van de cellen te vergemakkelijken en voeg 8 ml vers medium. Pipet op en neer meerdere malen bosjes verstoren en krijg een enkele cel suspensie.
- Centrifugeer cellen gedurende 5 min. bij 500 x g bij kamertemperatuur.Zuig het supernatant en was cellen in 10 ml PBS.
- Pipet op en neer meerdere malen bosjes verstoren en krijg een enkele cel suspensie. Neem 100 ui van een celsuspensie en tel de cellen met de cellevensvatbaarheid analysator volgens instructies van de fabrikant.
- Bereken aantal cellen vereist voor alle injecties met behulp van de formule: 10 5 cellen per muis x # van muizen gebruikt in een experiment (altijd voor te bereiden extra cellen om op een veilige kant).
- Centrifugeer cellen zoals in 1.1.5. Verwijder de bovenstaande vloeistof aspiratie en resuspendeer cellen in de hoeveelheid verse PBS vereist om een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen. Houd de celsuspensie op ijs pas klaar voor de injectie.
- Handhaven 4T1 en 4T1-GFP-cellen in RPMI medium aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal bovien serum en 100 U / ml penicillineG en 100 ug / ml streptomycine sulfaat.
- 4T1 en 4T1-GFP Cell Injection-muis Procedures
- De dag voor de injectie van tumorcellen verdoven muizen in een inductie kamer met 3% isofluraan. Zodra muizen zijn slaap en regelmatig te ademen, plaats thij muis op een chirurgische pad met de neus in de neuskegel, en sluit deze aan op de isofluraan vaporizer. Handhaving van anesthesie met 2,5% isofluraan. Druk de muis toe dat de muis verdoofd.
- Solliciteer ontharingscrème met behulp van een wattenstaafje om de plaats van injectie (rechts borstvinnen uiervet pad) en wacht 2 minuten. Maak de site met behulp van een natte papieren handdoek, plaatst u de muis terug in de kooi en bewaken van een dier, totdat het voldoende bewustzijn om de borstligging handhaven herwint.
- Op de dag van de injectie, verdoven de muizen zoals in 1.2.2 en plaats op de chirurgische pad.
- Vortex de buis met tumorcellen uniforme celsuspensie krijgen. Verzamelbak 100 ui van een celsuspensie gemaakt met 1 x 10 5 tumorcellen, in een 0,5 ml insulinespuit (29 G, 12,7 mm naaldlengte).
- Til de huid met behulp van de duim en wijsvinger in de buurt van de 2 e en 3 e tepel, steek de naald van de spuit in de Mammary vetkussentje net onder de derde tepel onder de huid tussen de vingers en injecteer cellen langzaam naar een bel (subcutane injectie) te vormen.
- Plaats de muis in de kooi terug na de injectie en de monitor als in 1.2.2.
- Monitoring tumorgroei
- Calipermetingen 14
LET OP: Ingespoten 4T1 en 4T1-GFP cellen vormen agressieve borsttumor. Meestal zijn de voelbare tumoren verschijnen ~ op dag 4-5 na cel inenting. 4T1-GFP cellen vormen tumoren die langzamer groeien en metastasen geven later. Meet de tumor 2-3 keer per week. Indien klinische toestand van dieren verslechtert, dieren verliezen meer dan 10% lichaamsgewicht, tumoren bedraagt dan 10% van het lichaamsgewicht of worden zweren, onmiddellijk euthanize muizen.- Verdoven een muis als in 1.2.1., Wegen, plaats op de chirurgische pad en nat het gebied met 70% ethanol.
- Palperen tumor in de injectieplaats (4-5 dagen na celinoculatie). <li> Meet de grootste diameter (D) en kleinere diameter (d1) met een schuifmaat.
- Bereken tumor volume met formule Volume = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Monitor muis herstel van de anesthesie als in 1.2.2.
- Calipermetingen 14
- Imaging (Alleen voor 4T1 GFP Cells)
- Verdoven van de muis als in 1.2.1. Plaats de muis op een beweegbaar platform in de beeldvormende apparaat. Handhaaf verdoving via de neuskegel.
- Schakel het beeldvormende apparaat en de lichtbron volgens de instructies van de fabrikant.
- Onder het tabblad "Acquisition" ga naar "Verlichting" en over te schakelen naar de lege positie (zonder filter) voor wit licht. Zorg ervoor dat de lichte motor is ingeschakeld en selecteer 'Trans' in het licht tafel.
