Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من مركز تكساس للتكنولوجيا جامعة العلوم الصحية وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" نشرت من قبل المعاهد الوطنية للصحة. استخدام ثمانية إلى اثني عشر الاسبوع القديمة الإناث الفئران BALB / ج المتوفرة تجاريا. حقن 1 × 10 5 4T1 أو 1 × 10 5 4T1 الخلايا معربا عن GFP، والتي يمكن شراؤها من مختلف البائعين، في لوحة الدهون الثديية.
1. ثقافة 4T1 و4T1-GFP الخلايا وإعداد ورم تعليق خلية لحقن 14
- 4T1 و4T1-GFP خلية ثقافة
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ما لم ينص على خلاف ذلك.- الحفاظ على 4T1 و4T1-GFP الخلايا في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100 U / البنسلين ملG و 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتوميسين.
ملاحظة: تحديد عدد مرور عن طريق عد كل trypsinization والطلاء من الخلايا. من المهم أن استخدام الخلايا التي تحتوي على نفس العدد بمرور جميع التجارب الماوس، وعدد من الممرات يؤثر tumorigenicity الخلايا وإمكانية النقيلي. - قبل حقن الخلايا إزالة T75 سم 2 قارورة تحتوي على الخلايا السرطانية بنسبة 80٪ confluency، من وسيلة الحاضنة ونضح. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وتدوير القارورة بلطف لتغسل ما تبقى متوسطة، ثم نضح برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين مع EDTA إلى القارورة والميل إلى توزيع حل موحد على السطح واحتضان في حاضنة مرطب لمدة 3 دقائق في 37 مئوية مع 5٪ CO 2.
- اضغط على قارورة لتسهيل مفرزة من الخلايا وإضافة 8 مل من المتوسط الطازجة. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل والحصول على تعليق خلية واحدة.
- خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. في 500 x ج في RT.نضح طاف وغسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل كتل والحصول على تعليق خلية واحدة. أخذ 100 ميكرولتر من تعليق خلية وعدد الخلايا باستخدام محلل بقاء الخلية حسب تعليمات الشركة الصانعة.
- حساب عدد الخلايا المطلوبة لجميع الحقن باستخدام صيغة: 10 5 خلايا لكل الماوس س # الفئران المستخدمة في تجربة (دائما إعداد الخلايا الإضافية لتكون على الجانب الآمن).
- خلايا الطرد المركزي كما هو الحال في 1.1.5. إزالة طاف من خلال الطموح و resuspend الخلايا في كمية من برنامج تلفزيوني جديد المطلوبة للحصول على تركيز خلية النهائي من 1 × 10 6 خلية / مل. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى جاهزة للحقن.
- الحفاظ على 4T1 و4T1-GFP الخلايا في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100 U / البنسلين ملG و 100 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتوميسين.
- 4T1 أو 4T1-GFP خلية إجراءات حقن الفأر
- قبل يوم واحد حقن الخلايا السرطانية، تخدير الفئران في غرفة الاستقراء مع 3٪ الأيزوفلورين. مرة واحدة الفئران هي نائمة وتتنفس بانتظام، مكان رانه الماوس على وسادة الجراحية مع الأنف داخل مخروط الأنف، وذلك لربط المرذاذ الأيزوفلورين. الحفاظ على التخدير مع 2.5٪ الأيزوفلورين. قرصة اصبع القدم الماوس للتأكد من أن الفأر هو تخدير.
- تطبيق كريم إزالة الشعر باستخدام قطعة من القطن لموقع الحقن (الحق الصدرية الثدي وسادة دهنية) والانتظار لمدة 2 دقيقة. تنظيف الموقع باستخدام منشفة ورقية مبللة، ضع الماوس مرة أخرى في قفص ومراقبة حيوان حتى يستعيد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- في يوم من الحقن، وتخدير الفئران كما هو الحال في 1.2.2 ووضع على لوحة العمليات الجراحية.
- دوامة أنبوب يحتوي على الخلايا السرطانية للحصول على تعليق خلية موحد. نضح 100 ميكرولتر من تعليق خلية، التي تحتوي على 1 × 10 5 الخلايا السرطانية، إلى حقنة الأنسولين 0.5 مل (29 G، 12.7 ملم طول إبرة).
