Protocol
Alle dyrestudier har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of Texas Tech University Health Sciences Center og fulgt retningslinjene som er skissert i "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr" utgitt av National Institutes of Health. Bruke åtte til tolv uker gamle hunn BALB / c-mus som er kommersielt tilgjengelige. Injisere 1 x 10 5 4T1 eller 1 x 10 5 4T1 celler som uttrykker GFP, som kan kjøpes fra ulike leverandører, inn i melkefettpute.
1. Kultur av 4T1 og 4T1-GFP Cells og Utarbeidelse av Tumor Cell Suspension for Injeksjoner 14
- 4T1 og 4T1-GFP Cell Culture
MERK: Utfør alle trinn ved hjelp sterile løsninger i en laminær luftstrøm (LAF) bio-sikkerhet kabinett med mindre annet er spesifisert.- Opprettholde 4T1 og 4T1-GFP-celler i RPMI-medium supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillinG og 100 ug / ml streptomycin sulfat.
MERK: Bestem en passasje tall ved å telle hver trypsinering og plating av celler. Det er viktig å bruke celler med samme passasje nummer til alle museforsøk, som antall passeringer påvirker celle tumorgenisitet og metastatisk potensiale. - Før celleinjeksjoner fjerne T75 cm2 kolbe inneholdende tumorceller ved 80% konfluens, fra en inkubator og aspirere mediet. Tilsett 10 ml PBS og rotere kolben forsiktig for å vaske ut gjenværende medium, og deretter aspirer PBS.
- Tilsett 2 ml av 0,25% trypsin med EDTA til kolben og vippe den til å fordele oppløsningen jevnt på overflaten og inkuberes i en fuktig inkubator i 3 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Trykk på kolben til rette for løsrivelse av celler og tilsett 8 ml friskt medium. Pipetter opp og ned flere ganger for å forstyrre klumper og få en enkelt celle suspensjon.
- Sentrifuger cellene i 5 minutter. ved 500 xg ved romtemperatur.Aspirer supernatanten og vask celler i 10 ml PBS.
- Pipetter opp og ned flere ganger for å forstyrre klumper og få en enkelt celle suspensjon. Ta 100 mL av en cellesuspensjon og telle celler ved hjelp av celle levedyktighet analysatoren i henhold til produsentens anvisninger.
- Beregn antall celler som kreves for alle injeksjoner ved hjelp av formelen: 10 5 celler per mus x # av mus anvendt i et eksperiment (alltid forberede ekstra celler til å være på en trygg side).
- Sentrifuger cellene som i 1.1.5. Fjern supernatanten gjennom innsugnings og resuspender cellene i den mengde frisk PBS som kreves for å oppnå en endelig cellekonsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml. Hold cellesuspensjonen på is inntil den er klar for injeksjon.
- Opprettholde 4T1 og 4T1-GFP-celler i RPMI-medium supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillinG og 100 ug / ml streptomycin sulfat.
- 4T1 eller 4T1-GFP Cell Injection-mus Prosedyrer
- Dagen før tumorcelleinjeksjon, bedøve mus i en induksjons kammer med 3% isofluran. Når mus sover og puster regelmessig, sted tHan musen på en kirurgisk pad med nesen inne i nesen membran, og koble den til isofluran vaporizer. Opprettholde anestesi med 2,5% isofluran. Klem musen tå for å sikre at musen er bedøvet.
- Påfør hårfjerning krem med en bomullsdott på injeksjonsstedet (høyre brystmelkefettpute) og vente i 2 min. Rengjør området ved hjelp av en våt papirhåndkle, plasserer du muse tilbake i buret og overvåke et dyr til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- På dagen for injeksjon, bedøve mus som i 1.2.2 og plassere på den kirurgiske pad.
- Vortex tube inneholdende tumorceller for å få jevn cellesuspensjon. Sug av 100 ul av en cellesuspensjon, inneholdende 1 x 10 5 tumorcellene, til et 0,5 ml insulinsprøyte (29 g, 12,7 mm nål-lengde).
- Løft huden ved hjelp av tommelen og finger peke nær 2. og 3. brystvorten, stikk nålen på sprøyten inn i Mammary fettpute like under det tredje nippelen under huden mellom fingrene og injisere cellene langsomt for å danne en boble (subkutan injeksjon).
- Plasser musen tilbake i buret etter injeksjon og overvåke som i 1.2.2.
