Abstract
췌장암은 생존 지난 수십 년에 실질적으로 개선되지 않은의 암 중 하나 남아있다. 만 진단 된 환자의 7 % 5 년 이상 살아남을 것입니다. 이해 췌장 종양 미세 환경을 모방하기 위해, 우리는 실시간 종양 진행의 비 침습성 영상화를 허용 췌장암 동소 뮤린 모델을 이용했다. 녹색 형광 단백질 (PANC-1 GFP)을 발현 췌장암 세포 (예, 마트 리겔 HC), 혈청이없는 배지로하고이 개복술을 통해 췌장의 꼬리 주입 기저막 매트릭스 높은 농도로 현탁시켰다. 실온에 도달하면 고농도 기저막 매트릭스에서 세포 현탁액은 겔상 물질된다; 이 주사 부위에서의 밀봉을 만들고 셀 누설 방지 췌장과 접촉 할 때 따라서 겔화. 다른 장기에 종양의 성장과 전이를 실시간으로 모니터링된다형광을 이용하여 동물. 이 GFP의 여기 및 방출에 대한 적절한 필터를 사용하는 것이 중요합니다. 연구자들이 쉽게 누드 마우스의 절차를 복제 할 수 있도록 소성을 주입하는 단계는이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 주요 단계는 생체 이미징 세포 현탁액의 제조 외과 이식 및 전신 형광이다. 이 동 소성 모델은 기본 및 전이성 종양에 대한 새로운 치료제의 효능을 조사하기 위해 설계되었습니다.
Introduction
췌장암은 다른 암에 비해 빈도 증가로 진단하고 미국에서 암 관련 사망의 4 번째 주요 원인이다. 진단시에서 환자의 90 % 이상이 5 년 이내에 1,2- 다이. 현재 외과 적 종양 제거 췌장암 유일한 치료법이지만, 환자의 20 % 이하로 인해 질병이 상당히 진행되고 3,4 전이있다 진단시 주로 수술을받을 수있다. 특정 증상의 부족은 췌장암에게 자동 질병을 만든다; 증상 중 일부는 복부 통증, 허리 통증, 식욕 부진, 황달과 구토의 손실을 포함한다; 이는 쉽게 일반적인 소화기 질환 (4)로 해석 될 수있다. 이 때문에, 췌장 암의 진단 및 치료에 도움이 새로운 약물 학적 도구를 개발하는 것이 중요하다.
동물 모델의 사용은 pancre의 생물학을 이해하기 위해 우리가 할 수 있습니다ATIC 암과 인간이 지식을 적용에 대한 통찰력을 제공한다. 종양이 기원 (5)의 장기 성장 때문에 췌장암의 이종 이식 동 소성 모델은 현실이다. 세포주 또는 종양 단편을 피하 주입 이소성 모델과 달리 소성을 모델링 주변 6 종양 미세 환경을 모방하고 종양 세포의 상호 작용의 오락을 허용한다. 여기에 설명 된 이종 이식 모델은 유전 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하도록 유전자 조작 된 인간 췌장암 세포주 PANC-1 GFP에서 종양을 유도한다. GFP 검출은 비파괴 이미징 및 종양의 성장 및 전이 (7)의 모니터링을 가능하게한다. 종양 발생 자발적 빠르게 발생하며, 밀접 인간 췌장암 환자 (8)의 일차 종양의 것을 닮았다. 동소 이식 모델 동안 치료제에 반응하여 약효의보다 정확한 예측을 제공하는종양 미세 환경을 흉내 낸.
전술 한 바와 같이, 이러한 동물 모델은 실시간 종양 성장 및 전이의 형광 검출 할 수있다. 형광 검출 발광에 비해 더 직접적인 / 라이브 영상 수 있습니다. 형광 발광은 짧은 파장의 다른 광에 의해 여기 한 결과이고; 발광에 반해, 발광은 화학 반응의 결과와 강한 발광 구를 수 없다. 또한, 생체 내 형광 이미징 몸 전체 동물에 해가되지 않으며 연구자들은 치료 적 치료에 반응 시간에 따른 종양의 성장을 모니터링 할 수 있습니다.
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Protocol
아래에서 설명하는 프로토콜은지도와 웨스턴 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 실행된다. 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수 수행됩니다.