- رفع الجلد باستخدام مؤشر الإبهام والإصبع بالقرب من الثانية 2 و 3 الثالثة الحلمة، إدراج إبرة الحقنة في معمر الذي كان ينتظرذ منصة الدهون أسفل الحلمة الثالثة تحت الجلد بين الأصابع وحقن الخلايا ببطء لتشكيل فقاعة (حقن تحت الجلد).
- ضع الماوس مرة أخرى في قفص بعد الحقن ومراقبة كما هو الحال في 1.2.2.
- نمو الأورام المراقبة
- القياسات الفرجار 14
ملاحظة: المصبوبة 4T1 أو 4T1-GFP الخلايا تشكل العدوانية ورم الثدي. وعادة ما تظهر الأورام واضح ~ في يوم 4-5 بعد التلقيح الخلية. خلايا 4T1-GFP تشكل الأورام التي تنمو أبطأ وإعطاء الانبثاث في وقت لاحق. قياس الورم مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع. إذا الحالة السريرية للحيوانات تدهور والحيوانات تفقد أكثر من 10٪ من وزن الجسم، والأورام تتجاوز 10٪ من وزن الجسم، أو أن تصبح متقرحة، الموت ببطء الفئران على الفور.- تخدير الفأر كما هو الحال في 1.2.1.، وزن، وضعها على لوحة الجراحية والرطب المنطقة مع 70٪ من الإيثانول.
- جس الورم في موقع الحقن (4 - 5 أيام بعد التلقيح الخلية). <لى> قياس أكبر قطر (D) وأصغر قطره (D1) مع الفرجار.
- حساب حجم الورم باستخدام الصيغة حجم = (DX D1 X D1) / 2 مم 3. رصد الانتعاش الماوس من التخدير كما هو الحال في 1.2.2.
- القياسات الفرجار 14
- التصوير (فقط لل4T1 الخلايا GFP)
- تخدير الماوس كما هو الحال في 1.2.1. ضع الماوس على مرحلة المنقولة داخل الصك التصوير. الحفاظ على التخدير من خلال مخروط الأنف.
- تشغيل أداة التصوير ومصدر الضوء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحت عنوان "شراء" علامة التبويب انتقل إلى "الإضاءة" والتحول إلى موقف فارغة (لا يوجد فلتر) للضوء الأبيض. تأكد من أن المحرك الضوء على واختر "ترانس" في جدول خفيف.
- تحت علامة التبويب "مجهر"، حدد "مسح" تصفية الانبعاثات و0.5X التكبير. في علامة التبويب "الكاميرا"، تأكد من أن binning لالتقاط هو "1 × 1" والمعاينة "4 × 4". انقر على معاينة لتحديد موقع الورم في الضوء الأبيض، والتركيز للحصول على صورة واضحة، وانقر القبض عليه.
- انتقل إلى "شراء" علامة التبويب وتغيير الإضاءة لتصفية 1 (تصفية GFP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). في علامة التبويب "مجهر"، تغيير فلتر الانبعاثات إلى "GF 530/20". معاينة والتقاط الصور في قناة الخضراء. ضبط وقت التعرض للحصول على سطوع مناسبة.
- تطبيق pseudocolor إلى الصورة وحفظها في المجلد المناسب (الشكل 1).
2. إدارة الطريق الأنفي من الليبوزومات 10
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الحلول العقيمة في تدفق الهواء الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، ما لم ينص على خلاف ذلك.
- في يوم 6 بعد حقن الخلايا السرطانية تخدير الفئران كما هو الحال في 1.2.1.
- دوامة clodronate أو التحكم (PBS) الحويصلية تعليق تم الحصول عليها من الشركة المصنعة. يستغرق 60 ميكرولتر الحويصلية الصورةuspension باستخدام معقم طرف ماصة.
- ببطء الافراج عن حل الحويصلية (5 ميكرولتر في كل مرة) بالقرب من الخياشيم مما يسمح الماوس للتنفس في الحل، كرر حتى يدار جرعة كاملة من 60 ميكرولتر.
- دع الماوس يستعيد وعيه قبل وضعه مرة أخرى في قفص.
- إدارة الحويصلية كرر وضحى كل 3 أيام حتى الفئران. لا إدارة الجسيمات الشحمية في يوم النحر.
3. التضحية ماوس ومجموعة الأنسجة
ملاحظة: استخدام تعقيمها وأدوات معقمة للتشريح الفأر. الموت ببطء الفئران وتحت التخدير عن طريق استنزاف وإزالة الأعضاء الحيوية.
