Protocol
Tutti gli studi su animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e del Comitato L'uso della Texas Tech University Health Sciences Center e seguito le linee guida indicate nella "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio", pubblicato dal National Institutes of Health. Utilizzare otto a dodici settimane di età topi BALB / c femmine che sono disponibili in commercio. Iniettare 1 x 10 5 4T1 o 1 x 10 5 4T1 cellule che esprimono GFP, che può essere acquistato da vari fornitori, nel cuscinetto di grasso mammaria.
1. Cultura di 4T1 e 4T1-cellule GFP & Preparazione del tumore delle cellule di sospensione per preparazioni iniettabili 14
- 4T1 e 4T1-GFP Cell Culture
NOTA: Eseguire tutte le operazioni che utilizzano soluzioni sterili in un flusso d'aria laminare (LAF) cabinet biosicurezza se non diversamente specificato.- Mantenere le cellule 4T1 e 4T1-GFP in terreno RPMI supplementato con 10% di calore inattivato siero fetale bovino e 100 U / ml di penicillinaG e 100 ug / ml di streptomicina solfato.
NOTA: Determinare un numero passaggio contando ogni tripsinizzazione e la placcatura delle cellule. È importante utilizzare cellule con lo stesso numero di passaggio tutti gli esperimenti di topo, come il numero di passaggi colpisce tumorigenicità delle cellule e potenziale metastatico. - Prima di iniezioni di cellule togliere il pallone T75 cm 2, che contiene le cellule tumorali a 80% di confluenza, da un mezzo incubatore e aspirare. Aggiungere 10 ml di PBS e ruotare la beuta delicatamente per lavare media residua, e quindi aspirare PBS.
- Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina con EDTA al pallone e inclinarlo di distribuire la soluzione uniformemente sulla superficie e incubare in un incubatore umidificato per 3 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Toccare il pallone per facilitare il distacco delle cellule e aggiungere 8 ml di terreno fresco. Pipetta su e giù più volte per interrompere grumi e ottenere una sospensione singola cella.
- celle di centrifugazione per 5 min. a 500 xg a RT.Aspirare il surnatante e lavare le cellule in 10 ml di PBS.
- Pipetta su e giù più volte per interrompere grumi e ottenere una sospensione singola cella. Prendete 100 ml di una sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando l'analizzatore di vitalità cellulare secondo le istruzioni del produttore.
- Calcolare il numero di cellule necessarie per tutte le iniezioni usando la formula: 10 5 cellule per topo x # dei topi utilizzati in un esperimento (sempre preparare le cellule in più per essere su un lato sicuro).
- cellule centrifuga come in 1.1.5. Rimuovere il surnatante con cellule aspirazione e risospendere in quantità di PBS fresco richiesto per ottenere una concentrazione cellulare finale di 1 x 10 6 cellule / ml. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino pronto per l'iniezione.
- Mantenere le cellule 4T1 e 4T1-GFP in terreno RPMI supplementato con 10% di calore inattivato siero fetale bovino e 100 U / ml di penicillinaG e 100 ug / ml di streptomicina solfato.
- 4T1 o 4T1-GFP cellule procedure di iniezione-topo
- Il giorno prima dell'iniezione delle cellule tumorali, anestetizzare topi in una camera di induzione con 3% isoflurano. Una volta che i topi sono addormentato e respirare regolarmente, posto tegli mouse su un tampone chirurgico con il naso all'interno del cono, e collegarlo al vaporizzatore isoflurano. Mantenere l'anestesia con il 2,5% isoflurano. Pizzicare la punta del mouse per assicurare che il mouse è anestetizzato.
- Applicare la crema di rimozione dei capelli usando un tampone di cotone al sito di iniezione (a destra pettorale cuscinetto di grasso mammaria) e attendere 2 minuti. Pulire il sito utilizzando un tovagliolo di carta bagnata, posizionare il mouse nella gabbia e monitorare un animale fino a quando non riprende conoscenza sufficiente a mantenere il decubito sternale.
- Il giorno di iniezione, anestetizzare i topi come in 1.2.2 e posizionare sul pad chirurgica.