- Onder het tabblad "Microscope", selecteer "Clear" emissie-filter en 0,5x vergroting. In het tabblad "Camera", zorg ervoor dat binning voor het vangen is '1 x 1' en een voorbeeld van '4 x 4'. Klik op voorbeeld om de tumor in wit licht te vinden, richten om duidelijk beeld te krijgen, en klik op capture.
- Ga naar "Acquisition" tab en verandering verlichting aan filter 1 (filter voor GFP als per instructies van de fabrikant). In het tabblad "Microscope", veranderen emissie filter om "530/20 GF". beeldopname Preview en in een groene kanaal. Pas de blootstelling tijd om de juiste helderheid te krijgen.
- Solliciteer pseudocolor om het beeld en op te slaan in de juiste map (figuur 1).
2. intranasale toediening van liposomen 10
OPMERKING: Voer alle stappen met behulp van steriele oplossingen in een laminaire luchtstroom (LAF) Bio-veiligheidskabinet, tenzij anders vermeld.
- Op dag 6 na de injectie van tumorcellen verdoven muizen als in 1.2.1.
- Vortex de clodronaat of de controle (PBS) liposoom schorsing bij de fabrikant. Neem 60 pi liposoom suspension met steriele pipet tip.
- Langzaam los liposoomoplossing (5 gl per keer) bij de neus zodat de muis te ademen in de oplossing, herhaald totdat de volledige dosis van 60 pl wordt toegediend.
- Laat de muis weer bij bewustzijn voordat u het terug in de kooi.
- Liposoom herhaalde toediening elke 3 dagen totdat de muizen opgeofferd. Niet liposomen toedienen op een dag van het offer.
3. Mouse Sacrifice en Tissue Collection
LET OP: Gebruik een autoclaaf en steriele instrumenten voor muizen dissectie. Euthanaseren terwijl muizen onder verdoving door verbloeding en verwijdering van de vitale organen.
- Op dag 22 (Voor 4T1 cellen) of 26 dagen (voor 4T1-GFP cellen) na de injectie van tumorcellen verdoven de muis als in 1.2.1. en te plaatsen op de chirurgische pad met een neuskegel verbonden verdamper, anesthesie zoals in 1.2.1 te handhaven. Knijpen een van de tenen te garanderen dat de mouse bewusteloos is.
- Speld de tenen met behulp van naalden om de dissectie board. Spray ethanol op de muis huid.
- Til de huid met behulp van een tang en een insnijding met de chirurgische schaar. Langzaam bloot het buikvlies en blijven snijden huid door middel van de borstkas tot aan de nek.
- Met de chirurgische schaar een insnijding in het peritoneum en voorzichtig bloot organen met wattenstaafjes dat schade aan de bloedvaten.
- Verplaats de organen enerzijds en bloot de inferior vena cava. Prik de ader en het verzamelen van bloed met de 29 G insulinespuit. Plaats verzamelde bloed in de buis en laat op ijs voor verdere verwerking.
- Snijd het diafragma aan de ribbenkast, longen en het hart bloot te leggen. cut langzaam de ribbenkast aan beide zijden met behulp van het bot mes en til de top van de ribbenkast. Pak het hart met een tang en snijd het bindweefsel het aansluiten van het hart en de longen naar de borstholte.
- Plaats de longen in kleine hoeveelheid PBS in de 60 mmPetrischaaltje op ijs pas klaar voor de beeldvorming en de verdere verwerking tot diepgevroren secties voor immunofluorescentie microscopie of routine histologie [inclusief hematoxyline en eosine (H & E) kleuring].
4. longmetastasen Evaluatie
- Tellen en Scoren Surface Metastases
- Plaats de petrischaal met de longen onder de dissectie microscoop. Focus op een duidelijk beeld van de long oppervlak te krijgen.
- Met behulp van een dissectie microscoop te observeren de long oppervlak. Rekenen metastasen op de voorste en achterste zijden van beide longen.
NB: De normale long is witachtig of roze en poreus en heeft een sponsachtige structuur. 4T1 metastasen stevig en poreus, soms lijken op een druppel vloeistof (Figuur 2A) zijn.
- Lung imaging
- Plaats de petrischaal met longen op het beweegbare platform in de beeldvormingsinstrument.
