Summary
Een protocol voor het verminderen ruimtelijke heterogeniteit van ionen signalen in MALDI massaspectrometrie door het regelen substraattemperatuur tijdens droogprocessen monster wordt aangetoond.
Protocol
Opmerking: Dit protocol is ontwikkeld voor het verminderen van de ruimtelijke heterogeniteit van maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid met de gedroogde-druppel-methode. Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen, inclusief voorbereiding en conditionering, sample depositie en drogen, en massaspectrometrie data-analyse. De procedures zijn beschreven en in meer detail hieronder beschreven:
1. Voorbereiding en Voorconditionering
- Het schoonmaken van de Sample Plate
- Draag nitril en met de hand wassen van het monster plaat voorzichtig met afwasmiddel en gedestilleerd-gedeïoniseerd water (DDW).
- Spoel het monster plaat met methanol (MeOH) en DDW.
- Plaats het monster plaat in een bekerglas van 600 ml en vul met DDW.
- Ultrasone trillingen het monster plaat DDW gedurende 15 minuten in een ultrasoon bad (200 W, 40 kHz).
- Verwijder DDW uit de beker en vul de beker met MeOH.
- Ultrasone trillingen het monster plaat in MeOH gedurende 15 minuten in het ultrasoonbad (200 W, 40 kHz).
- Afblazen het oplosmiddel druppels op de plaat met stikstofgas en houden het monster plaat droog is voordat sample depositie.
- Reguleren droogkamer Temperatuur
LET OP:. De droogkamer is een 35 x 20 x 45 cm 3 (B x D x H) acryl kamer Figuur 1 toont het beeld van dit droogsysteem. De kamer wordt gespoeld met stikstofgas kamertemperatuur door een gas stromingsmeter met een constant debiet een lage relatieve luchtvochtigheid bewaakt door een gekalibreerde hygrometer in de droogkamer de geïnstalleerde. Een koperen basis blok in de droogkamer uitgerust met een geprogrammeerde constante temperatuur water circulatiepomp wordt gebruikt om roestvast stalen monster platen tegemoet te komen. De koperen basisblok kan de monsterplaat temperatuur van 5 regelen tot 25 ° C. De temperatuur van de lucht, koperen basis blok, en het monster plaat worden bewaakt door K-type thermokoppels.- Open de deur en snel zet het monster plaat op de koperenbasis blok en sluit de deur.
- Handmatig aanpassen van het gas stroommeter aan het stikstof debiet tot 10 standaard kubieke voet per uur (SCFH) in te stellen.
- Bewaken van de relatieve vochtigheid in de droogkamer door de hygrometer en fine-tunen van het gas flowmeter te zorgen voor de relatieve luchtvochtigheid is altijd minder dan 25%.
- Bewaken van de temperatuur van het monster plaat door K-type thermokoppels en het water circulatiepomp temperatuur handmatig in te stellen totdat het monster plaat 5 ° C voor experiment of kamertemperatuur (25 ° C) voor de controle bereikt.
Opmerking: Om de monsterplaat stabiliseren op een temperatuur bedoeld, de watercirculatie temperatuur doorgaans ingesteld 0-5 ° C hoger dan de ontworpen monster. Om bijvoorbeeld 5 ° C te handhaven op de monsterplaat de temperatuurinstelling van de watercirculatie in het traject van 0 tot 2 ° C; het monster plaat bij 25 ° C te houden, de temperatuurinstelling van de watercirculatie in het traject van 23 tot 25 ° C. - Zorg ervoor dat de vereiste temperaturen en de relatieve vochtigheid worden bereikt (tabel 1) voor sample depositie.
Opmerking: Alle parameters en hun instelwaarden voor droogprocessen met verschillende monsterplaat temperaturen worden in tabel 1.
LET OP: Bij een lage monster plaat temperatuur, kan water condensatie op het monster plaat optreden als het deurtje is geopend voor een lange tijd. Als er water condensatie optreedt, sluit de deur en GEEN monster op het storten tot condensatie van water is uitgedroogd.
- Bereiding van matrix en analyt Solutions
- Bereiding van matrix oplossingen
- Bereid 0,1 M THAP oplossing met 50% acetonitril (ACN): 50% DDW waterige oplossing.
- Bereiding van analyten
- Bereid 10 -4 M maltotriose oplossing DDW.
- Bereid 10 -5 M bradykinine fragment (1-7) oplossing in 50% acetonitril(ACN): 50% DDW waterige oplossing.
- Bereiding van matrix oplossingen
2. Sample Afzetting en Drogen
- Premix 0,25 pl 0,1 M THAP oplossing en 0,25 pl 10 -4 M maltotriose of 10 -5 M bradykinine fragment (1-7) oplossingen in een microcentrifugebuis.
