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Neuroscience

의 자동 분석 Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

액체의 선충 유영의 컴퓨터 기반 분석을위한 효과적이고 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 C. elegans의 실험실에 대한 더 투자에 조금 필요합니다. 사용되는 하드웨어는 표준 및 행동 분석 (CeleST)을위한 컴퓨터 소프트웨어는 오픈 소스이다.

Abstract

행동을 조절하는 신경 세포 및 신경 근육 회로를 해부하는 것은 생물학의 주요 과제 남아있다. 선충 Caenorhabditis 엘레 간스 실제로 기본 기능 패턴의 특정 분자 드라이버에 빛을 발산하기 위해, 인간의 두뇌 커 넥톰을 구축, 기술적 접근 방법을 영감에서이 문제를 해결하는 데있어서 매우 귀중한 모델 생물로 입증되었습니다. 선충의 행동 연구의 대부분은 고체 기판에서 수행되었다. 액체에서, 동물 차원에서 속도의 범위에서 운동뿐만 아니라 정량을위한 새로운 도전을 소개하는 등 전방 형상 변화없이 후방 컬과 같은 부분 신체의 움직임을 포함 할 행동 패턴을 나타낸다. 다음은 간단한 절차의 단계 및 선충의 고해상도 분석이 동작을 수영 할 수있는 소프트웨어의 사용은 여기에 표시됩니다. CeleST라는 이름의이 소프트웨어는, 추적하는 전문 컴퓨터 프로그램을 사용하여C. 여러 동시에 동물과 제공하는 새로운 조치 액체 (수영)에서 운동 엘레 간스. 조치는 대부분 임계 컷 오프에 대한 계산 요구하지 않고, 컴퓨터 비전 및 패턴 인식에 사용되는 수학에 동물 자세에 근거하고 기반으로합니다. 모두 결합 된 작은 배치 시험에서 동물의 수백 전체 수영 솜씨를 평가하고, 심지어에서 새로운 표현형 잘 특징 유전자 돌연변이를 공개 할 수있는 소프트웨어 도구를 사용할 수 있습니다. CeleST와 분석을위한 시료의 준비는 과학계에 의해 넓은 적응을 가능하게, 간단하고 낮은 기술이다. 여기에 설명 된 계산 방법의 사용은 따라서 C. 엘레 모델의 행동과 행동 회로의 더 큰 이해에 기여한다.

Introduction

유전학, 후성 유전학, 경험, 환경 영향 문제는 현대 생물학의 주요 과제가 얼마나 정의. 계산 추적이 목표를 향한 중요한 기여를 할 수 있습니다 측정 할 수있는 간단한 유전자 의무가 모델. 선충 예쁜 꼬마 선충은 하나의 모델입니다. 이 문서의 목적은 운동을 수영 C. elegans의 추적 및 생물학적 관련성 여덟 새로운 기능에 대한 정보를 추출 정량하여 할 수있는 방법을 설명하는 것입니다.

3w 20 ° C 1, 2 약 4 D의 생식주기 - C. elegans의 약 2의 비교적 짧은 수명을 가지고있다. 표준 실험실 문화에서,이 미세한 선충은 세균 음식 소스 3,4로 확산되는 선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하는 페트리 접시에 성장한다. WT N2 동물 한천 가득한 접시에 우아한 정현파에 적극적으로 이동; 그들은 이동 쥐를 변경(검색)를 주거, (음식의 추구를) 로밍, 또는 식사 (비활성 포만 정지)에서 복구 할 때 ES 5. 장애 6 세 7 ~ 12도 획기적으로 접시에 운동을 변경할 수 있습니다.

healthspan 노화 동작을 조절 유전자는 기능적 C. elegans의 이동 패턴이나 운동 분석을 특징으로 할 수있다. healthspan를 측정하는 한 가지 방법은 물리적 인 활발한 활동 클래스 A 및 클래스 C 마비되는 7,8,13과, 플레이트에 그 운동에 따른 3 종류 (예를 들어, A, B, 및 C)로 성인 노화를 분류하는 것이다. 이러한 질적 정렬은 체력의 차이를 공개하는 데 유용하지만, 카테고리는 명확한 경계없이 광범위하므로 자신의 점수는 편견을 실험 될 수 있습니다.