- Agitare la provetta contenente le cellule tumorali per ottenere sospensione cellulare uniforme. Aspirare 100 ml di una sospensione di cellule, contenenti 1 x 10 5 cellule tumorali, in una siringa da insulina da 0,5 ml (29 g, 12,7 mm di lunghezza-ago).
- Sollevare la pelle utilizzando l'indice pollice e l'indice vicino al 2 ° e 3 ° capezzolo, inserire l'ago della siringa nel Mammarcuscinetto adiposo y appena sotto il terzo capezzolo sotto la pelle tra le dita e iniettare cellule lentamente per formare una bolla (iniezione sottocutanea).
- Posizionare il mouse nella gabbia dopo l'iniezione e monitorare come in 1.2.2.
- Monitoraggio crescita tumorale
- Misure pinza 14
NOTA: iniettato 4T1 o 4T1-GFP cellule formano tumore al seno aggressivo. Di solito i tumori palpabili appaiono ~ al giorno 4-5 dopo l'inoculazione di cellule. cellule 4T1-GFP formare tumori che crescono più lentamente e dare metastasi in seguito. Misurare il tumore da due a tre volte la settimana. Se lo stato clinico degli animali si deteriora, gli animali perdono più del 10% del peso corporeo, i tumori superano il 10% del peso corporeo o diventare ulcerata, eutanasia topi immediatamente.- Anestetizzare un mouse come in 1.2.1., Pesare, posto sul pad chirurgica e bagnare la zona con il 70% di etanolo.
- Palpare tumore nel sito di iniezione (4 - 5 giorni dopo l'inoculazione di cellule). <li> Misurare il diametro (D) e di diametro minore (d1) con una pinza.
- Calcolare il volume del tumore usando la formula del volume = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Monitorare il recupero del mouse dall'anestesia come in 1.2.2.
- Misure pinza 14
- Imaging (Solo per 4T1 cellule GFP)
- Anestetizzare il mouse come in 1.2.1. Posizionare il mouse su un palco mobile all'interno dello strumento di imaging. Mantenere l'anestesia attraverso il cono di naso.
- Accendere lo strumento di imaging e la sorgente di luce secondo le istruzioni del produttore.
- Sotto la "Acquisizione" scheda andare a "Illuminazione" e passare alla posizione vuota (senza filtro) per la luce bianca. Assicurarsi che il motore di luce è accesa e selezionare 'Trans' nella tabella luce.
- Nella scheda "Microscope", selezionare il filtro "Clear" emissione e l'ingrandimento 0.5X. Nella scheda "Camera", assicurarsi che la categorizzazione per la cattura è '1 x 1' e l'anteprima '4 x 4'. Clicca su anteprima per individuare il tumore in luce bianca, messa a fuoco per ottenere un'immagine chiara, e fare clic su cattura.
- Vai alla scheda di illuminazione e di cambiamento "Acquisizione" per filtrare 1 (filtro per GFP come da istruzioni del produttore). Nella scheda "Microscope", cambia filtro per le emissioni a "530/20 GF". acquisizione di immagini in anteprima e in un canale verde. Regolare il tempo di esposizione per ottenere la luminosità appropriata.
- Applicare pseudocolore all'immagine e salvare nella cartella appropriata (Figura 1).
2. intranasale somministrazione di liposomi 10
NOTA: Eseguire tutte le operazioni che utilizzano soluzioni sterili in un flusso d'aria laminare (LAF) cabinet Bio-sicurezza se non diversamente specificato.
- Il giorno 6 dopo l'iniezione delle cellule tumorali anestetizzare topi come in 1.2.1.
- Agitare la sospensione clodronato o il controllo liposomi (PBS) da parte del produttore. Prendere 60 microlitri liposomi suspension utilizzando sterili punta della pipetta.
- Rilasciare lentamente la soluzione di liposomi (5 ml ogni volta) in prossimità delle narici che permettono il mouse per respirare nella soluzione, ripetere fino a quando viene somministrata l'intera dose di 60 ml.
- Sia il mouse riprenda conoscenza prima di metterlo di nuovo in gabbia.