- Overvåking tumorvekst
- Caliper Målinger 14
MERK: Støpt 4T1 eller 4T1-GFP cellene danner aggressiv brystkreft svulst. Vanligvis håndgripelig svulster vises ~ på dag 4-5 etter celle inokulasjon. 4T1-GFP celler danner svulster som vokser langsommere og gir metastaser senere. Mål svulsten to til tre ganger i uken. Hvis klinisk status av dyr forverres, dyr mister mer enn 10% av kroppsvekten, svulster overstige 10% av kroppsvekten eller blir sårdannelse, avlive mus umiddelbart.- Anesthetize en mus som i 1.2.1., Veier, plasser på den kirurgiske pad og våte området med 70% etanol.
- Palpate svulst i injeksjonsstedet (4 - 5 dager etter celle inokulasjon). <li> Beregn den største diameter (D) og mindre diameter (d1) med et skyvelære.
- Beregn tumorvolumet ved hjelp av formel Volume = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Monitor mus utvinning fra anestesi som i 1.2.2.
- Caliper Målinger 14
- Imaging (Kun for 4T1 GFP Cells)
- Anesthetize mus som i 1.2.1. Plasser musen på en bevegelig scene inne i bildebehandling instrument. Opprettholde anestesi gjennom nesen membran.
- Slå på bilde instrument og lyskilden i henhold til produsentens anvisninger.
- Under fanen "Acquisition" gå til "Lys" og bytte til den tomme posisjonen (uten filter) for hvitt lys. Sørg for at lyset motoren er PÅ og velg "Trans" i lysbordet.
- Under fanen "mikroskop", velg "Clear" utslipp filter og 0,5 x forstørrelse. I "Camera" fanen, sørg for at binning for fangst er '1 x 1 "og forhåndsvisning" 4 x 4'. Klikk på forhåndsvisning for å finne svulsten i hvitt lys, fokus for å få klart bilde, og klikk på fangst.
- Gå til "Kjøp" -fanen og endring belysning for å filtrere 1 (filter for GFP som per produsentens anvisninger). I "mikroskop" -kategorien, endre utslipp filter for å "530/20 GF". Forhåndsvisning og fangst i bildet i en grønn sone. Juster eksponeringstiden for å få riktig lysstyrke.
- Påfør pseudocolor til bildet og lagre i riktig mappe (figur 1).
2. intranasal administrasjon av liposomer 10
MERK: Utfør alle trinn ved hjelp sterile løsninger i en laminær luftstrøm (LAF) Bio-sikkerhetskabinett med mindre annet er spesifisert.
- På dag 6 etter tumorcelle injeksjon bedøve mus som i 1.2.1.
- Vortex klodronat eller kontroll (PBS) liposom-suspensjon erholdt fra fabrikanten. Ta 60 mL liposome suspension bruker steril pipette.
- Sakte slipper liposomoppløsningen (5 pl hver gang) i nærheten neseborene slik at musen til å puste i løsningen, gjenta til hele dosen på 60 mikroliter administreres.
- La musen gjenvinne bevissthet før du legger den tilbake i buret.
- Gjenta liposomadministrasjon hver 3. dag inntil musene avlivet. Må ikke administreres liposomer på en dag av offer.
3. Mouse Offer og Tissue Collection
MERK: Bruk autoklaveres og sterile instrumenter for mus disseksjon. Avlive mus mens under bedøvelse ved blodtapping og fjerning av vitale organer.
- På dag 22 (For 4T1 celler) eller dag 26 (for 4T1-GFP celler) etter tumorcelle injeksjon bedøve mus som i 1.2.1. og legg på den kirurgiske pad med en nese kjegle koblet til fordamper, opprettholde anestesi som i 1.2.1. Klemme en av tærne for å sikre at mOuse er bevisstløs.
- Pin tærne bruker nåler til disseksjon styret. Spray etanol på musen huden.
- Løft huden ved hjelp av pinsett og gjøre et snitt med kirurgisk saks. Sakte utsette bukhinnen og fortsette å kutte huden gjennom brystkassen inntil halsen.
- Bruke kirurgisk saks gjør et snitt i bukhule og avsløre nøye organer med bomulls tips unngå skader på blodårene.
- Flytt organene til den ene siden og eksponere vena cava inferior. Punkter venen og samle blod med 29 G insulinsprøyte. Plasser oppsamlet blod i røret og la på is for videre behandling.
- Kutt membranen for å eksponere brystkassen, lunger og hjerte. Sakte kutte brystkassen på begge sider ved hjelp av bein kutter og løfte toppen av brystkasse. Ta tak i hjerte med pinsett og kutte bindevevet som forbinder hjertet og lungene til brysthulen.