- في يوم 22 (ل4T1 الخلايا) أو يوم 26 (للخلايا 4T1-GFP) بعد حقن الخلايا السرطانية تخدير الماوس كما هو الحال في 1.2.1. ووضع على لوحة الجراحية مع مخروط الأنف متصلة المرذاذ، والحفاظ على التخدير كما هو الحال في 1.2.1. قرصة واحدة من أصابع القدم للتأكد من أن م[أوس] فاقد الوعي.
- دبوس أصابع باستخدام الإبر إلى لوحة تشريح. رذاذ الايثانول على الجلد الماوس.
- رفع الجلد باستخدام ملقط وجعل شق مع مقص جراحي. ببطء فضح الصفاق ومواصلة قطع الجلد من خلال القفص الصدري حتى الرقبة.
- باستخدام مقص جراحي إجراء شق في الغشاء البريتوني وفضح بعناية الأجهزة مع نصائح القطن تجنب الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية.
- نقل الأجهزة إلى جانب واحد وفضح الوريد الأجوف السفلي. ثقب الوريد وجمع الدم مع حقنة الانسولين 29 G. وضع الدم التي تم جمعها في أنبوب وترك على الجليد لمزيد من المعالجة.
- قطع الحجاب الحاجز لفضح القفص الصدري والرئتين والقلب. خفض ببطء القفص الصدري على كلا الجانبين باستخدام قطع العظام ورفع الجزء العلوي من القفص الصدري. الاستيلاء على القلب مع ملقط وقطع النسيج الضام الذي يربط بين القلب والرئتين إلى تجويف الصدر.
- وضع الرئتين في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني في 60 ملمطبق بتري على الجليد حتى جاهزة للتصوير ومزيد من المعالجة لأقسام المجمدة للفحص المجهري مناعي أو الأنسجة الروتينية [بما في ذلك الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ].
4. الانبثاث تقييم الرئة
- عد وتسجيل النقاط الانبثاث السطحية
- وضع طبق بتري مع الرئتين تحت المجهر تشريح. التركيز على الحصول على رؤية واضحة للسطح الرئة.
- باستخدام مجهر تشريح مراقبة سطح الرئة. عدد الانبثاث على الأمامي والخلفي الجانبين من كلا الرئتين.
ملاحظة: إن رئة طبيعية مبيضة أو وردي والتي يسهل اختراقها ولها اسفنجة مثل هيكل. الانبثاث 4T1 صلبة وغير مسامية، يبدو في بعض الأحيان أن تكون مماثلة لقطرة من السائل (الشكل 2A).
- تصوير الرئة
- وضع طبق بتري مع الرئتين على المسرح المنقولة داخل الصك التصوير.
- بدوره على الصك وبيولايت مصدر متعدد الأطياف. فتح البرنامج. تحت علامة التبويب "الاستحواذ"، انتقل إلى "الإضاءة"، والتحول إلى موقف فارغة (لا يوجد فلتر) للضوء الأبيض. محرك خفيف -> ON، الجدول ضوء -> برنامج التحصين الموسع. تحت "مجهر" التبويب اختر 'مسح' تصفية الانبعاثات و1.66X التكبير. في علامة التبويب "الكاميرا"، تأكد من أن binning لالتقاط هو "1 × 1" والمعاينة "4 × 4".
- انقر على معاينة والتركيز للحصول على صورة واضحة من الرئتين في الضوء الأبيض وانقر القبض عليه.
- انتقل إلى "شراء" علامة التبويب والتغيير إلى تصفية 1 (تصفية GFP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). في علامة التبويب "مجهر"، تغيير فلتر الانبعاثات إلى "GF 530/20". معاينة والتقاط الصور في قناة الخضراء. ضبط وقت التعرض للحصول على سطوع مناسبة.
- تطبيق pseudocolor إلى الصورة وحفظها في المجلد المناسب.
- الوجه الرئتين للحصول على صورة من الجانب الآخر بنفس الطريقة. هذا بروكedure يولد صورا لالانبثاث-GFP الإيجابي الذي يمكن زيادة كميا باستخدام البرنامج المناسب (الشكل 2B) 14.
- مناعي المجهر
- إصلاح الرئتين في 4٪ امتصاص العرق، في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في الظلام.