- amministrazione liposomi Ripetere ogni 3 giorni fino al topi vengono sacrificati. Non somministrare liposomi in un giorno di sacrificio.
3. Il sacrificio del mouse e del tessuto Collection
NOTA: L'uso autoclave e strumenti sterili per la dissezione del mouse. Euthanize topi mentre sotto anestesia attraverso il dissanguamento e rimozione degli organi vitali.
- Il giorno 22 (Per 4T1 cellule) o il giorno 26 (per le cellule 4T1-GFP) dopo l'iniezione delle cellule tumorali anestetizzare il mouse come in 1.2.1. e posizionare sul pad chirurgica con un cono collegato al vaporizzatore, mantenere l'anestesia come in 1.2.1. Pizzicare una delle dita per garantire che il mOuse è incosciente.
- Pin le dita dei piedi utilizzando aghi alla scheda di dissezione. Spruzzare etanolo sulla pelle mouse.
- Sollevare la pelle utilizzando una pinza e fare un'incisione con le forbici chirurgiche. esporre Lentamente il peritoneo e continuare a tagliare la pelle attraverso il torace fino al collo.
- Utilizzando le forbici chirurgiche fare un'incisione nel peritoneo ed esporre con cura gli organi con le punte di cotone evitando danni ai vasi sanguigni.
- Spostare gli organi di lato ed esporre la vena cava inferiore. Forare la vena e raccogliere il sangue con la siringa da insulina 29 G. Posizionare sangue raccolto nel tubo e lasciare in ghiaccio per ulteriori elaborazioni.
- Tagliare il diaframma per esporre i Gabbia toracica, i polmoni e il cuore. Lentamente tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati con la taglierina dell'osso e sollevare la parte superiore della gabbia toracica. Afferra cuore con una pinza e tagliare il tessuto connettivo che collega il cuore e polmoni alla cavità toracica.
- Posizionare i polmoni in piccola quantità di PBS in 60 millimetricapsula di Petri sul ghiaccio fino al momento per l'imaging e il successivo trattamento di sezioni congelate per microscopia immunofluorescenza o istologia di routine [compresi ematossilina e eosina (H & E) colorazione].
4. polmone metastasi valutazione
- Contare e segnando metastasi di superficie
- Porre la capsula di Petri con i polmoni sotto il microscopio di dissezione. Mettere a fuoco per ottenere una visione chiara della superficie del polmone.
- Utilizzando un microscopio dissezione osservare la superficie del polmone. Contare metastasi sui lati anteriore e posteriore di entrambi i polmoni.
NOTA: Il polmone normale è biancastro o rosato e porosa ed ha una spugna come la struttura. Metastasi 4T1 sono solidi e non porosa, a volte sembra essere simile ad una goccia di liquido (Figura 2A).
- l'imaging polmonare
- Porre la capsula di Petri con i polmoni sul palco mobile all'interno dello strumento di imaging.
- Accendere lo strumento e laBioLite fonte multispettrale. Aprire il software. Nella scheda, "Acquisizione", andare a "illuminazione", e passare alla posizione vuota (senza filtro) per la luce bianca. Luce del motore -> ON, Tavolo luminoso -> Epi. Sotto il "microscopio" Selezionare la scheda 'Clear' filtro per le emissioni e l'ingrandimento 1.66X. Nella scheda "Camera", assicurarsi che la categorizzazione per la cattura è '1 x 1' e l'anteprima '4 x 4'.
- Fare clic su Anteprima e concentrarsi per avere un quadro chiaro di polmoni in luce bianca e fare clic su cattura.
- Vai alla scheda "Acquisizione" e variazione della frequenza di 1 (filtro per GFP come da istruzioni del produttore). Nella scheda "Microscope", cambia filtro per le emissioni a "530/20 GF". acquisizione di immagini in anteprima e in un canale verde. Regolare il tempo di esposizione per ottenere la luminosità appropriata.
- Applicare pseudocolore all'immagine e salvare nella cartella appropriata.
- Vibrazione polmoni per ottenere l'immagine del lato in modo simile. Questo procedure genera immagini di metastasi GFP-positive che può essere ulteriormente quantificati utilizzando il software appropriato (Figura 2B) 14.
