Summary
サンプルの乾燥工程時の基板温度を調節することにより、MALDI質量分析法におけるイオン信号の空間的な不均一性を低減するためのプロトコルが示されています。
Protocol
注意:このプロトコルは、乾燥液滴法を用いて調製した(1-7)マルトトリオース及びブラジキニンフラグメントの空間的な不均一性を減少させるために開発されています。プロトコルは、調製及び前処理、試料堆積、乾燥、及び質量分析データ分析を含む三つの主要な段階からなります。手順は、以下でより詳細に概説し、説明します。
1.準備と前処理
- サンプルプレートのクリーニング
- ニトリル手袋を着用し、洗剤と蒸留脱イオン水(DDW)で穏やかにサンプルプレートを手で洗います。
- メタノール(MeOH)でとDDWでサンプルプレートをすすぎます。
- 600ミリリットルのビーカーにサンプルプレートを挿入し、DDWでいっぱい。
- 超音波浴(200 W、40キロヘルツ)で15分間、DDWでサンプルプレートを超音波処理します。
- ビーカーからDDWを削除し、MeOHでビーカーを埋めます。
- 超音波浴(200 W、40キロヘルツ)で15分間、MeOH中でサンプルプレートを超音波処理します。
- 窒素ガスをプレート上で溶剤滴を吹き飛ばすとサンプル堆積前にサンプルプレートの乾燥を保ちます。
- 乾燥チャンバーの温度を調節します
注:乾燥室は35×20×45 cm 3である(幅×奥行き×高さ)アクリルチャンバー図1は、この乾燥システムの写真を示します。チャンバは、乾燥室の内部に設置較正湿度計によって監視低い相対湿度を維持するために一定の流量でガス流量計を介して室温窒素ガスでパージされます。プログラムされた恒温水循環装置を備えた乾燥室中の銅ベースブロックは、ステンレス鋼サンプルプレートを収容するために使用されます。銅ベースブロックを25℃に5からのサンプルプレートの温度を調節することができます。空気、銅ベースのブロック、及びサンプルプレートの温度は、K型熱電対によって監視されます。- ドアを開け、急速に銅をサンプルプレートを置きますベースブロックは、その後、ドアを閉じます。
- 手動で時間当たり10標準立方フィート(SCFH)で窒素流量を設定するためにガス流量計を調整します。
- 相対湿度が常に25%未満である保証するために、湿度計と微調整ガス流量計による乾燥チャンバ内の相対湿度を監視します。
- K型熱電対によってサンプルプレートの温度を監視し、サンプルプレートは、実験又は対照を室温(25℃)が5℃になるまで手動で水循環温度を調整します。
注:設計温度でサンプルプレートを安定させるために、水循環装置の温度は、典型的には、設計されたサンプルよりも低い0〜5℃に設定されています。例えば、サンプルプレートに5℃を維持するように、水循環装置の温度設定は、0℃〜2の範囲です。 25℃でのサンプルプレートを維持するために、水循環装置の温度設定は23℃〜25℃の範囲です。 - 必要な温度と相対湿度はサンプル堆積の前に( 表1)に達していることを確認します。
注:異なるサンプルプレートの温度が乾燥プロセスのすべてのパラメータ、ならびにそれらの設定値を表1に示します。
注:室のドアを長時間開いている場合は、低いサンプルプレートの温度では、サンプルプレート上の結露が発生することがあります。結露が発生した場合は、ドアを閉じて、結露が出て乾燥するまでの任意のサンプルを堆積しないでください 。
- マトリックスと分析物溶液の調製
- マトリックス溶液の調製
- 50%DDW水溶液:50%アセトニトリル(ACN)と0.1 M THAP溶液を調製します。
- 検体の準備
- DDWで10 -4 Mマルトトリオース溶液を調製します。
- 10 -5 Mのブラジキニン断片(1-7)溶液を50%アセトニトリル中で調製します(ACN):50%DDW水溶液。
- マトリックス溶液の調製
2.サンプル沈着と乾燥
- プレミックス0.1 MのTHAP液の0.25μlの10 -4 Mのマルトトリオースまたは10 -5 Mブラジキニンフラグメント(1-7)マイクロ遠心チューブ内のソリューションの0.25μlの。
- 3秒間混合溶液をボルテックス。
- 遠心管の底に溶液を回収するために2秒(2,000×gで)混合液を遠心分離。
- 乾燥室のドアを開け、慎重にピペットでサンプルプレート上に溶液0.1μLを堆積し、すぐにドアを閉めます。