추적자의 증가는 객관성, 세련 상승했으며, C의 분석의 정밀도는 움직임을 엘레 간스고체 배지 14-18에. C.는 플레이트에 운동은 주로 동물 매체의 고체 표면과 접촉하는면에 제한 간스. (C. 엘레은 여러면에서 몸의 위치, 고체 표면과 접촉 여전히 신체의 나머지 부분에서 떨어져 머리를 들어 올려 탐사를 유도 할 수있다. 그러나,이 문제가 이례적인 일이다.) 액체에 위치하는 경우,이 선충은 고체 표면에 동물에 비해 더 광범위한 차원의 움직임, 속도, 운동의 깊이의 큰 범위 및 후방 다르게 이동 전방의 연령이 증가 발생률을 갖추고 파동 운동, 수영을 시작합니다. 체력과 새로운 환경에 대한 응답의 빠른 분석 등의 실험은 액체 방울로 개별 동물을 배치 할 수 있습니다 및 해부 범위에 몸 벤드 주파수 점수. 비디오 녹화가의 수영 활력의 현재와 미래 스코어링을 용이하게 할 수있다동물. 그러나, 수동 방식은 획득 될 수있는 기능의 수를 제한하고, 완전히 한번에 하나의 동물을 처치하는 데 제한된다.

액체의 운동은 작은 고체 미디어 운동보다 탐구하고있다. 실제로, 액체 19-24에서 운동을 측정하기 위해 실험실에서 구현하는 강력하고 쉬운 몇 가지 소프트웨어 옵션이 있습니다. 소프트웨어 CeleST (C. elegans의 수영 테스트) 모션 (8)의 특성에 직접적으로 관련 데이터 (곡률 점수)를 제공하는 사용과 수학 기반 측정의 단순성을 제공합니다; (Restif 등. 팔의 기능과 장점을 자세히 설명). 또한, 계산 분석은 인간의 눈이 골 불가능하다 표현형 기능의 해명을 가능하게한다. 여기서,이 분석 방법의 해상도를 예시 데이터는 후속 CeleST 분석 설명을 위해 수영 시험을 기록하기 위해 프로토콜을 구현하기 쉽게 제시하고있다.

Protocol

1. 선충 성장 및 취급

  1. NGM 음식 소스 1-3 OP50-1 대장균 발견 포함하는 표준 페트리 접시에 C. elegans의 성장.
  2. 원하는 온도를 유지하는 배양기에서 문화를 유지합니다. C. elegans의 20 ° C 표준 성장 온도 인으로 잘 15에서 25 ° C로 성장한다.
    참고 : 수영 선수의 활약은 다소 활력이 문화와 슬라이드 접시에 오염 및 과열을 포함하여 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수 수영, 강력한 표현형이다. 안정 상태를 유지하는 강한 노력을해야한다.
  3. 하나의 동물 (4)의 전송을 처리하기 위해 유리 막대에 불꽃이 밀봉 백금 와이어로 만든 수제 선충을 선택할 수 있습니다.

2. 수영 분석을위한 설정

  1. 실체 디지털 CCD 카메라, 및 디지털 비디오 레코딩 소프트웨어로 구성된 통합 시스템을 사용한다. CeleST 소프트웨어 캘리포니아n은 별도의 컴퓨터에서 사용할 수.
    1. 검은 천으로 덮어 현미경 현미경 슬라이드 수영 드롭 영역에 눈부심을 방지하고 화질을 향상시키기 위해 (예를 들어, 펠트).
    2. 전체 수영 영역의보기와 배경에 동물의 날카로운 대비를 얻을 수있는 기본 거울에 현미경의 작동 거리 및 배율을 조정합니다. 계산 시각화 및 수영 분석 소프트웨어를 추적하는 아주 잘 작동 검은 배경에 흰색으로 성인의 몸을 시각화하는 다크 필드 조명을 설정합니다.
    3. 작업 영역, 현미경 슬라이드를 유지하고 매우 깨끗 드롭 수영을주의하십시오. 파편 성인의 자유 수영 폐색에 의한 분석을 방해 할 수 있으며, 섬유의 얇은 스레드 추적 중에 움직이지 않는 동물로 검출 할 수있다.

액체의 체력 분석 3. 동물 준비

  1. 피펫 60 μL 오현미경 슬라이드에 미리 인쇄 10 밀리미터 링에 F 1 배 M9 버퍼입니다. 드롭 완전히 반지의 안쪽 영역을 커버해야합니다. 소프트웨어는 멀티 웰 플레이트를 이용한 경우보다 슬라이드에 포함이 방울 크기를 사용하여보다 수영 정보를 추출한다.
  2. 독신 성인 선충을 선택하고 액체를 흐리게 할 수 있습니다 박테리아의 이동을 최소화 1X M9 버퍼의 드롭로 전송합니다. 먼저 올려 부드럽게 한 후, 많은 세균 잔디를 포함하지 않는 플레이트의 측면에 전송을 위해 동물을 배치 그들을 크롤링시키는,에 의해 박테리아를 최소화합니다.
    1. 드롭 선충에 전사 할 때, 동물 (25)의 동작에 영향을 미칠 수있는 수영 시간을 줄이기 위해 분석 역에 가까운 해부 범위를 사용한다.
    2. 그들은 종종 적극적으로 이동 크로스 경로 경우 드롭 만 성인 4 명을 배치합니다. (전산 분석을 교란하는) 수영 중복 최소화하기위한 지침으로 배치하는 것이 좋습니다그들은 나이가 적은 활기를 표시 할 때 젊은, 건강 WT 성인과 드롭 당 5 동물뿐만 활성 드롭 당 4 동물.
      참고 : 건강한 WT 선충은 본능적으로 액체에 배치 된 후 즉시 수영을 시작합니다. 그들이 덩어리 경우 선충의 선택의 도움으로 부드럽게 드롭 성인을 구분합니다.

