Summary
Denne artikkelen beskriver en tilpasningsdyktig ex vivo-protokollen for å visualisere Ca 2+ i løpet egg aktivering i Drosophila.
Introduction
En endring i intracellulær Ca 2+ konsentrasjon på egg (eggcelle) aktivering er en fredet del av alle undersøkte organismer 1,2. Dette arrangementet initierer et bredt spekter av Ca2 + -avhengige prosesser, herunder gjenopptakelse av cellesyklusen og translasjon av mRNA som er lagret. På grunn av dette kravet for Ca 2+, visualisere forbigående endringer i intracellulære Ca 2+ konsentrasjon har vært av avgjørende interesse.
Historisk sett ble modellorganismer valgt for studier av egg aktivisering basert på størrelsen og tilgjengeligheten av eggene sine. Forskjellige visualiserings tilnærminger har blitt benyttet for å følge og kvantifisere endringer i intracellulær Ca2 + konsentrasjoner i disse systemer, herunder: den photoprotein aequorin i medaka fisk 3; Ca 2+ sensitive fluorescerende fargestoffer som Fura-2 i kråkeboller og hamster 4,5; og kalsium green-en-dekstran i Xenopus 6.
Den generasjonen og forbedring av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) har forvandlet evne til å visualisere Ca 2+ dynamikk in vivo 7. Disse genkonstruksjoner er uttrykt i spesifikke vev og minimalisere behovet for invasive vevspreparater 8.
GCaMPs er et grønt fluorescerende protein (GFP) -basert klasse av GECIs som har vært meget effektiv på grunn av deres høye affinitet Ca2 +, signal-til-støyforhold og evne til å tilpasses 9-11. I nærvær av Ca 2+, gjennomgår GCaMP komplekset en serie av konformasjonsendringer, som starter med bindingen av Ca 2+ til kalmodulin, som resulterer i en øket fluorescerende intensitet av GFP-komponenten 9.
GCaMPs har vært mye brukt i forskning på Drosophila nevroner å visualisere endringer i intracellulær kalsium 12. De siste applicatipå av GCaMP teknologi for å visualisere Ca 2+ i modne Drosophila egg har avdekket en eneste forbigående Ca 2+ bølge på egg aktivisering 13,14. Ca 2+ bølge kan visualiseres ved lav forstørrelse under eggløsningen in vivo 13 eller ved høyere forstørrelse ved hjelp av en ex vivo aktiveringstest 13,14. I ex vivo-forsøk, blir de enkelte modne oocytter isolert fra ovariene og aktivert ved hjelp av en hypoton løsning, betegnet som aktiveringsbuffer, som har vist seg å rekapitulere hendelsene i in vivo aktivering 15-17.
Denne ex vivo-analyse gjør det enkelt høyoppløselig visualisering av Ca 2+ bølgen ved ulike eksperimentelle forhold, inkludert farmakologiske avbrudd, fysiske manipulasjoner og genetiske mutanter. Denne artikkelen viser fremstilling av modne Drosophila egg for ex vivo aktivering og the påfølgende mikroskopi brukes til å visualisere Ca 2+ bølge hjelp GCaMP. Denne tilnærmingen kan brukes for å teste initiering og kontroll av Ca 2 + bølge og å probe nedstrøms resultater.
Protocol
Merk: Utfør alle trinn ved romtemperatur hvis ikke annet er oppgitt.
1. Forberedelse til Dissection
Merk: Trinnene er beskrevet her er i samsvar med E. Gavis, Princeton University og Weil et. al. 18. Utfør følgende trinn to dager før bildebehandling.
- Ta en flue hetteglass med ca. 10 ml fast føde og legge til en liten mengde tørrgjær til det ene hjørnet, er nok mindre enn 1 g.
Merk: For informasjon om flue ampuller eller mat se 'Drosophila vedlikehold "19. - Legg 1 - 3 dråper vann for å hydrere gjær.
- Satt hetteglasset til side i 45 ° vinkel og tillate 3 - 5 min for gjæren til å ta opp vann.
- Mens gjær er absorbere vann, velge en flaske fluer uttrykker UASt- myr GCaMP5 20 drevet av kar-VP16GAL4 (referert til som GCaMP5) som nylig har dukket opp (en myristoynes form av GCaMP5 ble valgt for å gi et høyt signal-til-støy-forholdet ved forankring av de GECI til membranen i egget).
- Bedøver fluene i flasken med CO 2 gass. Sørg for å holde flasken snus for ikke å miste fluer i våtfôr.
- Tips bedøvet fluer på en CO 2 pad og sortere 10 - 15 kvinner og 5 menn som bruker en pensel under et dissekere mikroskop. Merk: Det er standard å inkludere menn å gi friske kvinner for disseksjon.
- Når flasken fra trinn 1.3 er klar, eller legge fluene til hetteglasset. Vær nøye med å holde hetteglasset horisontal før fluene blir aktive.
- Plasser flasken ved 25 ° C i ca. 36 timer.
- Gå tilbake de resterende fluer fra CO 2 pad til flasken eller forkaste.
2. dissekere Drosophila Eggstokkene
Merk: Trinnene er beskrevet her er i samsvar med Weil et. al. 3. Isola Individuell modne egg 4. Forberedelse til Imaging 5. Imaging Ex Vivo Egg Activation 6. Post-oppkjøpet Bildebehandling
Merk: Tilsetning av CO 2 Merk: Eldre egg er sannsynlig å skille lett fra eggstokkene bindevev.
Merk: For best resultat, kjøre sonden forsiktig langs siden av eggene.
Merk: Unngå å trekke i rygg vedheng da dette kan skade egg.