- Zet het instrument en deBioLite multispectrale bron. Open de software. Onder het tabblad "Acquisition", ga naar "Verlichting", en schakel over naar lege positie (zonder filter) voor wit licht. Light Motor -> ON, licht tafel -> Epi. Onder het tabblad "Microscope 'Kies' Clear 'emissie-filter en 1.66X vergroting. In het tabblad "Camera", zorg ervoor dat binning voor het vangen is '1 x 1' en een voorbeeld van '4 x 4'.
- Klik op Preview en de focus om een duidelijk beeld van de longen in het wit licht te krijgen en klik op capture.
- Ga naar het tabblad "Acquisition" en wijziging van de filter 1 (filter voor GFP als per instructies van de fabrikant). In het tabblad "Microscope", veranderen emissie filter om "530/20 GF". beeldopname Preview en in een groene kanaal. Pas de blootstelling tijd om de juiste helderheid te krijgen.
- Solliciteer pseudocolor om het beeld en op te slaan in de juiste map.
- Flip de longen beeld van de overkant te komen op soortgelijke wijze. dit procedure genereert beelden van GFP-positieve metastasen dat verder kan worden gekwantificeerd met behulp van geschikte software (figuur 2B) 14.
- immunofluorescentie Microscopie
- Bevestig de longen in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 4 uur in het donker.
- Was het weefsel tweemaal met 10 ml PBS gedurende 5 min naar het fixeermiddel volledig te verwijderen. Transfer naar 18% sucrose in PBS en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
- Verwijder het weefsel van de sucrose en dep het overtollige.
- Neem een cryomold, hebben betrekking op de onderste laag met oktober medium. Plaats het weefsel op oktober medium. Vul de vorm met oktober medium aan het weefsel en leg ze op droog ijs volledig te bedekken.
- Store blok bij -80 ° C tot snijden.
- Bereid 5 pm dikke secties met een cryostaat en leg ze op een toeslag van dia's.
- Bewaar ongebruikte dia's in -80 ° C tot verder gebruik.
- Lucht Droog de glaasjes gedurende 7 min. en wassen met PBS tot oktober te verwijderen. Wipe de dia met tissue of papieren handdoek om het overtollige water te verwijderen, zet de dekglaasjes met montage medium met DAPI en te visualiseren met GFP filter onder de microscoop.
- Kwantificeren GFP metastasen (figuur 3A) met het gebruik van de juiste software 14.
- Histologie en Digital Pathology
- Klik op de knop load handleiding onder het tabblad start en wacht op de dia met rack te werpen van de scanner.
- Neem de H & E gekleurde weefselsectie schoon met tissue om vuil te verwijderen, en plaats deze stevig op de dia met rack.
- Voer de dia beschrijving in de popped-up venster.
- Selecteer het tabblad Scan Area op het console venster SS beeldvorming en pas het groene plein naar de regio van belang (ROI) te scannen te definiëren.
- Sleep de blauwe kalibratie diamant om een deel van de schuif, waarbij weefsel afwezig is echter binnen het ROI.
- Vervolgens selecteert u de Focus Points tab en klik op de auto select knop om een aantal focuspunten te verkrijgen (geel plus tekens) op het weefsel in de ROI.
- Indien nodig, plaatst extra aandacht punten handmatig door te dubbelklikken binnen de ROI.
- Ga verder naar het tabblad kalibreren en selecteer de knop om te kalibreren dia kalibratie beginnen bij de blauwe diamant kalibratie punt. Nadat de kalibratie is voltooid de afbeelding van het ijkpunt worden weergegeven.
- Inspecteer deze afbeelding om ervoor te zorgen dat het duidelijk is en vrij van vuil of artefacten.
- Ga verder naar het tabblad Scannen en selecteer Scan starten om het scannen van de ROI te beginnen. Gescande histologische coupe wordt omgezet in een digitaal slede (Figuur 3B en 4A)
- Kwantificeren metastatische belasting zoals eerder beschreven (figuur 4B) 14.
5. Flowcytometrie (FACS) analyse van alveolaire macrofagen in de longen
- Voorbereiding van de Single Cell ophanging,op
- Na de beeldvorming en het tellen van uitzaaiingen, was de longen met steriele PBS en plaats om de petrischaal. 1 - 2 mm stukjes van de longen het gebruik chirurgische schaar en forceps.
- Breng de longen stukken om de 15 ml conische buis met 3 ml van de spijsvertering buffer die 1 mg / ml collagenase P, 0,04 mg / ml DNase I, en 10 ug / ml trypsine-remmer opgelost RPMI medium (steriel).