- immunofluorescenza Microscopia
- Fissare polmoni in 4% paraformaldeide, a 4 ° C per 4 ore in scuro.
- Lavare il tessuto due volte con 10 ml di PBS per 5 minuti per rimuovere completamente il fissativo. Trasferimento al 18% di saccarosio in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
- Rimuovere il tessuto dal saccarosio e tamponare la parte in eccesso.
- Prendete un cryomold, coprire lo strato inferiore con il mezzo ottobre Posizionare il tessuto sul supporto ottobre Riempire lo stampo con il mezzo di Office per ricoprire completamente il tessuto e posto su ghiaccio secco.
- blocco Conservare a -80 ° C fino sezionamento.
- Preparare 5 sezioni micron di spessore con un criostato e posto su slitte cariche.
- Conservare i vetrini utilizzati in -80 ° C fino ad ulteriore utilizzo.
- Far asciugare i vetrini per 7 minuti. e lavare con PBS per rimuovere ottobre Wipe la slitta con i tessuti o tovagliolo di carta per rimuovere l'eccesso di acqua, montaggio scivola copertura con terreno contenente DAPI montaggio e visualizzare con filtro GFP sotto il microscopio.
- Quantificare metastasi GFP (Figura 3a) con l'uso di software appropriato 14.
- Istologia e Patologia Digitale
- Fare clic sul pulsante di richiamo manuale nella scheda di partenza e attendere che la diapositiva tenendo cremagliera per espellere dallo scanner.
- Prendere la sezione di tessuto H & E macchiato, pulirlo con il tessuto per rimuovere lo sporco, e posizionarlo in modo sicuro nel portavetrini tenuta.
- Inserire la descrizione di scorrimento nella finestra spuntato-up.
- Selezionare la scheda Area di scansione nella finestra di console di imaging SS e regolare il quadrato verde per definire la regione di interesse (ROI) da sottoporre a scansione.
- Trascinare il diamante blu di calibrazione per una parte chiara della diapositiva, dove il tessuto è assente, tuttavia, all'interno del ROI.
- Quindi, selezionare la messa a fuoco Points scheda e fare clic sul pulsante di selezione automatica per ottenere diversi punti di messa a fuoco (giallo segni più) sul tessuto nella ROI.
- Se necessario, inserire i punti di messa a fuoco manualmente ulteriori facendo doppio clic all'interno del ROI.
- Procedere alla scheda calibrare e selezionare il pulsante di calibrazione per iniziare la calibrazione di scorrimento nella parte blu punta di diamante di calibrazione. Dopo la calibrazione viene completata verrà visualizzata l'immagine dal punto di taratura.
- Ispezionare questa immagine per assicurarsi che sia chiaro e privo di sporcizia o artefatti.
- Procedere alla scheda Scansione e selezionare Start Scan per avviare la scansione del ROI. Sezione istologica scansito viene convertito in una diapositiva digitale (Figura 3B e 4A)
- Quantificare onere metastatico come descritto in precedenza (Figura 4B) 14.
5. Citometria a flusso (FACS) Analisi di alveolare macrofagi nei polmoni
- Preparazione della singola cella suspensisopra
- Dopo l'imaging e il conteggio delle metastasi, lavare i polmoni con PBS sterile e il luogo per la piastra di Petri. Fare 1 - 2 mm pezzi dei polmoni con le forbici e pinze chirurgiche.
- Trasferire i pezzi polmonari al tubo da 15 ml con 3 ml del tampone di digestione contenente 1 mg / ml di collagenasi P, 0.04mg / ml DNasi I, e 10 ug / ml di mezzo RPMI tripsina inibitore disciolto (sterile).
- Incubare il tubo conico su un agitatore rotante in incubatrice a 37 ° C per 40 min.
- Rimuovere il tubo conico dal termostato e pipetta la soluzione su e giù per dissociare il tessuto.
- Far passare la soluzione attraverso il filtro 40 micron per evitare grumi e ottenere una sospensione singola cella. Se necessario, a disintegrarsi meglio il tessuto stampa tessuto digerito contro il filtro cella con l'aiuto di uno stantuffo della siringa.