- Vortex de gemengde oplossing gedurende 3 sec.
- Centrifugeer de gemengde oplossing gedurende 2 sec (2000 xg) om de oplossing op de bodem van de centrifugebuis verzamelen.
- Open de deur van de droogkamer, zorgvuldig deponeren 0,1 ul van de oplossing op het monster plaat met pipet en sluit de deur onmiddellijk.
- Wacht tot het monster druppel uit te drogen.
. Opmerking: De typisch waargenomen droogtijd met verschillende monsterplaat temperaturen worden in tabel 1 voor steekproefplaat temperatuur van 5 ° C, de gemiddelde droogtijd is 800 tot 1.000 sec; voor steekproefplaat temperatuur van 25 ° C, de gemiddelde droogtijd is 100 tot 150 sec. - Na het drogen, open de deur van de droogkamer.
- Zet het water circulatiepomp temperatuur tot kamertemperatuur (25 ° C).
OPMERKING: Sla deze stap als het monster plaat constant op kamertemperatuur (25 ° C) tijdens het droogproces wordt gehouden. - Nadat het monster plaat temperatuur weer op kamertemperatuur (25 ° C), verwijder het monster plaat uit de droogkamer.
- Onderzoek het monster morfologie onder een 5X stereomicroscoop en neem beeld snapshot bright-field.
Opmerking: Als het kristal morfologie niet zoals verwacht, is het noodzakelijk om een nieuw monster te maken met dezelfde procedure. Typische kristal morfologie wordt in de bovenste panelen van figuur 2.
LET OP: In de gevallen met een lage monster plaat temperaturen, zoals 5 ° C, is het belangrijk om op te warmen het monster plaat op kamertemperatuur alvorens het uit de droogkamer. Bij het afzetten van de monsters, hier niet aan houden de voorgemengde solution in de punt van de pipet meer dan 10 sec. Niet meer gebruik maken van de vooraf gemengde oplossing na het afzetten van de monsters. De bovenste panelen van figuur 2 tonen bright-field beelden van de monsters bereid met verschillende steekproefplaat temperaturen.
3. Mass Spectrometry Data Analysis
- Mass Spectrometry Data Acquisition
LET OP: Na de bereiding kan het monster worden geanalyseerd met behulp van beeldvormende massaspectrometrie. In deze studie worden de beeldvormende MS experimenten met laboratoriumonderzoek ingebouwde gesynchroniseerde dual-polariteit TOF (DP-TOF) massaspectrometer beeldvorming. 15 Commercial MALDI-TOF mass spectrometers met imaging vermogen zijn ook geschikt voor deze experimenten. De massaspectrometer wordt gebruikt in lineaire extractie en positieve ion modi met geoptimaliseerde afzuiging vertragingen. De kinetische energie van ionen 20 kV. De laserstraal grootte 35 pm in diameter op het monsteroppervlak en het spectrum van elke plek is de avewoede van 5 laser shots.- Plaats het monster plaat in de MALDI massaspectrometer.
- Voer imaging massaspectrometrie analyse om het monster bereid in stappen 2,1-2,9.
- Selecteer een karakteristieke massa piek van de massa lijst weergegeven in het venster resultaat en klik op "2D" om de afbeelding van een twee-dimensionale ion plotten.
LET OP: Voor maltotriose gemengd met THAP, de karakteristieke pieken sodiated maltotriose, geprotoneerde THAP en sodiated THAP. Voor bradykinine fragment (1-7) gemengd met THAP, omvatten de karakteristieke pieken geprotoneerde bradykinine fragment (1-7), geprotoneerd THAP en sodiated THAP. - Klik op de aanpassing knoppen in het pop-up venster om de bovenste en onderste grenzen van de intensiteit van het signaal te bepalen en klik op "een afbeelding op te slaan". Deze instelling bepaalt het contrast van ionen beelden.
LET OP: In elke individuele set van gegevens, worden de gebarsten regio's en de nul vlekken toont lage helderheid geëlimineerd. - Observeren en vergelijk de ionafbeelding het beeld helder-veld dat werd genomen op stap met 2.9.
OPMERKING: Imaging massaspectrometrie en constructie van afbeeldingen van bepaalde ionen kan worden bereikt met commerciële instrumenten. Als gevolg van de verscheidenheid van de data-acquisitie en analyse software, moeten de gebruikers software instructies van de leverancier instrument om beelden van hoge kwaliteit te krijgen volgen.
- Gegevensanalyse
LET OP: De heterogeniteit van de monsters wordt kwantitatief geanalyseerd. In deze demonstratie wordt elk monster verdeeld over meerdere concentrische gebieden door ontwikkelde software in huis om de ruimtelijke verdeling van de ionen te analyseren. De analyse kan ook worden uitgevoerd met zelfstandige gegevensanalyse software.- Klik op de nul vlekken en de gebarsten regio's van de ion afbeelding weergegeven in het venster resultaat in om onbelangrijke gebieden te verwijderen.