- Plasser lungene i liten mengde PBS i 60 mmPetriskål på is inntil den er klar for bildebehandling og videre bearbeiding til frysesnitt for immunfluorescens mikroskopi eller rutine histologi [inkludert hematoxylin og eosin (H & E) farging].
4. lungemetastaser Evaluering
- Telle og scoring Surface metastaser
- Sett petriskål med lungene under disseksjon mikroskop. Fokus for å få et klart bilde av lungene overflaten.
- Ved hjelp av en disseksjon mikroskop observere lungeoverflaten. Tell metastaser på de fremre og bakre sider av begge lungene.
MERK: normal lunge er hvitaktig eller rosa og porøs og har en svamplignende struktur. 4T1 metastaser er solide og ikke-porøst, noen ganger synes å være lik en dråpe av væske (figur 2A).
- Lung bildebehandling
- Sett petriskål med lunger på den bevegelige scenen inne i bildebehandling instrument.
- Slå på instrumentet ogBioLite multispektrale kilde. Åpne programvaren. Under fanen "Acquisition", gå til "Lighting", og bytte til tom posisjon (ingen filter) for hvitt lys. Lys Motor -> ON, lys tabellen -> Epi. Under fanen "mikroskop" Velg "Clear" utslipp filter og 1.66X forstørrelse. I "Camera" fanen, sørg for at binning for fangst er '1 x 1 "og forhåndsvisning" 4 x 4'.
- Klikk på forhåndsvisning og fokus for å få et klart bilde av lungene i hvitt lys og klikk fangst.
- Gå til "Kjøp" -fanen og endring i filter 1 (filter for GFP som per produsentens anvisninger). I "mikroskop" -kategorien, endre utslipp filter for å "530/20 GF". Forhåndsvisning og fangst i bildet i en grønn sone. Juster eksponeringstiden for å få riktig lysstyrke.
- Påfør pseudocolor til bildet og lagre i riktig mappe.
- Flip lungene for å få bildet av den andre siden på lignende måte. dette procedure genererer bilder av GFP-positive metastaser som kan bli ytterligere kvantifiseres ved hjelp av egnet programvare (figur 2B) 14.
- immunofluorescent Mikroskopi
- Fix lungene i 4% paraformaldehyde, ved 4 ° C i fire timer i mørket.
- Vask vevet to ganger med 10 ml PBS i 5 minutter for fullstendig å fjerne bindemiddel. Overføring til 18% sukrose i PBS og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Fjern vev fra sukrose og bearbeid av overflødig.
- Ta en cryomold, dekke det nederste laget med oktober medium. Plasser vev på oktober medium. Fyll formen med oktober medium til å dekke vev og sted på tørris.
- Oppbevares blokk ved -80 ° C til seksjonering.
- Forbered 5 mikrometer tykke seksjoner med en cryostat og sted på ladede lysbilder.
- Oppbevar ubrukte lysbilder i -80 ° C inntil videre bruk.
- Air tørke lysbildene for 7 min. og vask med PBS for å fjerne oktober Wipe lysbildet med vev eller papir håndkle for å fjerne overflødig vann, montere dekkglass med monteringsmedium som inneholder DAPI og visualisere med GFP filteret under mikroskop.
- Kvantifisere GFP metastaser (figur 3A) med bruk av egnet programvare 14.
- Histologi og Digital patologi
- Klikk på manuell belastning knappen under fanen start og vente på lysbildet holde stativet for å støte fra skanneren.
- Ta H & E beiset vev delen, rense den med vev for å fjerne smuss, og plassere den på en sikker måte i lysbildet holder rack.
- Skriv inn lysbilde beskrivelsen i popped-up vindu.
- Velg kategorien Scan-området på konsollen vinduet SS bildebehandling og justere den grønne firkanten for å definere regionen av interesse (ROI) som skal skannes.
- Dra den blå kalibrerings diamant til en klar del av raset, der vevet er fraværende, men innenfor ROI.
- Deretter velger Focus Points fanen og klikk på knappen Velg auto for å få flere fokuspunkter (gule plusstegn) på vev i avkastning.
- Om nødvendig, plassere ekstra fokuspunkter manuelt ved å dobbeltklikke i ROI.
- Fortsett til kategorien kalibrere og velg kalibreringsknappen for å starte lysbilde kalibrering på den blå kalibrerings diamant punkt. Etter at kalibreringen er fullført bildet fra kalibreringspunktet vises.
- Inspiser dette bildet for å sikre at den er klar og fri for smuss eller gjenstander.