- يغسل النسيج مرتين مع 10 مل برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لإزالة تثبيتي. نقل إلى 18٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
- إزالة الأنسجة من السكروز وربت من أي فائض.
- اتخاذ cryomold، وتغطي الطبقة السفلية مع أكتوبر المتوسطة. وضع الأنسجة في أكتوبر المتوسطة. ملء القالب مع أكتوبر المتوسطة لتغطية كامل الأنسجة ومكان على الثلج الجاف.
- كتلة مخزن في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء.
- إعداد 5 ميكرون أبواب سميكة مع ناظم البرد ومكان على الشرائح المشحونة.
- تخزين الشرائح غير المستخدمة في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
- الهواء الجاف الشرائح لمدة 7 دقائق. ويغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة أكتوبر WIPالبريد الشريحة مع نسيج أو منشفة ورقية لإزالة فائض من المياه، جبل زلات غطاء مع تصاعد المتوسط تحتوي على دابي وتصور مع مرشح GFP تحت المجهر.
- تحديد الانبثاث GFP (الشكل 3A) باستخدام البرنامج المناسب (14).
- علم الأنسجة وعلم الأمراض الرقمية
- انقر على زر تحميل يدوية تحت علامة التبويب البداية وانتظر الشريحة عقد رف لإخراج من الماسح الضوئي.
- خذ قسم الأنسجة H & E الملون، وتنظيفه مع النسيج لإزالة أية أوساخ، ووضعه بشكل آمن في رف الشريحة القابضة.
- أدخل وصف الشرائح في الإطار برزت المتابعة.
- حدد علامة التبويب مسح المنطقة على إطار وحدة التحكم SS التصوير وضبط الساحة الخضراء لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي يتم مسحها ضوئيا.
- اسحب معايرة الماس الأزرق لجزء واضح من الشريحة، حيث الأنسجة غير موجودة، ومع ذلك، في العائد على الاستثمار.
- بعد ذلك، حدد التركيز Points التبويب وانقر على زر لصناعة السيارات حدد للحصول على عدة نقاط التركيز (علامة زائد الصفراء) على الأنسجة في العائد على الاستثمار.
- إذا لزم الأمر، ضع نقطة التركيز إضافية يدويا عن طريق النقر المزدوج في العائد على الاستثمار.
- انتقل إلى علامة التبويب معايرة وحدد زر معايرة لبدء المعايرة الشرائح عند نقطة المعايرة الماس الأزرق. وبعد الانتهاء من معايرة يتم عرض صورة من وجهة المعايرة.
- تفقد هذه الصورة لضمان أن تكون واضحة وخالية من الأوساخ أو التحف.
- انتقل إلى علامة التبويب مسح ضوئي واختر بدء المسح الضوئي لبدء المسح الضوئي من العائد على الاستثمار. يتم تحويل قسم النسيجي الممسوحة ضوئيا إلى شريحة رقمية (الشكل 3B و 4A)
- قياس العبء المنتشر كما هو موضح سابقا (الشكل 4B) 14.
5. التدفق الخلوي (FACS) تحليل السنخية الضامة في الرئتين
- إعداد أنظمة التعليق خلية واحدةعلى
- بعد التصوير والعد الانبثاث، وغسل الرئتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ووضع على طبق بيتري. جعل 1 - 2 قطعة ملم من الرئتين باستخدام مقص جراحي وملقط.
- ونقل القطع الرئة إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 3 مل من العازلة الهضم تحتوي على 1 ملغ / مل كولاجيناز P، 0.04mg / مل الدناز الأول، و 10 ميكروغرام / مل مثبط التربسين حل المتوسطة RPMI (عقيمة).
- احتضان أنبوب مخروطي على شاكر الدورية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
- إزالة المخروطية أنبوب من الحاضنة وماصة الحل صعودا وهبوطا لفصل الأنسجة.
- تمرير حل من خلال مصفاة 40 ميكرون لتجنب كتل والحصول على تعليق خلية واحدة. إذا لزم الأمر، لتتفكك أفضل للهضم أنسجة الصحافة الأنسجة ضد مصفاة الخلية بمساعدة الغواص حقنة.
- عندما تم التوصل إلى تعليق خلية واحدة، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وليز خلايا الدم الحمراء مع2 مل من العازلة ACK لمدة 10 دقيقة في RT. ثم، ويغسل بيليه مرتين في 8 مل من RPMI.