- Incubeer de conische buis op een roterende schudder in de incubator bij 37 ° C gedurende 40 min.
- Haal de buis konische uit de incubator en pipet de oplossing op en neer om het weefsel te scheiden.
- Laat de oplossing door de 40 urn zeef om klonten te vermijden en een enkele cel suspensie. Indien nodig, om beter de gedigereerde weefsel pers weefsel desintegreren tegen de cel zeef met behulp van een zuiger.
- Wanneer een enkele celsuspensie is bereikt, laat de cellen door centrifugeren en rode bloedcellen lyseren met2 ml ACK buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens tweemaal wassen van een pellet in 8 ml RPMI.
- Resuspendeer cellen in 3 ml RPMI complete medium en verder naar celtelling met de cellevensvatbaarheid analysator volgens instructies van de fabrikant.
- Kleuring van longcellen voor Surface Markers
Opmerking: Voer alle incubaties bij 4 ° C. Centrifuge plaat bij 500 xg en 4 ° C.- Pipetteer 1 x 10 6 cellen in 100 gl FACS buffer (1% FBS in PBS) aan afzonderlijke putjes van een V-bodem 96-well plaat. Met behulp van een V-bodem 96 wells plaat vergemakkelijkt het uitdelen van meerdere monsters.
- Pre-incubeer de celsuspensie bij 1 ug muizen Fc Block gezuiverd anti-muis CD16 / CD32 in 100 gl FACS buffer gedurende 15 min. Centrifugeer de V-bodem 96 wells plaat om pellet de cellen en de bovenstaande vloeistof door het wegknippen van de plaat en laat de oplossing drain.
- Voor oppervlakte kleuring, op voorhand, verdunnen de antilichamen tegen Murine antigenen in één buis (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I L (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (AR-1) tot een eindconcentratie van 2,5 ug / ml in FACS-buffer bevattende 10 ug / ml Fc blok CD16 / CD32 antilichaam.
LET OP: Deze set van antilichamen is nuttig voor de identificatie en de evaluatie van een functionele status van alveolaire macrofagen en dendritische cellen. - Voeg 100 gl verdunde antilichamen (master mix) aan de putjes van de V-bodem 96 wells plaat en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min.
- Centrifugeer de plaat om cellen pellet en verwijder de bovenstaande vloeistof als in 5.2.2. Was de cellen met 200 gl FACS buffer, centrifugeer bij 500 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant in 5.2.2. en resuspendeer cellen in 200 pl PBS.
- Centrifugeer de plaat om cellen te pelleteren en voeg levensvatbaarheid kleurstof verdund in PBS (1: 1000). Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </ Li>
- Centrifugeer de plaat om cellen pellet en verwijder de bovenstaande vloeistof als in 5.2.2. Wassen met 200 pi PBS en centrifuge de plaat opnieuw.
- Resuspendeer cellen in 100 gl 1% paraformaldehyde en bewaar bij 4 ° C totdat de overname door FACS instrument. Voorafgaand aan de overname overdracht celsuspensies om de polypropyleen FACS buizen.