- Quando è stato raggiunto una sospensione singola cella, raccogliere le cellule per centrifugazione e la lisi dei globuli rossi con2 ml di tampone ACK per 10 minuti a temperatura ambiente. Poi, lavare un pellet due volte in 8 ml di RPMI.
- Risospendere le cellule in 3 ml del mezzo RPMI completo e procedere alla cella il conteggio utilizzando l'analizzatore di vitalità cellulare secondo le istruzioni del produttore.
- La colorazione di cellule polmonari per marcatori di superficie
NOTA: Eseguire tutte le fasi di incubazione a 4 ° C. Piastra centrifugare a 500 xg e 4 ° C.- Pipettare 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri di tampone FACS (1% FBS in PBS) a singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti V-bottom. Utilizzando un piatto ben 96 V-parte inferiore facilita la consegna di campioni multipli.
- Pre-incubare la sospensione cellulare con 1 mg mouse Fc Block purificato anti-topo CD16 / CD32 in 100 ml di tampone FACS per 15 min. Centrifugare il 96 pozzetti V-parte inferiore per far sedimentare le cellule e rimuovere il surnatante girando la piastra e lasciando lo scarico soluzione.
- Per la colorazione superficiale, in anticipo, diluire gli anticorpi a Murine antigeni in un tubo (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml in tampone FACS contenente 10 ug / ml di Fc blocco CD16 / CD32 anticorpo.
NOTA: Questo insieme di anticorpi è utile per l'identificazione e la valutazione di un stato funzionale dei macrofagi alveolari e cellule dendritiche. - Aggiungere 100 ml di anticorpi diluiti (master mix) ai pozzetti della piastra da 96 pozzetti V-parte inferiore e incubare a 4 ° C per 30 minuti.
- Centrifugare la piastra a pellet cellule e rimuovere il surnatante come in 5.2.2. Lavare le cellule con 200 ml di tampone FACS, centrifugare a 500 g per 5 min. Rimuovere il surnatante come in 5.2.2. e risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS.
- Centrifugare la piastra a pellet cellule e aggiungere la vitalità colorante diluito in PBS (1: 1.000). Incubare per 20 minuti a 4 ° C. </ Li>
- Centrifugare la piastra a pellet cellule e rimuovere il surnatante come in 5.2.2. Lavare con 200 ml di PBS e centrifugare nuovamente la piastra.
- Risospendere le cellule in 100 ml di 1% paraformaldeide e conservare a 4 ° C, fino all'acquisizione da parte dello strumento FACS. Prima di sospensioni cellulari di trasferimento acquisizione ai tubi in polipropilene FACS.
6. Analisi dei dati FACS: Strategie Gating e l'identificazione di sottopopolazioni cellulari
- Eseguire l'analisi FACS come riportato in precedenza 10. Porta acquisito cellule / eventi in base forward (FSC) e side-scatter (SSC); e poi porta dal vivo e CD45 + cellule. Per alveolari di identificazione dei macrofagi, cancello CD11b-negativi e poi CD11c + F4 / 80 + cellule. (Figura 5A).