OPMERKING: Deze procedure definieert de essentiële gebied imago ion van. - Klik op "vind edge" knop om de buitenste laag op het ion van te vinden.
- Klik op 'aftrekken' om de ion overvloed informatie van de buitenste laag in een database op te slaan en tegelijkertijd verwijder deze laag op de ionen uit. Een selectievakje vertegenwoordigt deze buitenste laag zal verschijnen in de "output data" lijst van het venster resultaat.
- Herhaal stap 3.2.2 en 3.2.3 tot het midden van het ion van wordt gedefinieerd.
- Klik op en selecteer alle selectievakjes in de "output data" en klik op "export" om de gegevens te exporteren.
- Open de geëxporteerde gegevens met behulp van spreadsheet-software om de gemiddelde ion overvloed aan elke laag te berekenen aan de ruimtelijke verdeling van ionen informatie te verkrijgen.
- Klik op de nul vlekken en de gebarsten regio's van de ion afbeelding weergegeven in het venster resultaat in om onbelangrijke gebieden te verwijderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lichte-veldbeelden en de MS afbeeldingen maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid met monsterplaat temperatuur van 5 en 25 ° C zijn weergegeven in figuur 1. Bij sodiated maltotriose, het ion signaal voornamelijk bevolkt aan de rand van het waarnemingsveld als het wordt bereid met een monsterplaat temperatuur van 25 ° C. Door verlaging van de monsterplaat temperatuur tot 5 ° C, het signaal vult homogeen over het gehele monstergebied. Het enige merkbare nadeel bij het bereiden monsters onder 5 ° C is dat er meer scheuren dan opgesteld onder 25 ° C monsters. De ion beeld van geprotoneerde bradykinine fragment (1-7) toont een soortgelijke trend als die van sodiated maltotriose. De resultaten van beeldvorming MS suggereren dat de voorbereiding van monsters in het kader van een lagere sample plaat temperatuur kan een aanzienlijke herverdeling van de moleculen en heterogeniteit te verminderen.
figuur 3 toont de resultaten van de statistische analyses maltotriose en bradykinine fragment (1-7) bereid onder monsterplaat temperaturen van 5 en 25 ° C. Voor elk monster werd de gemiddelde intensiteit genormaliseerd. Bij sodiated maltotriose met een monsterplaat temperatuur van 25 ° C, het signaal intensiteiten in de centra zijn veel lager dan die met de monsterplaat temperatuur van 5 ° C. Het resultaat van geprotoneerde bradykinine fragment (1-7) toont ook minder variatie bij het verlagen van de temperatuur monsterplaat 25-5 ° C.
Figuur 1: Beeld van de steekproef droogsysteem.De droogkamer wordt gemaakt van acryl. De kamer wordt gespoeld met kamertemperatuur stikstofgas een lage relatieve vochtigheid staat te houden. Een koperen basisblok met een geprogrammeerde constante temperatuur water circulatiepomp wordt gebruikt om de temperatuur van roestvrijstalen monsterschalen regelen. De thermometers bewaken lucht, koperen basis blok, en het monster plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Verlaging monsterplaat temperatuur zorgt voor betere signaaloverdracht homogeniteit De helderveld beelden (bovenste foto) en de MALDI afbeeldingen (onderste foto) van maltotriose (a) en bradykinine fragment (1-7) (b) bereid met THAP onder verschillende steekproefplaat temperaturen. de MALDI beelden werden verkregen door het extraheren van de sodiated maltotriose (m / z: 527) en geprotoneerde bradykinine fragment (1-7) (m / z: 757) vanaf het totale spectrum, respectievelijk. De pixelgrootte van de ionen beelden is 35 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Signaal variatie vermindert als monster plaat temperatuur daalt tijdens het droogproces De MALDI beelden worden verkregen met maltotriose (a) en bradykinine fragment (1-7) (b) bereid met THAP onder verschillende steekproefplaat temperaturen.. Rode en blauwe gegevens geven het monster bereid in de monsterplaat temperaturen van 25 en 5 ° C.g "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Sample Plate Temperatuur (° C) | Monster | Air Temperatuur (° C) | Relatieve vochtigheid (RV%) | Drying Time (sec) |
| 5 | maltotriose met THAP | 20 ± 3 | <25 | 800 - 1000 |
| bradykinine fragment (1-7) met THAP | ||||
| 25 | maltotriose met THAP | 25 ± 3 | 100-150 | |
| bradykinine fragment (1-7) met THAP |
Tabel 1: Experimentele parameters en drogen voorwaarden waaronder verschillende steekproefplaat temperaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op basis van eerdere theoretische voorspellingen, kan temperatuur geïnduceerde hydrodynamische stromen binnen druppels naar buiten te overwinnen capillair stromen veroorzaakt door verdamping van het oplosmiddel. De efficiëntie van dit interne recirculatie van moleculen wordt versterkt wanneer de temperatuur gradiënten binnen een druppel verhogen. Volgens de voorspelde resultaten bij het houden van de monsterplaat temperatuur onder 5 ° C onder handhaving van zijn omgeving bij omgevingstemperatuur, de gemiddelde snelheid van recirculatie stromen in de druppel is ongeveer 4 maal sneller dan die van de uitwendige capillaire stromen. Als de monsterplaat temperatuur gelijk aan de omgeving, de gemiddelde snelheid van recirculatie stromen is 1800 keer langzamer is dan de uitwendige capillaire stroming. De resultaten van deze berekening blijkt dat het verlagen monsterplaat temperatuur tijdens de voorbehandeling gunstig. De experimentele waarnemingen eens met deze voorspelling.