1. 세포 배양
- 전체 매체의 제조
- 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷을 사용 무균 RPMI 배지 500㎖의 병에 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 스트렙토 마이신 (P / S)을 첨가하여 완전 배지를 준비한다. 소용돌이에 의해 부드럽게 섞는다. 각 보충제의 최종 농도는 10 % FBS와 1 % P / S (V / V). 예를 들어, 56 ML의 FBS 6 ML의 P / S와 미디어 500㎖의 보충.
- 37 ° C에서 물을 욕조에 완전 배지를 놓습니다.
- 해동 및 전파 세포
- 액체 질소에서 PANC-1 GFP 세포를 검색합니다. 37 ° C에서 물을 욕조에 부드러운 교반하여 병을 해동.
노트:(- 3 분 약 2) 해동은 신속해야한다. - 라벨 T-75 플라스크 (a) 셀 라인 명, (B)의 통로 번호, (c) 기간, 및 (d) 연구자의 글자와 함께 사용될 수있다.
- 바이오 안전성 캐비닛에 70 % 에탄올 및 전송 유리 병으로 병을 닦습니다.
- 세포를 전파 15 ML 원뿔 튜브에 완전한 매체의 9.0 ml에 추가합니다. 1.0 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 세포 현탁액을 전송하고 완전 배지 9 mL에이를 중지.
- 실온에서 8 분 동안 125 XG에 원심 분리기. 바이오 안전성 캐비닛에 원뿔 병을 전송하고 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 부드럽게 상하 현탁액을 피펫 팅하여 신선한 완전 배지 10ml에 펠릿을 정지.
- 혈구와 세포를 세어 2.1 × 10 6 세포 / 플라스크의 밀도로 T-75 플라스크에서 그들을 판. 37 ° C에서 인큐베이터에서 플라스크를 놓고 5 % CO 2.
- 눈으로하고 현미경 매일 세포를 모니터링합니다. 독감의 경우갱신이 필요한 ID는, 무균 플라스크에서 완전한 성장 매체를 대기음 및 폐기합니다. 신선한 완전 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 액체 질소에서 PANC-1 GFP 세포를 검색합니다. 37 ° C에서 물을 욕조에 부드러운 교반하여 병을 해동.
- 세포를 전파
- 무균 플라스크에서 매체를 제거합니다. 세포를 씻어 버리고 둘 베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)의 5 ML을 추가합니다.
- 0.25 % 트립신 3 ㎖를 첨가하여 플라스크로부터 세포를 분리. 5 내지 10 분 동안 37 ° C에서 트립신 및 5 % CO 2를 함유하는 플라스크를 인큐베이션.
- 현미경 (10X 배율)에서 세포를 관찰하고 그들이 라운드 빠질 수 있습니다 확인합니다.
- 완전 배지의 동일한 볼륨을 추가하여 트립신을 중화하고 부드럽게 피펫 팅 아래로 대단히 짧은 시간을 휴식.
- 혈구를 사용하여 세포를 세어 1.2.7에서 언급 한 세포 밀도로 새로운 플라스크로 적절한 세포 현탁액 부피를 전달; 최종 부피 플라스크 당 10 ml의 그래서 충분히 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 셀 Suspens주입을위한 이온 준비
참고 : 기저막 매트릭스, 높은 농도, 실온에서 응고하기 때문에, 얼음에 모든 재료를 보관하십시오. 하룻밤 냉장고에있는 모든 멸균 피펫 팁 및 튜브를 놓고 정지에서 작업하는 동안 얼음에 보관하십시오.- 얼음에 어떤 첨가물없이 RPMI 미디어의 병을 유지합니다. 제조업체의 지침에 따라 기저막 매트릭스, 고농도, 해동. 바람직하게는, 작은 유리 병에 나누어 여러 동결 해동 사이클 (10)을 방지 할 수 있습니다.
- 대기음 모든 플라스크에서 미디어 및 DPBS 5 ㎖로 씻어냅니다. 1.3.4 단계로까지 이전 섹션의 모든 단계를 반복합니다.