액체의 체력 4. 분석 - 수영의 비디오 녹화

  1. 자신의 수영을 기록 할 수있는 현미경의 기초에 성인과 함께 들어있는 슬라이드를 놓습니다. 액체의 개별 동물의 행동의 30 초 동영상 캡처 세부 사항 (비디오 1) CeleST 소프트웨어 8,26의 도움을 때 쉽게 달성된다 그러한 기록의 많은 수의 샘플링; 그러나, 긴 기간이 다른 특정 행동 연구 (25)에 적합 할 수있다 수영. 중요한 것은, 배율 차이 affec에게 이후의 모든 기록에 걸쳐 같은 배율을 유지해야합니다t 수영 분석과 의지 바이어스 비교.
    주의 :이 단계는 재료의 표에 디지털 비디오 기록 소프트웨어를 사용하여 안내로서 제공된다; 우리는이 시험하지 않았다 비록 VirtualDub 오픈 액세스 소프트웨어를 대체 할 수 있습니다.
    1. 696 X 520 픽셀의 이미지 크기, 0.02 mm / 픽셀의 이미지 해상도, 18 프레임 / s의 속도 : 성공적인 수영 분석을위한 지침으로 다음과 같은 설정을 사용합니다. 이러한 설정의 높은 해상도 버전 추적을 용이하게 할 수 있지만, 프로그램에 의해 계산 된 조치에 영향을 미치지 않습니다.
      주 : 현미경 슬라이드 1X M9 완충액 60 μL 강하가 제공 수영 영역 상방 최소화 훨씬 깊이 하향 수영 움직임이 없다.
  2. 설정에서 '디스크에 545 프레임'으로 설정, '제한 시퀀스 크기'를 '기록'으로 이동합니다. 같은 제목 아래 '사용 기록 관리자'상자를 선택합니다. '편집 현재 recor을 클릭땡 스크립트가 ... 명령 '버튼을 아래에서' '입력'정지 조건 ', 이하'프레임 가져 오기 '를 선택하고'중지 0 후 : 00 : 30.00 '.
  3. 기록하려면, 다음 빨간색 '녹음'버튼을 누르면, 홈 제목 아래 'RAM의 새로운 순서'를 선택합니다. 이 소프트웨어는 디지털 카메라로 30 초 이상 545 프레임을 잡고 RAM 메모리를 개최한다.

액체의 체력 5. 분석 - 영상 처리

  1. 홈 제목을 클릭 녹화 소프트웨어 '로 내보내기 ... 풀 시퀀스'를 선택하여 영상 프레임들의 시퀀스로 비디오 조각.
    주 : 디지털 비디오 레코딩 소프트웨어는 여기에 제시된 수영 분석 프로그램에 의해 판독 될 수있는 모든 .BMP, .JPG,이 .tif 또는 .PNG 같은 프레임을 저장할 수있다. 그렇게 된 .tif 주 파일 저장 공간을 사용할 수 있지만, 이러한 .JPG 일부 포맷은 이미지 품질을 저하시킬 수있다.
  2. MATLAB의 B에서 수영 분석 프로그램을 실행y는 실행 버튼을 클릭.
  3. 수영 분석 프로그램의 홈 화면에서 한 번에 하나의 프레임 또는 유전자형, 날짜, 재판 및 기간 등 관련 라벨을 부착하는 동안 그룹 이미지의 시퀀스를 업로드 버튼 '여러 동영상 추가'를 '하나의 비디오를 추가'또는 사용 . 이 소프트웨어는 레이블 시퀀스 데이터베이스를 만듭니다.
  4. 1 '을 클릭하여 업로드 시퀀스에서 여러 동물의 동시 추적을 사용하도록 설정합니다. 공정 동영상 '. 새로운 화면에서 왼쪽 상자에서 원하는 동영상을 선택하고 '목록에 추가'를 클릭합니다. 각 비디오는 오른쪽 하단에 비디오의 첫 번째 이미지를 표시하려면 오른쪽 상단 목록에서 이름을 클릭합니다. 반지 안쪽 3 점을 선택하여 수영 영역을 구별하고, '위에 나열된 모든 동영상을 프로세스'를 클릭하여 처리를 시작합니다. 중앙 하단에있는 처리의 진행 상황을 볼 수 있습니다.
  5. 영상 처리 화면이 완료되면 '닫기'.