- Fortsett til kategorien Skann og velg Start Scan for å starte skanning av ROI. Skannet histologiske seksjonen blir omformet til et digitalt skyve (figur 3B og 4A)
- Kvantifisere metastatisk belastning som tidligere beskrevet (figur 4B) 14.
5. Flowcytometri (FACS) Analyse av alveolære makrofager i lungene
- Utarbeidelse av enkeltcelle opphengningspå
- Etter bildebehandling og telling av metastaser, vaske lungene med sterilt PBS og legg til petriskål. Lag 1 - 2 mm biter av lungene ved hjelp av kirurgiske saks og pinsett.
- Overfør lunge bitene til 15 ml koniske rør med 3 ml av fordøyelse buffer inneholdende 1 mg / ml kollagenase P, 0,04 mg / ml DNase I, og 10 ug / ml trypsin-inhibitor løst opp RPMI-medium (steril).
- Inkuber konisk rør på et roterende risteapparat i inkubator ved 37 ° C i 40 min.
- Fjern røret konisk fra inkubatoren og pipetter løsningen opp og ned for å distansere vevet.
- Passere oppløsningen gjennom 40 um sil for å unngå klumper og få en enkelt cellesuspensjon. Dersom det er nødvendig, for å nedbryte den bedre spaltet vev pressen vev mot cellefilter ved hjelp av et sprøytestempel.
- Når en enkeltcelle-suspensjon er oppnådd, samle cellene ved sentrifugering og lyserer røde blodceller med2 ml av ACK-buffer i 10 min ved RT. Deretter vaskes en pellet to ganger i 8 ml RPMI.
- Resuspender celler i 3 ml komplett RPMI medium og fortsett til celle telling med celleviabilitet analysatoren i henhold til produsentens anvisninger.
- Farging av lungeceller for overflatemarkører
MERK: Utfør alle inkubasjoner ved 4 ° C. Sentrifuger plate ved 500 xg og 4 ° C.- Pipetter 1 x 10 6 celler i 100 ul FACS-buffer (1% FBS i PBS) til individuelle brønner i en V-bunn 96-brønns plate. Ved hjelp av en V-bunn 96-brønners plate letter utdeling av flere prøver.
- Pre-inkubere cellesuspensjonen med en ug mus Fc Block renset anti-mus CD16 / CD32 i 100 ul FACS-buffer i 15 min. Sentrifuger den V-bunn 96-brønners plate for å pelletere cellene, og supernatanten fjernes ved å vippe platen og la oppløsningen renne.
- For flate flekker, på forhånd, fortynne antistoffer mot Murine antigener i en tube (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / i E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF-647 CD86 (GL-1) til en endelig konsentrasjon på 2,5 ug / ml i FACS-buffer inneholdende 10 ug / ml av Fc blokk CD16 / CD32 antistoff.
MERK: Dette settet av antistoffer er anvendelige for identifikasjon og evaluering av en funksjonell status av alveolære makrofager og dendrittiske celler. - Tilsett 100 ul fortynnede antistoffer (master blanding) til brønnene i V-bunn 96-brønners plate og inkuber ved 4 ° C i 30 minutter.
- Sentrifuger plate for å pelletere cellene, og supernatanten fjernes som i 5.2.2. Vask cellene med 200 ul FACS-buffer, sentrifuger ved 500 g i 5 min. Fjern supernatanten som i 5.2.2. og resuspender cellene i 200 pl PBS.
- Sentrifuger plate for å pelletere cellene, og legge til levedyktighet fargestoff fortynnet i PBS (1: 1000). Inkuber i 20 min ved 4 ° C. </ Li>
- Sentrifuger plate for å pelletere cellene og fjern supernatanten som i 5.2.2. Vask med 200 ul PBS og sentrifuge platen på nytt.
- Resuspender celler i 100 ul 1% paraformaldehyde og butikken ved 4 ° C inntil oppkjøpet av FACS instrument. Før oppkjøpet overføre cellesuspensjoner til polypropylen FACS rør.