- 試料液滴が乾燥するのを待ちます。
注:典型的に観察された乾燥時間の異なるサンプルプレートの温度を表1に記載されていると5℃のサンプルプレートの温度は、平均乾燥時間が800〜1000秒です。 25°Cのサンプルプレート温度について、平均乾燥時間は100〜150秒ですEC。 - 乾燥させた後、乾燥室の扉を開きます。
- 室温(25℃)での水循環温度を設定します。
注:サンプルプレートは、乾燥工程中に、室温(25℃)で常に保たれている場合は、このステップをスキップします。 - 室温(25℃)にサンプルプレートの温度が戻った後、乾燥室からサンプルプレートを取り外します。
- 5Xの実体顕微鏡下でのサンプルの形態を調べ、スナップショット明視野像を取ります。
注:予想通りの結晶形態ではない場合は、同様の手順を使用して新しいサンプルを用意する必要があります。典型的な結晶形態は、図2の上のパネルに示されています。
注:このような5°Cなどの低サンプルプレート温度、との例では、乾燥室からそれを取る前に室温にサンプルプレートをウォームアップすることが重要です。サンプルを堆積すると、予混合solutioを保管しないでください10秒以上のピペットの先端中のn。サンプルを堆積した後、再び予混合ソリューションを使用しないでください 。 図2の上のパネルは、異なるサンプルプレートの温度を用いて調製した試料の明視野画像を示します。
3.質量分析データ解析
- 質量分析データ集録
注:調製後、試料をイメージング質量分析を用いて分析することができます。現在の研究では、イメージングMS実験を実験室内蔵同期デュアル極性TOFを使用して行われる(DP-TOF)イメージング質量分析計。撮像能力を持つ15市販MALDI-TOF質量分析計は、また、そのような実験に適しています。質量分析計は、線形抽出と最適化された抽出遅延を有する陽イオンモードで操作されます。イオンの運動エネルギーは、20 kVです。レーザービームの大きさは、試料表面上の直径が35μmであり、すべてのスポットのスペクトルAVEあります5レーザーショットの怒り。- MALDI質量分析計にサンプルプレートを挿入します。
- ステップ2.1から2.9に調製した試料を撮像する質量分析を実行します。
- 結果ウィンドウに表示される質量リストから特有の質量ピークを選択して、2次元イオン画像をプロットする「2D」をクリックします。
注:THAPと混合マルトトリオースのために、特徴的なピークは、マルトトリオース、プロトン化THAPをナトリウムイオン付加し、THAPをナトリウムイオン付加されています。 THAPと混合ブラジキニン断片(1-7)について、特徴的なピークは、ブラジキニンフラグメント(1-7)、プロトン化THAPをプロトン化、およびTHAPをナトリウムイオン付加が含まれます。 - 信号強度の上限と下限を決定するために、ポップアップウィンドウに調整ボタンをクリックして、「画像を保存」をクリックします。この設定は、イオンの画像のコントラストを定義します。
注:データのすべての個々のセットでは、ひび割れ領域及び低輝度を示すヌルスポットが除去されます。 - イオンを観察し、比較しますステップ2.9で撮影された明視野像と画像。
注記:特定のイオンの画像のイメージング質量分析法及び構造は、市販の機器を使用して達成することができます。データ収集および解析ソフトウェアの様々な、ユーザーは、高品質の画像を取得するために、機器ベンダーが提供するソフトウェア命令に従ってください。
- データ分析
注:サンプルの不均一性を定量的に分析されます。このデモでは、すべてのサンプルは、イオンの空間分布を分析するために、社内で開発されたソフトウェアにより、複数の同心円状の領域に分割されています。分析はまた、スタンドアロンのデータ分析ソフトウェアを用いて行うことができます。- 重要でない領域を除去するために、結果ウィンドウに表示されているイオン像にヌルスポットやひび割れ領域をクリックしてください。
注:この手順では、イオン像の本質的な領域を定義します。 - イオン像の最外層を見つけるために、「エッジを見つける」ボタンをクリックします。
- データベース内の最も外側の層のイオン存在情報を保存し、同時にイオン像から、この層を除去するために、「控除」をクリックします。この最外層を表すチェックボックスが結果ウィンドウの「出力データ」リストに表示されます。