- 실온에서 8 분 동안 125 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 내용을 전송합니다. 바이오 안전성 캐비닛에 원뿔 유리 병을 전송하고 DPBS 10 ㎖를 사용하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 조심스럽게 펠렛을 헤어 위아래 정지를 피펫. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 의에 설명을 다시 원심 분리기로1.4.3 TEP. 대기음 상등액과 세포의 수에 따라, 50 μL의 부피에 3 × 106 세포를 수득하기 위해 적절한 희석제를 추가한다. 1 (v / v)의 비율 희석제는 한 혈청이없는 배지 고농도 지하 매트릭스 멤브레인의 혼합물 일 것이다.
- 부드럽게 정지 와동과 항상 얼음에 보관하십시오. 서스펜션은 이제 주입을위한 준비가되어 있습니다.
- 외과 주입
참고 : 모든 수술 용 재료 및기구는 멸균 있는지 확인합니다. 항상 무균 기술을 연습 할 수 있습니다.- 테이블에 가열 패드를 놓고 멸균 드레이프로 커버. 마취 기계를 설정하고 모든 소모품은 손이 닿는 내에 확인합니다.
- 마취 마스크에 동물의 주둥이를 놓고 산소 1 L / 분, 2.5 %의 이소 플루 란으로 마취를 설정합니다.
- 조심스럽게 요오드와 동물의 측면 스크럽, 70 % 에탄올로 씻어냅니다. 세 번 반복합니다.
- 확인하려면동물 완전히 뒷 발을 곤란하게하여 마취됩니다. 응답이 관찰되지 않은 경우 동물은 수술을 위해 완전히 마취와 준비가되어 있습니다. 그러나 동물이 움찔 경우, 기화기에 충분한 마취가 확인하고 동물 마취에서 완전히 이동하는 데 더 많은 시간을 허용합니다.
- 부하는 약 18 G 바늘을 1.0 ml의 TB 주사기에 세포 현탁액 200 ㎕를가 (이전 냉각). 27 G 바늘과 바늘을 교체하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음으로 돌아갑니다.
- 비장의 일반 영역 (복부의 왼쪽 상단 사분면)를 찾아 사용하는 집게 해당 지역의 상단에 피부를 꼬집어. 수술 가위는 약 1.0 cm의 절개를 사용하여 포켓을 만들 수 있습니다. 마찬가지로, 비장 위에 평활근 핀치 및 복강에 접근하기 위해 실수로.
- 조심스럽게 비장의 꼬리 끝을 잡고 몸 밖으로 당깁니다. 췌장은 비장에 첨부됩니다. 습식 성을 이용하여 췌장 확산erile Q-팁은 췌장의 꼬리를 찾아.
- 췌장의 꼬리에 50 μL 주입을 제공, 10 초 안에 바늘을두고 천천히 췌장에서 바늘을 돌립니다. 성공적인 주입은 누수없이 피상적 거품과 같이 표시됩니다.
- 복강에 췌장과 비장을 돌려줍니다. 먼저 근육을 넣고 다음 개별적으로 피부를 묶습니다. 절개를 닫 6-0 봉합 또는 스테이플을 사용합니다. 관리] 케토 프로 펜 피하 (SC) (5 ㎎ / ㎏) 24 시간 이상 동물의 고통을 방지 할 수 있습니다. (- 0.1 ㎎ / ㎏ 0.05) 36 시간에 걸쳐 매 12 시간 또는 프레 노르 핀 사우스 캐롤라이나를 관리 할 수 있습니다.
- 마취에서 동물을 복구하고 케이지로 돌아갑니다. 또한 통증 모니터링 할 수 있습니다. 수술 - 동물 (선제 또는 이전에)시의 통증 완화와 함께 제공해야합니다. 추가 통증 완화가에서 정하는 IACCUC 프로토콜에 따라 고통을 경험 동물에 제공해야합니다수의사 또는 지명을 돌봐.