6. Analyse van FACS gegevens: Gating strategieën en de identificatie van celsubpopulaties
- Voeren FACS-analyse zoals eerder beschreven 10. Gate verworven cellen / gebeurtenissen gebaseerd op forward (FSC) en side-verstrooiing (SSC); en dan gate leven en CD45 + cellen. Voor alveolaire macrofaag identificatie, gate CD11b-negatief en vervolgens CD11c + F4 / 80 + cellen. (Figuur 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De injectie van 4T1-GFP tumorcellen in de uiervet pad leidt tot de vorming van muizen tumoren (figuur 1A) de metastatische verspreiding van menselijke borstkanker Resumerend metastasen snel in de longen (figuur 2), lever, bot gevormd en de hersenen van muizen 11. De stabiele transfectie van 4T1-cellen met GFP faciliteert controle van tumorgroei (figuur 1B), het bijhouden van gemetastaseerde tumorcellen en kwantificeren van de metastatische last (Figuur 2B, 3B). Bovendien beeldvorming van tumoren geeft de aanvullende informatie over verscheidene pathologische zoals tumorceldood en tumorvasculatuur. De heldere groene fluorescentie (Figuur 1B-de middelste panelen) geven de hoge expressie GFP, dat gewoonlijk wordt geassocieerd met levensvatbare tumor parenchym. Dat het ontbreken van GFP in sommige tumorzones tumorceldood kunnen wijzen (
Aangezien de meeste longmetastasen bevinden zich op het longoppervlak, kunnen deze worden waargenomen onder de normale dissectie microscoop. De metastatische laesies zijn meestal duidelijk onderscheiden van de omringende parenchym (figuur 2A). Grove observaties verifiëren en metastasen die dieper binnen longparenchym zijn geëvalueerd, kan fluorescentie beeldvorming van de longen worden uitgevoerd (figuur 2B), als GFP tot expressie brengende cellen gebruikt voor injectie. Hoewel long autofluorescentie is duidelijk zichtbaar in de beelden, heldere GFP-fluorescentie afgeleid vergemakkelijkt onderscheidende metastasen van omringende longparenchym. Als alternatief routine histologie (Figuur 3A en Figuur 4A) in combinatie met digitale pathologie algoritmen ( Veelkleurig FACS biedt de kans om tot zeldzame celpopulaties karakteriseren door middel van meerpolige celoppervlak en / of cytoplasmatische markers gelijktijdig. Alveolaire macrofagen worden gekenmerkt door het ontbreken van CD11b expressie en expressie van F4 / 80 en CD 11 c (figuur 5). De typische benadering van deze cellen te identificeren door flowcytometrie omvat: (i) selectie van de celpopulatie op basis van morfologie beschreven door voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen, (ii) selectie van levensvatbare CD45 + cellen gevolgd door (iii) gating van CD11b negatieve cellen, en (iv) gating cellen co-expressie F4 / 80 en CD 11 c (Figuur 5A, B). 
Figuur 1. Monitoring tumorgroei Through Animal Imaging. (A) Witte lichtbeelden van de muis geïnjecteerd met GFP tot expressie brengende cellen in de borstklier vetkussentje op verschillende tijdstippen na injectie van tumorcellen. (B) Overeenkomstige fluorescentiebeelden verkregen door het gebruik van GFP filter. Binnen de lijnen markeren tumor omgeving. Let op het ontbreken van heldere groene fluorescentie in sommige gebieden tumor op dag 26 die kunnen voortvloeien uit weefselnecrose of het ontwikkelen van nieuwe bloedvaten. Schaal bar, 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2. Evaluatie van de longen uitgezaaide Burden. (A) Foto's van de longen van muizen geïnjecteerd met 4T1 cellen in het uiervet pad met het oppervlak metastasen (pijlen).(B) Beelden van GFP + longmetastasen (heldere groene fluorescentie) die wordt verkregen door het gebruik van imaging microscoop. Schaal bar, 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 3. Digitale Histopathologie en confocale microscopie in beeldvorming van longmetastasen. (A) De scan van hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde longafdeling van muizen geïnjecteerd met 4T1 cellen in de mammae vetkussentje (donkerblauw weefsel metastasen). Schaal bar, 4 mm. (B) confocale microscopie van GFP + longmetastasen (heldere groene fluorescentie). Schaal bar, 200 pm. Klik hier om een grotere versio bekijkenn van deze figuur. 
Figuur 4. Kwantificering van longen uitgezaaide Burden door Digital histopathologie. (A) De scan van hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd longafdeling (donkerblauw weefsel-metastasen). (B) Het beeld van de in (A) longen gegenereerd door een trainbaar afbeelding histomorphology analyse-instrument (software- "Genie"). Rode kleur geeft de long gebieden geïdentificeerd door "Genie" als uitzaaiingen. Schaal bar, 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 5. Flowcytometrie Appkakkerlakken voor het vaststellen van alveolaire macrofagen in de longen. (A) De representativeflow cytometrydot plotsillustrating de gating strategie om CD45 + CD11b negatieve F4 / 80 + CD 11 c + alveolaire macrofagen te identificeren. (B) vertegenwoordiger flowcytometrie dot plotsillustrating effect van de controle of clodronaat liposomen op long alveolaire macrofagen. Getallen in percelen vertegenwoordigen percentages gated cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is ondersteund door het Ministerie van Defensie verlenen TSA 140.010 naar MK en BC 111.038 om standpunten en meningen van, en goedkeuringen door de auteur (s) MMM niet overeen met die van het Amerikaanse leger en het ministerie van Defensie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