- イオン像の中心が定義されるまで繰り返して、3.2.2と3.2.3を繰り返します。
- クリックして、「出力データ」リストのすべてのチェックボックスを選択して、データをエクスポートする「エクスポート」をクリックします。
- イオンの空間分布情報を取得するために、すべての層の平均イオン存在を計算するために、表計算ソフトを使用してエクスポートしたデータを開きます。
- 重要でない領域を除去するために、結果ウィンドウに表示されているイオン像にヌルスポットやひび割れ領域をクリックしてください。
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Representative Results
明視野画像並びにサンプルプレート5の温度25℃で調製マルトトリオース及びブラジキニンフラグメント(1-7)のMS画像は、図1に示されている。ナトリウムイオン付加マルトトリオース、イオン信号主としてを移入の場合それは、25℃のサンプルプレートの温度を用いて調製された試料領域の周囲に。 5℃にサンプルプレートの温度を下げることにより、信号がサンプル全体の領域にわたって均一に移入します。 5°Cの下でサンプルを調製する唯一の顕著な欠点は、25°Cで作製した試料よりも多くの亀裂があるということです。プロトン化ブラジキニン断片(1-7)のイオン像は、ナトリウムイオン付加マルトトリオースのものと同様の傾向を示しています。イメージングMSの結果は下のサンプルプレートの温度下準備のサンプルが大幅に分子を再配布し、異質性を減らすことができることを示唆しています。
図3は、5〜25°Cのサンプルプレートの温度下で調製マルトトリオースおよびブラジキニンフラグメント(1-7)のための統計分析の結果を示しています。各サンプルについて、平均強度は正規化されます。 25°Cのサンプルプレート温度でナトリウムイオン付加マルトトリオースの場合には、中心の信号強度は、5°Cのサンプルプレートの温度を有するものよりもはるかに低いです。 5℃に25からサンプルプレートの温度を下げる際にプロトン化ブラジキニン断片(1-7)の結果も少ない変化を示します。
図1:試料乾燥システムの写真。乾燥室は、アクリル製です。チャンバは、低い相対湿度を維持するために、室温、窒素ガスでパージされます。プログラムされた恒温水循環装置を備えた銅ベースブロックは、ステンレス鋼サンプルプレートの温度を調節するために使用されます。温度計は、空気、銅ベースブロック、およびサンプルプレートを監視している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:良好な信号の均一性の低下、サンプルプレート温度の結果明視野像(上の画像)だけでなく、マルトトリオース(a)およびブラジキニン断片(1-7)のMALDI画像(下の画像)(b)の THAPを用いて調製別のサンプルプレート温度下。 MALDIそれぞれ、総スペクトルから:とプロトン化ブラジキニン断片(1-7)(757のm / z):イメージは、ナトリウムイオン付加マルトトリオース(527のm / z)を抽出することにより得ました。イオン画像の画素サイズは35μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3: サンプルプレートの温度は乾燥工程中に減少する信号変化が減少 MALDI画像はマルトトリオース(a)およびブラジキニン断片(1-7)で得られた(B)は、異なるサンプルプレートの温度下でTHAPで調製。赤と青のデータは、それぞれ、25及び5℃のサンプルプレート温度で調製された試料を示します。グラム "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンプルプレート温度(°C) | サンプル | 気温(°C) | 相対湿度(RH%)と | 乾燥時間(秒) |
5 | THAPとマルトトリオース | 20±3 | <25 | 800 - 千 |
THAPとブラジキニン断片(1-7) | ||||
25 | THAPとマルトトリオース | 25±3 | 100から150 | |
THAPとブラジキニン断片(1-7) |