6. 액체에서 체력의 분석 - 측정

  1. 2 '을 클릭합니다. 계산 방법은 '검증 또는 단일 동물의 추적을 거부, 처리 된 동영상을 한 번에 하나씩 업로드 할 수있는 새로운 화면을 엽니 다. 처리 된 비디오는 비디오 이름이 그 동영상을 업로드하기 위해 클릭 할 수 왼쪽에있는 목록에 표시됩니다.
  2. 성공적인 추적 (녹색 블록)에 대비 놓친 추적 (빨간색 블록)의 영역에 초점이 수동 단계를 사용합니다.
    주 : 소프트웨어가 ((404) 동영상 (8)로부터 2020 동물에서 관찰로 94.1 %의 유효 기간) 강력한 추적 시스템을 가지고 있기 때문에 다른 방법으로, 하나의 유효한 추적의 자동 출력에 의존 할 수 있습니다.
    1. 하단의 화면에서 첫 번째 컬러 바에서 '세그먼트 신체의 유효 기간'을 찾을 수 있습니다. '유효 프레임'의 비율은 녹색이고, '거부 프레임'의 비율은 빨간색입니다. 유효한 프레임의 ≥80 %는 의미가 추적 전조치를 계산하는 데 사용 nformation 것은 30 초 540 중 적어도 432 프레임에서 오는 18 프레임 / s로 기록 된 재판 수영.
    2. 쉽게 탐색하고 유효 블록을 수정 / '다음 블록', '스위치 유효성', '분할 블록'및 '격리 프레임'옵션을 이용하여 프레임을 거부했다. 이 동물이 솟아 수영 영역에서 경로를 교차하는 드문 경우에, '전환'버튼을 특정 프레임 범위에서 자신의 식별 번호를 전환 할 수 있습니다.
    3. 추적 및 중복 공연에 대한 자세한 내용은 화면의 하단에있는 막대 그래프를 볼 수 있습니다. 분할 된 본체 (프레임 당 동물의 몸 길이)의 길이는 빈도를 중복와 상관 관계.
  3. 비디오에 어떤 밝은 반점이 분석을 방해 할 경우, '섬광 존'기능을 선택하여 수영 영역에서 밝은 영역을 조정합니다.
  4. 를 클릭하면 '저장하고 계산 방법은'유효 입력하기 전에 최대 저장다른 처리 된 비디오를로드. 소프트웨어는 계산이 단계에서, 백그라운드에서 개별 동물의 수영 성능 곡률 맵 (사용자에게 도시하지 않음)의 파라미터는 아래에 나타낸 (영상 2).
    참고 : 여기에 초점을 맞추고있다 파라미터 측정은 표 1에 설명되어 있습니다. 웨이브 개시 속도 본체 파수, 비대칭 성, 신축성 및 컬링이 소프트웨어는 동물 계산 곡률 맵에 기초하여 계산되며 여행 속도, 브러시 스트로크, 그리고 활동 지수 매개 변수는 곡률지도를 기반으로하지 않습니다.
  5. '계산 측정'화면을 종료 '닫기'를 클릭하십시오.

액체의 체력 7. 분석 - 결과의 출력

참고 :이 소프트웨어는 쉽게 눈으로 득점하지 아주 미묘한에 명백한 행동 특성에서 커버 수영 운동의 여러 조치에 대해보고 할 수 있습니다 (비디오 3, 4). 여기에웨이브 개시 속도, 바디 파수, 비대칭, 스트레치, 컬링, 주행 속도, 브러시 스트로크, 그리고 활동 지수 : 초점은 일반적으로 좋은 동적 범위를 보여 8 매개 변수입니다.

  1. 프로그램의 홈 화면에서, 3 '을 클릭합니다. 결과 표시는 "분석 결과를 얻었다.
  2. 왼쪽 상자에 프레임의 원하는 분석 시퀀스를 선택하고 또는 '선택된 샘플에 추가' '새로운 샘플에 추가'버튼을 클릭하여 신규 또는 기존 샘플 그룹으로 이동하여 통계 처리를위한 샘플 그룹을 만듭니다.
  3. 화면 상단에 선택하여 그래프와 8 개의 매개 변수 각각에 대한 샘플의 주요 통계를 표시하는 두 번째 화면으로 이동하는 '이러한 샘플보기 그래프'를 클릭합니다.
    1. 원하는 경우, '색상', '히스토그램의 #', 및 선택기 '웜 #'을 사용하여 화면의 왼쪽 상단의 막대 그래프의 표현을 조정합니다.
  4. 용도'2D 히스토그램 "은 화면의 좌측에 메뉴 드롭 다운'이 Y 축 측정 '및'을 X 축 측정 '통해 두 파라미터의 조합을 플롯. 종료하고 '결과 표시'화면으로 돌아가려면 '닫기'를 클릭하십시오.
  5. 열고 추가 스프레드 시트 프로그램에서 조작 할 수 .CSV 파일로 자세한 수치 데이터를 저장하려면 화면 왼쪽 상단의 '수출 ...'버튼을 사용합니다.
  6. 다시 홈 화면으로 이동하여 분석 비디오 시퀀스를 포함하는 데이터베이스의 저장을 보장하기 위해 '종료'클릭 '닫기'를 '결과 표시'화면.