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Representative Results
L'iniezione di cellule tumorali 4T1-GFP nel tappetino grasso mammario porta alla formazione di tumori murini (Figura 1A) che ricapitolano la diffusione metastatica del carcinoma mammario, come metastasi stanno rapidamente formate nei polmoni (Figura 2), fegato, ossa e il cervello di topi 11. La trasfezione stabile di 4T1 cellule con GFP facilita il controllo della crescita tumorale (Figura 1B), il monitoraggio cellule tumorali metastasi e quantificare l'onere metastatico (Figura 2B, 3B). Inoltre, l'imaging dei tumori fornisce le informazioni aggiuntive riguardanti diverse caratteristiche patologiche come la morte delle cellule tumorali e sistema vascolare del tumore. Il brillante fluorescenza verde (Figura 1B-i pannelli centrali) indica l'espressione alta GFP, che di solito è associato con il parenchima tumorale vitale. Considerando che la mancanza di GFP in alcune aree tumorali può indicare la morte delle cellule tumorali (
Poiché la maggior parte delle metastasi polmonari sono situati sulla superficie polmonare, possono essere osservati sotto la normale microscopio di dissezione. Le lesioni metastatiche sono solitamente chiaramente distinti dal parenchima circostante (Figura 2A). Per verificare osservazioni lordi e valutare metastasi che sono più profonde nel parenchima polmonare, imaging fluorescente polmoni può essere eseguita (Figura 2B), se le cellule esprimenti GFP sono stati usati per l'iniezione. Anche se autofluorescenza polmone è chiaramente visibile nelle immagini, luminosa a fluorescenza GFP-derivato facilita metastasi distintivi di parenchima polmonare circostante. In alternativa, l'istologia di routine (Figura 3A e la Figura 4A) in combinazione con algoritmi patologia digitale ( Multicolor FACS offre opportunità di caratterizzare le popolazioni di cellule, anche rari attraverso l'uso della superficie cellulare multipolare e / o marcatori citoplasmatici contemporaneamente. Macrofagi alveolari sono caratterizzati dalla mancanza di espressione CD11b ed espressione di F4 / 80 e CD11c (Figura 5). L'approccio tipico per identificare queste cellule dal flusso coinvolge citometria a: (i) la selezione di popolazione di cellule basato sulla morfologia descritta da proprietà lato scatter in avanti e, (ii) la selezione di cellule seguita da (iii) gating di cellule negative CD11b vitali CD45 +, e (iv) gating di cellule coexpressing F4 / 80 e CD11c (Figura 5A, B). 
Figura 1. Monitoraggio crescita tumorale Tttraverso Imaging degli animali. (A) di luce immagini bianche del mouse iniettati con le cellule che esprimono GFP nel cuscinetto di grasso mammaria in diversi momenti dopo l'iniezione delle cellule tumorali. (B) Corrispondente immagini fluorescenti ottenute attraverso l'uso di filtri GFP. Le linee tratteggiate segnano zona tumorale. Si noti la mancanza di brillante fluorescenza verde in alcune aree di tumore il giorno 26 che possono derivare da necrosi dei tessuti o neovascolarizzazione in via di sviluppo. Barra di scala, da 10 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2. Valutazione del polmone metastatico Burden. (A) Immagini dei polmoni di topi iniettati con cellule 4T1 nel pad grasso mammario con metastasi superficiali (frecce).(B) di GFP + polmonari metastasi (brillante fluorescenza verde) ottenute attraverso l'uso di immagini al microscopio. Barra di scala, da 10 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3. Digital istopatologia e microscopia confocale in Imaging del polmone metastasi. (A) La scansione della sezione di polmone ematossilina e eosina (H & E) macchiato da topi iniettati con 4T1 cellule nel cuscinetto di grasso mammaria (blu scuro tessuto-metastasi). Barra di scala, 4 mm. (B) La microscopia confocale di GFP + polmonari metastasi (brillante fluorescenza verde). Barra della scala, 200 micron. Cliccate qui per visualizzare un versio più granden di questa figura. 
Figura 4. Quantificazione del polmone metastatico Burden da Digital istopatologia. (A) La scansione di ematossilina e eosina (H & E) sezione del polmone colorate (blu scuro tessuto-metastasi). (B) L'immagine dei polmoni mostrate in (A) generato da un addestrabile strumento di analisi delle immagini istomorfologia (Software-"Genie"). Il colore rosso indica le aree del polmone identificate da "Genie" come metastasi. Barra di scala, 5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 5. Citometria a Flusso Appscarafaggi per l'identificazione alveolare macrofagi nei polmoni. (A) La representativeflow cytometrydot plotsillustrating la strategia di gating per identificare CD45 + CD11b negativo F4 / 80 + macrofagi alveolari CD11c +. (B) citometria a flusso Rappresentante dot plotsillustrating effetto di controllo o liposomi clodronato sui macrofagi alveolari dei polmoni. I numeri in trame rappresentano percentuali di cellule gated. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento della Difesa concedere TSA 140010 per MK e BC 111.038 al mmm vista e le opinioni, e avalli da parte dell'autore (s) non riflettono quelli dell'esercito degli Stati Uniti o il Dipartimento della Difesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
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