- 생체 내 이미징에서
주 : 촬상 어두운 챔버 GFP 영상에 적절한 필터를 구비 한 상용 촬상 시스템을 이용하여 수행 하였다. (-; 513-557 nm의 방출 495 nm의 여기 455) 이미지 획득은 CCD 카메라와 교체 여기 / 발광 렌즈로 이루어진 광학 시스템을 사용하여 수행 하였다. 밝은 필드 이미지는 각 시점에 대한 1 × 1 비닝 (binning)에서 필터없이 촬영했다. GFP의 여자는 크세논 멀티 스펙트럼 광원을 이용했다. 동물은 이미징 시스템의 어두운 챔버로 통합 된 가스 매니 폴드 마취로 마취 기계를 연결하여 촬영 과정에서 마취를 유지 하였다.- 1.5.2에 설명 된대로 동물을 마취. 마취 마스크는 이미징 동안 마취하에 동물을 유지하기 위해 상용 촬상 시스템의 어두운 챔버의 내부에방법.
- 올바른 여기 및 방출 필터를 설정합니다.
- 단지 백색광을 사용하여 초기 화상을 획득함으로써 시작한다. 이미징 세션에 걸쳐 동물의 같은 위치를 유지하고 두 번째 이미지를 촬영하기 위해 GFP 필터로 전환합니다.
- 최선의 결과는 두 이미지를 중첩. 형광 영역과 강도에 대한 이미지를 분석합니다.
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Representative Results
이 방법은 주사, 설치류 적절한 마취 개복술을 통해 세포 현탁액을 전달하기위한 세포 현탁액의 제조에 초점을 형광 인간 췌장암 세포 수술 동 소성 이식을 설명 형광 생체 작은 동물 이미징 용도. 이 3 주 사이에 녹색 형광 신호 (GFP 신호) 후 주입의 검출은, 현상 췌장암 종양 (그림 1)의 존재를 확인하기 위해 연구자에게 시각적 큐를 제공한다. (1)와 마우스의 세 가지 이미지로 구성도 PANC-1 GFP 형광 종양. 첫 번째는 백색광 (그림 1A)에서 촬영입니다; 두 번째 이미지는 푸른 형광 빛에서 촬영입니다 (여자 : 455-495 nm의, 방출 : 513-557 nm의) 이미지에 PANC-1 췌장 종양 (그림 1B)에서 방출 된 녹색 형광; 세 번째의 복합체 인처음 두 및 마우스 (도 1C)의 신체 내에서 종양의 위치를 나타낸다. GFP 신호를 표시하지 않습니다 종양을 개발하지 않는 동물 (그림 2). 또한, 시간에 따른 종양 진행의 대표 사진. 비 침습적 모니터링 상이한 시점 (도 3)에서의 GFP 신호를 기록하여 일 3 시간 동안 GFP 신호 여러 합성물을 나타낸다있다. 시간 진행은 종양의 크기가 증가함에 따라, GFP 신호가 증가함에. 스물 일 주입 후 종양 작은 녹색 도트로 표시, 50 일 주입 후 종양의 크기가 증가 크게.도 4a는 동물이 된 후에 확인 될 수 비장, 간 및 위장관에 전이를 도시 안락사와 장기는 생체 형광 영상 (그림 4B)에 대한 제거됩니다.
도 2 : 주입 해결 종양이 아직 개발되지 한 번에 마우스 형광 표현의 부족 :. (A) 이미지 얻었다흰색 빛없이 필터. (B) 이미지. 푸른 빛과 GFP에 대한 특정 필터를 사용하여 얻은 A와 B의 (C) 복합 이미지 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 생체 실시간 형광 이미징은 기본 종양의 성장을 추적합니다. 다양한 시점 이후의 주입에 PANC-1 GFP 췌장암의 진행의 생체 내 이미징에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
따라서 우리는 생체 내 형광 이미징 (그림 1) 몸 전체를 사용하여 종양 성장의 비 침습적 모니터링을 허용, GFP를 표현 췌장암의 소성을 쥐 모델을 설명합니다. 이 기술은 실시간으로 종양 발생을 모니터링있게 해준다 (도 3); 이 연구팀은 췌장암에 대한 새로운 제제의 치료 효과를 연구하기위한 중요한 도구가 될 수 있습니다. 이 모델의 또 다른 중요한 측면은 GFP의 형광이 성공적으로 주입 및 췌장암의 성장을 나타내는 시각적으로 제공하는 것입니다; 이는 달리 살아있는 동물에서 측정하기 어려울 것입니다. 임상 설정과 일치,이 모델은 전이에 대한 통찰력을 제공한다. 비장, 장간막 림프절, 간 및 위장관 (그림 4)는 주변 장기에 전이를 보여줍니다. 우리는 일찍 칠주 이식을 게시로 전이를 관찰했다. PANC-1 전이는 담당자되었습니다18주 11-10의 범위 orted. 전이가 관찰되는 시간이 주입 된 세포 주입과 시각화 기법의 수에 의존 할 수있다. 현재의 연구에서 우리는 상업적으로 사용할 수있는 녹색 형광 세포 라인 PANC-1 GFP를 선택했다. 여기에 설명 된 모델을 재현하고 밝은 형광을 가지고 있기 때문에 전이가 쉽게 가시화 될 수있다. 확립 된 암 세포주에서 생산 된 이종 이식 누드 마우스 모델의 제한은 원래 인간 종양 (12)에 비해 감소 된 종양 이종 가능성이고; 그럼에도 불구하고 모델을 개발하고 살아있는 동물의 진행 상황을 따라하기, 재현 쉽다. 또한, 이종 이식 마우스 모델의 암 연구에 널리 사용되는 것을 계속한다.