Representative Results

액체 (수영)의 운동을 분석함으로써, (크롤링) 고체 배지에 명백하지 않은 표현형은 설명 될 수있다. 수영 운동을 정량하기 위해 우리는 수영 동작 (8)의 열 새로운 매개 변수를 측정하는 특정 소프트웨어를 개발했다. 이러한 매개 변수의 8 가장 유용한 표 1에 상세히 설명된다. 이러한 매개 변수는 웨이브 개시 속도, 바디 파수, 비대칭, 스트레치, 컬링, 주행 속도, 브러시 스트로크, 그리고 활동 지수 이름이 지정됩니다. 소프트웨어의 능력을 예시 연구는 WT 돌연변이 행동이나 장수 배경 8 노화 성인 수백의 기능 저하를 정의하고, 잘 연구 된 장수 돌연변이 연령 1 (hx546) 및 daƒ-16 (mgDƒ50)를 분석 한 이는 정상적인 인슐린 신호 전달 경로를 방해 돌연변이 항구. 유전자 연령 1 (a phosphatidylinositide -3- 키나아제 PIK3 인코딩이 돌연변이 hx546을 항구) 촉매 서브 유닛, 그리고, 수명 연장과 스트레스 저항 27 ~ 29됩니다. 유전자 daƒ-16의 수명이 단축되고 30-33 삭제 때 스트레스 반응을 손상 forkhead 상자 O (FOXO) 전사 인자에 대한 인코딩한다.

웨이브 개시 속도, 주행 속도, 브러시 스트로크와 활동 지수 등 수영의 특정 매개 변수가 점차적으로도 유리한 유전 적 배경 (그림 1)에서 나이가 감소했다. 현재의 지식과 일치, 수명이 긴 나이-1 (hx546) 돌연변이 고급 매우 오래된 나이에 WT보다 더 격렬한 신체 성능을 보여 주었다. 예상대로 또한, 수명이 짧은 daƒ-16 (mgDƒ50) 돌연변이는 특히 매우 오래된 나이에, 성능을 저하 표시됩니다. 놀랍게도, 그것은 단지 CeleST 컴퓨터 비전과 수학적 알고리즘 패키지 된 슈퍼의 면밀한 조사했다나이-1 (hx546) 돌연변이의 연구 수영 성능은 성인의 발병에서 검출되었다. 나이-1 (hx546) 젊은 성인 생활에서 개선 된 물리적 성능 결과이 변이 이전에 (그림 1) 감사하지 않는 방법으로 정상 개발 및 / 또는 젊은 성인의 표현형에 영향을 미치는 것을 제안 사실.

바디 웨이브 번호, 비대칭, 스트레칭, 그리고 컬링 매개 변수 WT의 나이와 노화 돌연변이 성인 (그림 2)와 트렌드. 흥미롭게도, 소프트웨어의 해상도 수준은 스트레칭과 같은 그 정도까지 말려 나이-1 (hx546) 자신의 수명이 극단적 오래 daƒ-16 (mgDƒ50) 돌연변이의 무능력에 걸쳐 돌연변이의 지속적인 대칭 같은 미세한 행동 특성을 밝혀 -age WT 나이-1 (hx546) 성인 않습니다.

물리적 PERFO의 전체 불가피한 손실 ​​외에도나이, 각 성인 노화를 통해 고유의 진행 패턴을 표시 인해 유전 환경 7 사실상 균질하더라도 rmance. (유전학 및 환경을 제어함으로써, 이러한 요소의 가능한 혼란 효과는 연령 관련 퇴행성 변화에 확률 성의 중요한 기여를 공개, 최소화된다.) 비슷한 유전 적 배경의 동기화 C. elegans의 인구는 통제 된 환경에서 보관 아직도의 혼합을 포함 자신의 노화 특수성에 따라 개인의 다른 클래스. 모두가 건강한 성인을 시작하지만 다른 사람들이 시간의 긴 기간 (우아한 발색, 클래스 A)에 대한 활력을 유지하면서, 일부는 빠르게 자신의 체력 (나쁜 발색, 클래스 C)를 잃게됩니다. 나쁜 발색 따라서 우아한 발색보다 상당히 짧은 healthspan이 나타납니다.