表1: 実験パラメーターと異なるサンプルプレートの温度下で乾燥条件。
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Discussion
以前の理論的予測に基づいて、液滴内の温度誘導性の流体力学的な流れは、溶媒の蒸発によって誘導される外向きの毛細管流れを克服することができます。温度は、液滴増大内勾配時の分子のような内部再循環の効率が向上します。周囲温度でその周囲を維持しながら、5℃下、サンプルプレートの温度を維持した場合に予測された結果によれば、液滴内の再循環流の平均速度は、外側にキャピラリーフローの約4倍高速です。サンプルプレートの温度が周囲と同じである場合、再循環流の平均速度は、外方毛細管流動よりも1,800倍遅いです。この計算の結果は、試料調製中にサンプルプレートの温度を低下させることが有利であることを示しています。実験観察は、この予測に同意します。
サンプルプレート気性ature正確サンプル調製プロセスを通して制御する必要がある。 表1は、異なるサンプルプレートの温度下で試料0.1μlの典型的な液滴の乾燥時間を示しています。プレート上の試料液を付着させる前に、サンプルプレートの表面が乾燥していることを保証することが重要です。低温下でのサンプルを調製する際に結露が発生した場合は凝縮水がサンプル領域を拡大し、ソリューションを希釈するので、試料溶液の堆積はお勧めしません。従って、25%以下の乾燥室の相対湿度を維持することが重要です。低温下でのサンプルを調製する際に加えて、サンプルプレートは乾燥室からそれを取る前に室温まで昇温する必要があります。サンプル結晶化が完了した後にマイナーな水の凝縮はサンプル集団を変更しませんが、かなりの結露は避けるべきです。
たての予混合溶液の使用はRECOMです補修。予混合溶液を空気にさらされると、試料溶液の予備結晶化が起こり、最終的な結晶サイズおよび形態が変化してもよいです。したがって、ピペット手順は、ピペットチップ内に予備結晶から試料液滴を防止するために、典型的に10秒以内に、妥当な効率で行うべきです。適切な結晶形態は、質量分析の前に生産されることを保証するために、顕微鏡下でサンプル形態を観察することをお勧めします。結晶形態は、必要に応じて堆積プロセスを繰り返し、期待ほど良くはない場合。
私たちの理論的、実験的研究によると、周囲条件下で設置低温サンプルプレートに試料を調製することは非常にMALDI-MSのデータ再現性と品質が向上します。その後の実験では、この試料調製方法で信号強度の有意な向上を示します。トンによって得られた実験データ彼の方法は、かなり定量分析のためのMALDI質量スペクトルの信頼性を向上させます。溶液組成物または表面特性の変化を含む他の方法と比較して、8,16-18変化乾燥条件は、単純で、従来の試料について、より一般的に適用可能です。したがって、ほとんどの質量分析ユーザーは、通常のアプリケーションでそれから利益を得ることができます。
サンプルプレートの温度を下げるとMALDI信号の均一性を改善することは、いくつかの他の一般的な行列のために有効です。低温試料乾燥条件下でマトリックスが最近報告されたように、例えば、THAPでαシクロデキストリン(α-CD)信号の均一性及びαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を向上させる。 図14は、欠点変化サンプルプレートと温度は、この方法は、低い温度条件での長いサンプルの乾燥時間に、現在、ハイスループット分析に適していないということです。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
Detergent powder | Alconox | 242985 | |
Methanol | Merck | 106009 | |
Acetonitrile | Merck | 100003 | |
2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
Equipment | |||
Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
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