Het monster plaat tempertuur nauwkeurig moeten worden bestuurd door het monster bereidingswerkwijze. Tabel 1 toont de typische druppel droogtijd met 0,1 gl monster bij verschillende temperaturen monsterplaat. Vóór het afzetten van monsteroplossing op de plaat, is het belangrijk dat het monster plaatoppervlak droog. Als er water condensatie optreedt bij de voorbereiding van de monsters onder lage temperaturen, wordt de afzetting van het monster oplossing niet aanbevolen vanwege gecondenseerd water vergroot monster ruimtes en verdunt oplossingen. Derhalve is het belangrijk om de relatieve vochtigheid van de droogkamer onder 25% te houden. Bovendien, bij de voorbereiding van de monsters onder lage temperaturen, het monster plaat moet warm tot kamertemperatuur alvorens het uit de droogkamer. Hoewel ondergeschikte water condensatie na de voltooiing van het monster kristallisatie niet het monster bevolking te veranderen, zou aanzienlijke condensatie vermeden worden.
Het gebruik van vers voorgemengde oplossingen is het aanbevolengerepareerd. Zodra de voorgemengde oplossingen blootgesteld aan lucht, pre-kristallisaties van de monsteroplossingen en kan de uiteindelijke kristalgrootte en morfologie kunnen veranderen. Daarom moet de pipetteerprocedure worden uitgevoerd met redelijke efficiëntie, meestal binnen 10 seconden om het monster druppel van pre-kristallisatie in de pipetpunt voorkomen. Het wordt aanbevolen om het monster morfologie observeren onder een microscoop om ervoor te zorgen geschikt kristal morfologie worden geproduceerd voor massaspectrometrie analyse. Als het kristal morfologie niet zo goed als verwacht zo nodig herhalen het depositieproces.
Volgens onze theoretische en experimentele studies, de voorbereiding van de monsters met een lage temperatuur steekproefplaat onder omgevingscondities geïnstalleerd verbetert de gegevens reproduceerbaarheid en kwaliteit in MALDI-MS. Latere experimenten tonen ook aanzienlijke verbetering van de intensiteit van het signaal met dit monster bereidingswijze. De experimentele gegevens verkregen door tzijn methode een aanzienlijke verbetering van de betrouwbaarheid van MALDI massaspectra voor kwantitatieve analyses. In vergelijking met andere werkwijzen die oplossingssamenstelling of oppervlak eigenschapwijzigingen, 8,16-18 veranderen droogomstandigheid eenvoudiger en algemeen toepasbaar voor conventionele monsters. Zo kunnen de meeste massaspectrometrie gebruikers profiteren in reguliere aanvragen.
Verbetering van MALDI signaal homogeniteit met afnemende steekproefplaat temperatuur is ook effectief voor een aantal andere populaire matrices. Zoals een betere α-cyclodextrine (α-CD) signaal homogeniteit THAP en α-cyano-4-hydroxykaneelzuur (CHCA) als matrix bij lage temperatuur monster droogomstandigheden is recentelijk gerapporteerd. 14 Het nadeel veranderende monsterplaat temperatuur dat de werkwijze nog niet geschikt voor high-throughput analyse vanwege de lange droogtijd monster in koude omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption. Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).
- Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).
- Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).
- Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).
- Hu, H., Larson, R. G. Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate. J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).
- Deegan, R. D., et al. Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
- Hu, H., Larson, R. G. Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions. J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).
- Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study. New J. Phys. 11, 075020 (2009).
- Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop. J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).
- Probstein, R. F. Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).
- Lai, Y. -H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).
- Hsiao, C. -H., et al. Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).
- Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation. Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).
- Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).
- Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting. Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).