로 더 연구 8에 설명 우아한 발색은 젊은 물리적 fitn을 유지ESS 더 젊은 성인의 수영 프로파일과 비교하여 관찰 (3, 4 및도 5). 이 지속 피트니스 후 생식 나이에 수명이 긴 나이-1 (hx546) 돌연변이 체의 물리적 성능 (D 11)에 필적 (그림 1, 2). 반대로, 나쁜 발색이 크게 극단적 인 과거와 progeric daƒ-16 (mgDƒ50) 성인 (- 4 그림 1)과 유사한 수준에서 수행, 곧 재생 후 자신의 물리적 용량의 대부분을 잃었다. 이러한 유사성은 총 비교하여 그릴 수 있습니다, 그러나 특정 서명 자세히 살펴에서 쉽게 눈에 띈다. 스트레칭과 컬링 극단적 오래된 야생 유형 및 노화 돌연변이 모두의 정도 사이에 상관 관계가 (그림 2)가 있지만 예를 들어,이 관계는 나쁜 발색에서 관찰되지 않는다 (그림 4, 5), 컬 더 높은 경향을 표시하는 최대하지만,테스트 샘플에서 스트레칭 없습니다. 우리가 제공하는 소프트웨어 따라서 이전에 취급 용이하지 않았다 더 정교한 연구를위한 도구를 제공하여 체력이나 locomotory 용량의 분석에 차원을 추가합니다. 요약 CeleST 특정 조건에 서명 할 수있는 고유의 공통 파라미터 패턴의 식별 정보를 (가능 여덟 특정 유전 후성의 행동 지문 정의 여기서 강조 신규 한 방법, 및 환경 배경 형태의 광범위한 판독을 제공한다 이러한 healthspan 같은 환경 적, 약리학, 영양), 생물학적 과정, 또는 유기체 상태.

그림 1
그림 1 : 웨이브 개시 속도 (A), 활동 지수 (B), 브러쉬 스트로크 (C) 및 WT, 나이-1 (hx546)에 대한 주행 속도 (D) 및 daƒ-16에 CeleST 소프트웨어 보고서 (mgDƒ50) D 사 (젊은 성인), 11 (후 재생) 20 (극단적 인) 이전에 성인. Y 축 수단 '수'에서 '#'. WT들은 녹색, daƒ-16 빨간색, 회색, 나이 한 색상으로되어 있습니다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차이다. 동일 연령 WT 및 노화 돌연변이는 ANOVA는 던넷 여러 비교 테스트 한 다음 한 방법을 사용하여 통계적 유의성에 대한 비교 하였다. **, P = 0.001 - <0.01; ***, P = 0.0001 - <0.001. N = 각 데이터 (62)는 네 개의 독립적 인 시험에서 가리 킵니다. 이 여기에 참고도 2, 각 30 초 영상 4 동물로 구성되어, 각각의 시험을 위해 우리가 4 수영 (으)로부터 16 동물의 총 득점이 표시된 각 데이터 포인트 4 생물 복제에 대해 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ntent "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 그림 2
그림 2 : 바디 웨이브 번호 (A), 비대칭 (B), 스트레치 (C), 및 WT에 대한 컬링 (D), 연령-1 (hx546) 및 daƒ-16 D 4 (mgDƒ50) 성인에 소프트웨어 보고서 (젊은 성인), 11 (후 재생) 20 (극단적 이전). Y 축 수단 '수'에서 '#'. WT는 빨간색, 회색, 나이-1 녹색 및 DAF-16 색상으로되어 있습니다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차이다. 동일 연령 WT 및 노화 돌연변이는 ANOVA는 던넷 여러 비교 테스트 한 다음 한 방법을 사용하여 통계적 유의성에 대한 비교 하였다. *, P = 0.01 - <0.05; **, P = 0.001 - <0.01; ***, P = 0.0001 - <0.001. n은 각 데이터 포인트의 62 독립적 사에서 30 초 시련 수영.e.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 웨이브 개시 속도 (A), 활동 지수 (B), 브러쉬 스트로크 (C), 젊은 WT 성인을위한 주행 속도 (D) (D 사)와 같은 시대의 우아한 나쁜 발색 (D10에 소프트웨어 보고서 11). Y 축 수단 '수'에서 '#'. 젊은 WT들은 녹색에서 우아한 발색 및 클래스 C 나쁜 발색 빨간색, 회색, 클래스 색상으로되어 있습니다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차이다. 클래스는 우아한 발색과 클래스 C 나쁜 발색은 던넷 다중 비교 시험 다음 편도 ANOVA를 사용하여 D에 4 젊은 성인을 비교 하였다. ****, p <0.0001. n은 독립적 인 두 개의 각 데이터 포인트의 27, 30의 시련을 수영. 그래프는 약간 Restif 등의 알에서 수정됩니다. 크리 에이 티브 번역 된 문서 (2014) 8,커먼즈 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 젊은 WT 성인 바디 웨이브 번호 (A), 비대칭 (B), 및 컬링 (C)에 소프트웨어 보고서 (D 사)와 같은 나이 우아하고 나쁜 발색 (D 10, 11). Y 축 수단 '수'에서 '#'. 젊은 WT에 빨간색 회색, 클래스, 녹색, 클래스 C 나쁜 발색에서 우아한 발색 컬러된다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차이다. 클래스는 우아한 발색과 클래스 C 나쁜 발색은 던넷 다중 비교 시험 다음 편도 ANOVA를 사용하여 D에 4 젊은 성인을 비교 하였다. **, P = 0.001 - <0.01; ****, p <0.0001; 등의 알에서 수정됩니다. (2014) 8, 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 HTTP로 출판되었다 : /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 젊은 WT 성인 스트레치에 소프트웨어 보고서 (D 사)와 같은 시대의 우아한 나쁜 발색 (D 10, 11). 젊은 WT에 빨간색 회색, 클래스, 녹색, 클래스 C 나쁜 발색에서 우아한 발색 컬러된다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차이다. 클래스 A 우아한 발색 및 클래스 C 나쁜 발색은 D 사 y로 비교 하였다던넷 다중 비교 시험 하였다 일방 ANOVA를 사용 Young을 성인. N = 각 데이터 (27)는 두 개의 독립적 인 시험에서 가리 킵니다. 그래프는 약간 Restif 등의 알에서 수정됩니다. (2014) 8, 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 HTTP로 출판되었다 : /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1
비디오 1 : C.의 대표 그룹의 수영장은 성인 엘레 간스. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 2
비디오 2 : 시험 동물의 수영 공연의 개별 곡률지도의 CeleST 소프트웨어 계산. 곡률 맵은 백그라운드에서 계산된다; 그들은 사용자와 소프트웨어 인터페이스에 표시되지 않습니다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 3
비디오 3 : 개별 곡률지도를 기반으로 수영 대책의 소프트웨어 계산. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 4
비디오 4 : 곡률에 의존하지 않는 수영 대책의 소프트웨어 계산지도. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