형광으로 표지 된 세포를 펠릿 화되어야하고 빙냉 기저막 (8)의 동량 혼합 빙냉 무 혈청 배지에 재를 현탁. 세포 현탁액은 m해야합니다겔화 또는 응고를 막기 위해 항상 얼음 aintained. 이 세포를 용해하는 것을 방지하기 위해, 18 게이지 바늘을 가진 주사기를로드하는 것이 중요하다. 세포를 용해하는 경우, 세포 현탁액을 상실하게되고, 어떤 종양의 성장이 (도 2)에 도달되지 않는다. 즉시 포스트 분사는, 세포 현탁액을 약 10 초 전에 주사 부위에서 바늘을 제거 응고 할 수있다. 서스펜션의 응고 특성은 주사 부위에서 누출없이 세포를 주입하는 우리를 허용했다. 세포의 누설이 이슈로보다는 세포 보급에서 전이 될 수 있습니다. 우리는 50 μL 주사 당 3 × 106 세포를 사용하여 GFP PANC-1 세포주의이 동 소성 이식을 최적화 한; 다른 세포주 주입 경험적으로 결정되어야한다. 50 세포를 함유하는 100 ㎕의 최대 사출 높은 볼륨 문헌 12에보고되어있다. 주요 최적화 매개 변수에 따계정에 현 3 주 후 주입 내에서 GFP의 형광을 통해 성공적으로 소성을 종양의 성장 및 긍정적 인 종양 영상이었다.
종양 성장과 개발은 물론 사용 된 쥐의 나이에 의해 분사 셀의 개수에 의해 영향을받지 않는다. 우리는 무 흉선 누드 마우스를 사용 세 쥐에 비해 6 ~ 8 주 세 사이의 젊은 쥐를 사용하는 것이 더 재현 가능한 결과를 산출하는 것으로 확인되었습니다. 이들 쥐의 나이, 그들은 인간 췌장 세포의 거부 될 수있는 몇 가지 면역을 다시 시작한다. 여기에 설명 된 영상 기술은 소성을 사용에 한정되지 않는다; 또한 종양의 이소성 주입에 사용될 수있다. 치료는 종양 GFP 신호를 모호 자동 형광을 피하기 위해주의해야한다. 마취 튜브에 사용되는 특정 플라스틱 자동 형광 아티팩트를 생성 할 수있다.
형광 전신 영상은 종양 성장 및 진행 (13)의 신속한 분석을 가능하게. 형광을 사용하는 주요 이점은 조직 병리학 적 검사 또는 면역 조직 화학 (14)의 기존의 번거로운 절차없이 암을 추적 할 수있는 능력이다. 이 모델은 밝은 형광을 가지며, 피변 등의 조작이 필요없이 이미지 획득을 가능하게한다. 형광은이 화학 반응에 따라 빛을 생성하지 않습니다에 생물 발광 다르다; 단순히 빛을 흡수하고, 낮은 주파수에서 그것을 reemits. 소성을 이종 이식 모델은 귀중한 지식과 인간의 사용을위한 새로운 치료법으로 번역 될 수 췌장 종양 생물학의 이해를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
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- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
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