- خلايا Resuspend في 3 مل من المتوسط RPMI الكامل والمضي قدما إلى الخلية عد باستخدام محلل بقاء الخلية حسب تعليمات الشركة الصانعة.
- تلطيخ للخلايا الرئة لعلامات السطحية
ملاحظة: تنفيذ جميع حضانات في 4 درجات مئوية. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج و 4 درجات مئوية.- ماصة 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر من العازلة FACS (1٪ FBS في برنامج تلفزيوني) إلى الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا-V السفلي. باستخدام 96 لوحة جيدا-V أسفل يسهل تسليم عينات متعددة.
- قبل احتضان تعليق الخلية مع 1 ميكروغرام ماوس التيسير كتلة تنقية مكافحة فأر CD16 / CD32 في 100 ميكرولتر من FACS العازلة لمدة 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي ال 96 لوحة جيدا-V السفلي لتكوير الخلايا وإزالة طاف بواسطة التقليب لوحة والسماح للاستنزاف حل.
- لتلطيخ السطح، مقدما، يخفف من الأجسام المضادة لmurinمستضدات الإلكترونية في أنبوب واحد (مزيج الرئيسي): BV605 CD45 (30 F11)، والمؤسسة العامة CD11b (M1 / 70)، والمؤسسة العامة / Cy7 F4 / 80 (BM8)، APC / Cy7 CD11c و(N418)، PerCPCy5.5 أنا A / أنا E (MHCII) (M5 / 114،152)، والمؤسسة العامة CD80 (16-10A1)، AF 647 CD86 (GL-1) إلى التركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل في المخزن FACS تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من التيسير كتلة CD16 / CD32 الأجسام المضادة.
ملاحظة: هذه مجموعة من الأجسام المضادة هو مفيد لتحديد وتقييم والحالة الوظيفية للالضامة السنخية والخلايا الجذعية. - إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف (مزيج الرئيسي) إلى الآبار من 96 لوحة جيدا-V القاع واحتضان عند 4 مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من FACS العازلة، الطرد المركزي في 500 غ لمدة 5 دقائق. إزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإضافة صبغة الجدوى مخففة في برنامج تلفزيوني (1: 1000). احتضان لمدة 20 دقيقة على 4 ج. </ لى>
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لتكوير الخلايا وإزالة طاف كما هو الحال في 5.2.2. يغسل مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لوحة مرة أخرى.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 1٪ امتصاص العرق وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى اكتساب أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية. قبل تعليق خلية نقل الاستحواذ على أنابيب البولي بروبلين نظام مراقبة الأصول الميدانية.
6. تحليل بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية: استراتيجيات المحاصرة وتحديد الفئات السكانية خلية
- لتحليل FACS كما ذكرت سابقا 10. حصلت بوابة خلية / الأحداث على أساس forward- (FSC) والجانب مبعثر (SSC)؛ ثم بوابة الحية وCD45 + الخلايا. لتحديد بلعم السنخية، بوابة CD11b سلبية ومن ثم الخلايا CD11c و+ F4 / 80 +. (الشكل 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حقن الخلايا السرطانية 4T1-GFP في لوحة الدهون الثديية يؤدي إلى تكوين أورام الماوس (الشكل 1A) أن ألخص انتشار النقيلي سرطان الثدي البشري، كما تتشكل الانبثاث بسرعة في الرئتين (الشكل 2)، والكبد والعظام ودماغ الفئران 11. ترنسفكأيشن مستقرة من 4T1 الخلايا مع GFP يسهل رصد نمو الورم (الشكل 1B)، وتتبع المتفاقمة الخلايا السرطانية وقياس العبء المنتشر (الشكل 2B، 3B). وبالإضافة إلى ذلك، والتصوير الأورام يوفر معلومات إضافية بشأن العديد من الميزات المرضية مثل موت الخلايا السرطانية والأوعية الدموية للورم. مضان أخضر لامع (الشكل 1B-لوحات الوسطى) إلى التعبير GFP عالية، الأمر الذي يترافق عادة مع لحمة الورم قابلة للحياة. في حين أن قلة من GFP في بعض المناطق الورم قد يشير ورم موت الخلايا (