6. Analyse av FACS Data: gating Strategier og Identifisering av Cell subpopulasjoner
- Utfør FACS analyse som tidligere rapportert 10. Gate kjøpte celler / hendelser basert på fremad (FSC) og side-scatter (SSC); og deretter gate levende og CD45 + celler. For alveolar macrophage identifikasjon, gate CD11b-negative og deretter CD11c + F4 / 80 + celler. (Figur 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injeksjon av 4T1-GFP tumorceller inn i melkefettpute fører til dannelse av musetumorer (figur 1A) som rekapitulere den metastatisk spredning av human brystcancer, som metastaser blir raskt dannet i lungene (figur 2), lever, ben og hjernen til mus 11. Den stabile transfeksjon av 4T1 celler med GFP forenkler overvåking av tumorvekst (figur 1B), sporing metastasizing kreftceller og kvantifisere metastatisk belastning (figur 2B, 3B). I tillegg avbildning av svulster gir ytterligere informasjon om flere patologiske funksjoner som svulst celledød og tumor blodkar. Den lyse grønn fluorescens (Figur 1B-middel paneler) viser høy GFP uttrykk, som vanligvis er knyttet til levedyktig svulst parenchyma. Mens mangelen av GFP i enkelte kreft områder kan indikere tumorcelledød (
Siden de fleste av lungemetastaser er plassert på lungene overflaten, kan de observeres under vanlige disseksjon mikroskop. De metastatiske lesjoner er vanligvis klart atskilt fra de omkringliggende parenchyma (figur 2A). Hvis du vil kontrollere brutto observasjoner og vurdere metastaser som er dypere i lungene parenchyma, kan fluorescerende avbildning av lungene utføres (figur 2B), hvis GFP uttrykker cellene ble brukt til injeksjon. Selv om lunge autofluorescence er godt synlig i bildene, letter lyse GFP-avledet fluorescens skille metastaser fra rundt lungeparenkym. Alternativt kan rutinen histologi (figur 3A og figur 4A) i forbindelse med digital patologi algoritmer ( Flerfarget FACS gir anledning til å karakterisere selv sjeldne cellepopulasjoner gjennom bruk av flerledercelleoverflate og / eller cytoplasmiske markører samtidig. Alveolære makrofager er karakterisert ved mangel på CD11b ekspresjon og ekspresjon av F4 / 80 og CD11c (figur 5). Den typiske tilnærming for å identifisere disse celler ved flow cytometri innebærer: (i) valg av cellepopulasjon basert på morfologi er beskrevet av forover og sidespredningsegenskaper, (ii) valg av levedyktige CD45 + celler, etterfulgt av (iii) portstyring av CD11b negative celler, og (iv) portstyring av celler coexpressing F4 / 80 og CD11c (figur 5A, B). 
Figur 1. Overvåking tumorvekst Through Animal Imaging. (A) hvitt lys bilder av mus injisert med GFP uttrykkende celler inn i melkefettpute på forskjellige tidspunkter etter tumorcelle-injeksjon. (b) Tilsvarende fluorescerende bilder som oppnås ved bruk av GFP filter. Stiplede linjene markerer svulst området. Legg merke til mangelen på lys grønn fluorescens i enkelte kreft områder på dag 26 som kan skyldes vevsnekrose eller utvikle neovaskulaturen. Scale bar, 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2. Evaluering av lungemetastatisk charge. (A) bilder fra lungene av mus injisert med 4T1-celler inn i melkefettpute med overflatemetastaser (piler).(B) Bilder av GFP + lungemetastaser (lys grønn fluorescens) oppnås gjennom bruk av bildediagnostikk mikroskop. Scale bar, 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3. Digital Histopatologi og Konfokalmikroskopi i Imaging av lungemetastaser. (A) skanning av hematoxylin og eosin (H & E) farget lungeseksjonen fra mus injisert med 4T1 celler i melkefettpute (mørk blå vev-metastaser). Scale bar, 4 mm. (B) Konfokalmikroskopi av GFP + lungemetastaser (lys grønn fluorescens). Scale bar, 200 mikrometer. Klikk her for å se et større versjon av dette tallet. 
Figur 4. Kvantifisering av Lung metastatisk Burden av Digital Histopatologi. (A) Skanningen av hematoxylin og eosin (H & E) farget lungeseksjonen (mørk blå vev-metastaser). (B) Bildet av lungene vist i (A) som genereres av en trainable histomorphology bildeanalyseverktøyet (programvare- "Genie"). Rød farge indikerer tette områder identifisert av "Genie" som metastaser. Scale bar, 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 5. Flowcytometri AppKakerlakker for å identifisere alveolære makrofager i lungene. (A) Den representativeflow cytometrydot plotsillustrating gating strategi for å identifisere CD45 + CD11b negativ F4 / 80 + CD11c + alveolære makrofager. (B) Representant flowcytometri dot plotsillustrating effekt av kontroll eller klodronat liposomer på lunge alveolære makrofager. Tall i tomter representerer prosenter av gated celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen har blitt støttet av Department of Defense gi TSA 140 010 til MK og BC 111038 til MMM synspunkter og meninger, og påtegninger av forfatteren (e) ikke gjenspeiler de av den amerikanske hæren eller det amerikanske forsvarsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