Discussion

모델 시스템으로 C. 엘레 간스의 사용은 유전 전성, 세심한 세부 사항에 주석 실험 취급 용이성 및 해부학으로 인해 증가하고 있습니다. 예를 들어, 선충의 자웅 동체의 신경 구조와 연결이 명확 크게 특정 동작을 제어 특정 신경 회로의 연구를 촉진, 34-36을 매핑됩니다. 302 운동 뉴런 같은 기본 행동 출력으로 감각 입력 광범위한 처리 성숙한 자웅 동체의 신경계를 구성한다. 더 복잡한 남성 신경계 구조는 해결 될 성 특정 회로를 활성화 37 설명되었다. (37)

C. elegans의 동작은 광범위하게 고체 배지를 포함하는 표준 배양 플레이트에 연구되고있다. WT C.는에서 한천 가득한 접시에 예측 정현파으로 이동, 편차 엘레 간스 때문에전체 패턴은 눈으로 감지 수동으로 획득 할 수있다. 이 방법은, 그러나, 실험의 기준을 준수하고 노동 집약적이다. 추적 C. 고체 미디어 운동이 해결해야하는보다 정교한 생물학적 질문을 허용, 주관 바이어스를 제거하고 대규모 연구를 허용 엘레 간스 측정하기위한 하드웨어 및 소프트웨어 도구를 제공합니다. 쉐퍼 연구소 (16)에 의해 생성 된 최근의 행동 데이터베이스는 접시에 운동을위한 전산 시스템으로 달성 된 분석 확장과 깊이의 훌륭한 예입니다.

WT C. elegans의 액체에 배치되는 경우, 동물은 신속하게 수영을 개시하는 새로운 환경으로의 이동을 적응시킨다. C. 수영 크롤링보다 운동의 큰 범위를 활용하여 8 개의 불규칙 할 수 있습니다 엘레 간스. CeleST 같은 소프트웨어가 C의 상세한 분석을위한 갭을 채울 목적으로하는 액체, permi 동작을 엘레 간스쉽게되지 않은 도움을 눈으로 측정되지 않는, 또는 더 빠르게 수동 득점 이상 수행 할 수 있습니다 운동 관련 매개 변수의 tting 정량. 8 하드 시간에서 개인은 ~, (200) 동영상에 하루에 1,000 레코드를 처리 할 수 ​​있습니다.