لأن غالبية الانبثاث الرئة تقع على سطح الرئة، ويمكن ملاحظتها تحت المجهر تشريح منتظم. الآفات النقيلي وعادة ما تكون واضحة متميزة من لحمة المحيطة بها (الشكل 2A). للتحقق من الملاحظات الإجمالية وتقييم الانبثاث التي هي أعمق داخل لحمة الرئة، والتصوير الفلورسنت من الرئتين لا يمكن أن يؤديها (الشكل 2B)، إذا تم استخدام GFP الخلايا معربا عن طريق الحقن. على الرغم من تألق ذاتي الرئة واضحة للعيان في صور، مشرق مضان المستمدة GFP يسهل الانبثاث المميزة من المحيط حمة الرئة. بدلا من ذلك، علم الأنسجة الروتينية (3A الشكل والشكل 4A) بالتزامن مع خوارزميات علم الأمراض الرقمي ( يوفر متعدد الألوان FACS فرصة لتوصيف السكان الخلية حتى النادر من خلال استخدام سطح الخلية متعددة الأقطاب و / أو علامات السيتوبلازمية في وقت واحد. تتميز الضامة السنخية بسبب عدم التعبير CD11b والتعبير عن F4 / 80 و CD11c و(الشكل 5). النهج التقليدي لتحديد هذه الخلايا عن طريق تدفق ينطوي الخلوي: (ط) اختيار سكان الخلية على أساس التشكل يصور خصائص الجانب مبعثر إلى الأمام، و (ب) اختيار CD45 قابلة للحياة الخلايا + تليها (ج) النابضة من خلايا السلبية CD11b، و (د) النابضة من خلايا coexpressing F4 / 80 و CD11c و(الشكل 5A، B). 
الشكل 1. رصد تي نمو الأورامhrough الحيوان التصوير. (A) صور الضوء الأبيض من الفأرة حقنوا GFP معربا عن الخلايا في لوحة الدهون الثديية في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن الخلايا السرطانية. (ب) الموافق الصور الفلورسنت التي تم الحصول عليها عن طريق استخدام فلتر GFP. الخطوط المتقطعة علامة منطقة الورم. لاحظ عدم وجود مضان أخضر لامع في بعض المناطق ورم في يوم ال 26 التي قد تنجم عن نخر الأنسجة أو neovasculature النامية. شريط النطاق، 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2. تقييم الرئة الإنتقالية العبء. (A) صور من الرئتين من الفئران المحقونة مع 4T1 الخلايا في لوحة الدهون الثديية مع الانبثاث السطحية (السهام).(ب) الصور من GFP + الرئة الانبثاث (مخضر مشرق) التي تم الحصول عليها من خلال استخدام المجهر التصوير. شريط النطاق، 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 3. التشريح الرقمية ومتحد البؤر المجهري في تصوير الرئة الانبثاث. (A) والمسح الضوئي للالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) ملطخة القسم الرئة من حقن الفئران مع 4T1 الخلايا في لوحة الدهون الثديية (الأزرق الداكن الأنسجة الانبثاث). شريط الحجم، 4 مم. (ب) متحد البؤر المجهري من GFP + الرئة الانبثاث (مخضر مشرق). شريط الحجم، 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصداراتن من هذا الرقم. 
الشكل 4. الكمي من الرئة الإنتقالية عبء بواسطة التشريح الرقمية. (أ) فحص الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) قسم الرئة الملون (الأزرق الداكن الأنسجة الانبثاث). (ب) صورة من الرئتين هو مبين في (A) التي تم إنشاؤها من قبل والمدربة صورة histomorphology أداة تحليل (برمجيات- "الجني"). اللون الأحمر يدل على مناطق الرئة التي حددها "المارد"، كما الانبثاث. شريط النطاق، 5 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 5. التدفق الخلوي التطبيقاتالصراصير لتحديد السنخية الضامة في الرئتين. (أ) representativeflow cytometrydot plotsillustrating استراتيجية النابضة لتحديد CD45 + CD11b سلبي F4 / 80 + CD11c و+ الضامة السنخية. (ب) التدفق الخلوي الممثل دوت تأثير plotsillustrating السيطرة أو الجسيمات الشحمية clodronate على الضامة السنخية الرئة. أرقام في مؤامرات تمثل نسبة الخلايا المغلقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من قبل وزارة الدفاع منح TSA 140010 لعضو الكنيست وق 111038 إلى MMM آراء ووجهات نظر، والتأييد من قبل المؤلف (ق) لا تعكس آراء من الجيش الأمريكي أو وزارة الدفاع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