Merk: Avhengig av fremtiden bildebehandling satt opp, justere egg ca 200 mikrometer fra hverandre vinkelrett på dekkglass for maksimal bildeområdet.
Merk: Aktivering buffer er en hypotonisk buffer: 3,3 mM NaH 2PO 4, 16,6 mM KH 2PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyetylenglykol 8000, 2 mM CaCl2, brakt til pH 6,4 med en 1: 5 forholdet mellom NaOH: KOH.For mer informasjon se Mahowald, 1983 15. Porsjoner av aktivering buffer kan oppbevares ved -20 ° C i flere måneder, og ved 4 ° C i opptil to uker.
Merk: Et bredt felt, konfokal, roterende disk eller lys ark mikroskop kan brukes. Vi anbefaler å bruke en invertert mikroskop. Våre representative resultater ble oppnådd ved bruk av et konfokalt mikroskop.
Merk: For trinn 4,6 - 4,7, programvarekommandoer vil variere avhengig av mikroskop og produsent.
Merk: Dette vil først vises som en skygge på grunn av pipetten bryte strålen banen, men vil også føre til utseendet av små oljedråper. Noen oljedråper kan forbli knyttet til modne egg som vil påvirke eksperimentelle resultater og bildekvalitet.
Merk: På grunn av hevelse av ubefruktede egg ved aktivering, vil noen egg kamre flytte dramatisk ut av fokusplan eller synsfelt ved tilsetting av aktivering buffer. I denne situasjonen, stanse gjennomføringen av oppkjøpet og monter neste dekkglass.
Merk Bildefrekvensen fra bildebehandlingsprogrammer vil være nødvendig for å gi et tidsstempel på bildet.
Representative Results
Her har vi vist hvordan å forberede modne Drosophila egg for ex vivo aktivering. Egg uttrykker en GECI muliggjøre avbildning av Ca 2+ dynamikk på egg aktivisering og begynnelsen av embryoutvikling (figur 1). Det skal bemerkes at avhengig av GCaMP anvendes, spesielt nærværet av en myristoyl- gruppe, kan resultatene ha små kvalitative forskjeller 13 14. Vi har også demonstrert en rolle for funksjonell aktin i løpet av egg aktivering ved tilsetning av en inhibitor av aktin polymerisering cytokalasin D, til aktiveringsbuffer (figur 2) 14.
Et krav for cytoskjelettet på egg aktivisering er bevart. I C. elegans, etter befruktning, er cytoskeletal komponenter omorganisert for å forberede en celle embryo for første asymmetrisk divisjon 21,22. I kråkebolle, forstyrrelse av cytoskeletal re-organisasjon etter aktivering har vist seg å påvirke cellesyklus ved å forhindre kontraktile ringdannelse 23. Rollen til actin i å mediere en Ca2 + bølge og dens nedstrøms funksjon ved egg aktivering i Drosophila fremdeles ikke helt klarlagt.
I Drosophila, kan ko-visualisering av Ca 2 + bølge og aktin cytoskjelettet oppnås ved hjelp av denne ex vivo-aktiveringstest. Tidsserier av flere kanaler kan bli kjøpt og dynamikken i intracellulær Ca 2+ kan matches med endringer i aktin organisasjon i eggcelle (figur 3).
Figur 1:. A Single Ca 2+ bølgen ved Drosophila Egg Aktivering Tidsserier av ex vivo modne Drosophila egg uttrykke UASt- myrGCaMP5 etter enapparat.Foruten av aktiveringsbuffer (AH). Økningen i cytoplasmisk Ca2 + stammer ved bakre pol (B) og forplanter seg (BF) med en gjennomsnittlig hastighet på omtrent 1,5 um / sek. Initiering av bølgen blir vanligvis observert i løpet av 3 minutter fra tilsetningen av aktiveringsbuffer. Etter aktivering, de intracellulære kalsiumnivåer i det modne egg til nivået før aktiveringsnivå (G, H). Se supplerende film 1 (total tid 33 min). Skala barer = 50 mikrometer. Max projeksjon = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tilsetning av Cytochalasin D til aktiverings Buffer perturbs Ca2+ Wave Propagation. Tids serie av ex vivo modne Drosophila egg som uttrykker UASt- myrGCaMP5 etter tilsetning av aktiveringsbuffer inneholdende 10 pg / ml cytokalasin D sluttkonsentrasjon (AH). Mens Ca 2+ bølge blir initiert ved den bakre pol (A), er det kompromittert, og når ikke den fremre av egg (F) (hvite pilspisser angir fronten av bølgen). Ikke lenger ble observert Ca 2+ forandringer i løpet av 30 min). Se supplerende filmen 2 (total tid 30 min). Skala barer = 50 mikrometer. Max projeksjon = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Co-visualisering av aktin og Ca 2+ på Egg Aktivering i Drosophila. Tidsserier av ex vivo modne Drosophila egg uttrykker UASt- myrGCaMP5 (cyan) og UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) etter tilsetning av aktivering buffer (AH). Ca 2+ bølge initierer fra den bakre stang og gjenoppretter som i figur 1. Aktin ser ut til å endre seg med tid, hvite pilspisser (A vs H). Mangelen på Ca 2+ signaldeteksjon i sentrum av det modne egget er på grunn av bevegelse av prøven under bildetagning. Skala barer = 50 mikrometer. Max projeksjon = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya for bistand under forberedelsen av dette manuskriptet; Mariana Wolfner for diskusjoner om egg aktivering; Matt Wayland for bildebehandling støtte; og Nan Hu for generell støtte i laboratoriet.
Dette arbeidet ble støttet av University of Cambridge, ISSF til TTW [tilskuddet nummer 097814].
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
- Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).