이 소프트웨어는 체력과 행동의 포괄적 인 지문의 역할을 평가하는 매개 변수를 수영 정의합니다. C. elegans의 액 동작 및 기본 분자 경로의 복소 패싯 이해 농축 이외에,이 소프트웨어는 약리학 적 반응, 노화, 별개의 동작을 포함한 생물학의 여러 측면을 탐색 할 수있다. 그들은 시대의 소프트웨어와 같은 응용 프로그램의 한 예입니다 여기 발표, C.의 물리적 성능에서 발생하는 정량 변화의 개요 성인 엘레 간스 (더 자세한 계정, Restif 등. 8 참조). 노화의 맥락에서, 일부 측정 파라미터하면서 거절다른 사람은 증가 또는 지속적으로 야생형에 변화가 없었다. 동향 장수 돌연변이의 계산 프로파일에 의해 상당 부분 확인하고, 동일 연령 인구의 우아하고 나쁜 어른의 동료의 상대 프로필은 균일 한 환경 조건을 유지하고 있습니다. 소프트웨어의 높은 해상도는 광범위 특징 돌연변이 (그림 1의 예를 들면, 연령-1 (hx546)) 이전에 알 수없는 미묘한 표현형을 표시 할 수 있습니다.

기술 된 프로토콜의 몇 특히 중요한 단계가 있습니다. 실험자가 높은 임의의 온도 변화를 피하기 위해 큰 고통으로 이동하는 것이 좋습니다 그래서 수영 환경과 변형 판 문화 사이의 일정한 온도 환경을 유지하는 것은, 수영 재현성이 중요하다. 수영 미디어는 판과 동일한 온도에서해야합니다. 마찬가지로, 수영의 드롭 크기에 세심한주의가 재현성을 보장하는 데 도움이됩니다. 마지막으로, 생각하는 것이 현명하다누적 큰 비디오 파일의 오프로드에 대한 사전. 비디오 캡처 컴퓨터에서 떨어져 사이트에서 이미지를 처리하는 것이 좋습니다.

수영 분석을 위해 여기에 제시된 소프트웨어의 사용은 특정 제한 사항이 있습니다. 프로그램이 동시에 여러 동물을 추적 할 수 있지만 개 이상 동물을 공동으로 분석 할 경우 먼저, 동물은 비디오 이미지에서 서로간에 수영 것을 증가 된 기회가있다. 때 프로그램이 명확하게는 그 데이터 프레임을 검열하는이었다 동물 확인할 수 없습니다. 이 프로그램 기능은 개별 동물에 대한 데이터는 높은 품질의 보장 있지만 처리량을 제한한다. 관련 신호는 이미지 분석을 혼동 할 수 있습니다 둘째, 이미지가 상당히 깨끗해야, 즉, 먼지, 얼룩 및 조명의 눈부심 무료입니다. 프로토콜 섹션 2.1.1 크게 변동 합병증을 제거하여 이미지 캡처 도움이 될 수 있습니다 매우 낮은 기술 투자에 명시된 바와 같이 전N 환경 조명은 주변 광이 단계에 도달 할 수없는 어두운 천 스테이지 영역을 커버한다. 셋째, 프로그램 단계에서 성인 동물에 최적화되어있다. 젊은 유생 수영 매우 빠르고 프로그램 오류를 증가시키는 작은 몸을 가지고있다. 넷째, 소프트웨어의 일부는 MATLAB 활용 및 버전 업그레이드 및 / 또는 운영 체제 업그레이드가있는 경우, 어떤 프로그램 링크가 중단 될 수있다. 현재, 소프트웨어는 MATLAB의 2015b 및 Mac OS 버전 10.10에서 사용하기에 최적화 된,하지만 우리는 곧 이러한 변화에 대해보다 강력한있는 소프트웨어 버전을 게시 할 것으로 예상된다. 마지막으로, 영상 데이터 파일은 빠르고 커질 및 할당 할 저장 공간을 필요로 할 수있다.

요약하면, 여기에 제시된 쉽게 CeleST 분석을 위해 수영 C. elegans의 동영상을 만들기 위해 많은 투자없이 실험실에 의해 구현 될 수있는 간단한 방법입니다. 소프트웨어 패키지의 기능을 통해 추적에서 광범위한 자동화를 포함분석, 동시 다중 동물 추적, 대부분의 운동 매개 변수의 정량을위한 수학적 기초 (즉, 곡률 측정)의 사용. 이 소프트웨어는 Restif 등에 설명 된대로 공개 코드와 데모와 오픈 소스입니다. 8. 프로그램 추적 고급 컴퓨터 비젼 분석, 다른 문서 추적 시스템을 갖추고 있지만 (예 Greenblum 외., 2014 (38))은 여기에 제시된 소프트웨어의 매개 변수 분석과 호환된다. 미래의 향상 상술 한 운영 체제 (또한 재료의 표에 나타난)의 특정 버전의 사용을 제한하지 않는보다 견고한 패키지로 변환 소프트웨어 향하는 것이다.

Acknowledgments

NIH에 의해 지원되었다 CeleST 개발 R21AG027513과 U01AG045864을 부여합니다. 데이터 및 일부 짧은 영상 표현이 Restif 등의 알에서 적응하고 있습니다. 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/로 출판되었다 (2014) 8. 우리는 원고 도움 리카르도에서 Laranjeiro 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

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References

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신경 과학 문제 (118) 수영 행동 운동, 노화 근육 감소증 추적
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Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

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