Introduction
RNA-bindende eiwitten (RBPs) vertegenwoordigen ongeveer 10% van S. cerevisiae eiwitten 1,2 en ongeveer 15% zoogdiereiwitten 3-5. Ze zijn betrokken bij vele cellulaire processen zoals mRNA post-transcriptie verwerking en regelgeving, vertaling, ribosoom biogenese, tRNA aminoacylering en modificatie, chromatine remodeling, en nog veel meer. Een belangrijke subgroep van RBPs is de mRNA-bindende eiwitten (mRNPs) 6,7. In de loop van mRNA rijping, verschillende RBPs binden het transcript en bemiddelen zijn nucleaire verwerking, export uit de nucleus, cellulaire lokalisatie, vertaling en degradatie 6-8. Zo is de afzonderlijke reeks RBPs gebonden aan een bepaalde transcript op elk tijdstip is bepalend voor de verwerking en uiteindelijk zijn lot.
De identificatie van RBPs geassocieerd met een mRNA kan een aanzienlijke verbetering van ons inzicht in de processen die ten grondslag liggen hun post-transcriptie regulatie. diverse genetische, Microscopische, biochemische en bioinformatica methoden zijn gebruikt om eiwitten betrokken bij regulatie mRNA (beoordeeld in 9-11) te identificeren. Slechts enkele van deze werkwijzen mogelijk zijn om eiwitten gekoppeld aan een specifiek doelwit mRNA. Opmerkelijk is de gist Drie hybridesysteem (Y3H), die gebruik maakt van mRNA van belang als lokaas om een expressiebibliotheek te screenen in gistcellen. Positieve klonen worden gewoonlijk waargenomen door een groeiselectie of reporterexpressie 12-14. Het belangrijkste voordeel van deze werkwijze is het groot aantal eiwitten die in een cellulaire omgeving en het vermogen om de sterkte van de RNA-eiwit interactie te meten kan worden gescand. Nadelen zijn het relatief grote aantal vals-positieve resultaten als gevolg van niet-specifieke binding en de hoge kans op vals negatieve resultaten ten dele, verkeerde vouwing van het fusieproteïne roof of aas RNA.
Een alternatief voor de genetische benadering affiniteit opzuiveringcatie van RNA met zijn geassocieerde eiwitten. PolyA bevattend mRNA kan worden geïsoleerd door middel van oligo dT kolommen en hun geassocieerde eiwitten worden gedetecteerd door middel van massaspectrometrie. Het RNA-eiwit interactie is geconserveerd in zijn cellulaire context door verknoping, die op korte afstand covalente bindingen maakt. Het gebruik van de oligo dT kolom geeft een globaal overzicht van het gehele proteoom die is gekoppeld aan een poly A-mRNA bevattende 3,5,15. Dit betekent echter geen volledig overzicht van eiwitten die zijn gekoppeld aan een bepaalde mRNA. Zeer weinig methoden beschikbaar om dergelijke identificatie bereiken. De PAIR methode is gebaseerd op de transfectie van nucleïnezuur complementair aan de doelwit mRNA 16,17. Het nucleïnezuur is ook verbonden met een peptide, die het mogelijk maakt om verknoping RBPs in dichte nabijheid van de interactieplaats. Na verknoping kunnen de RBP-peptide-nucleïnezuur worden geïsoleerd en onderworpen aan analyse proteomics. Onlangs, een van aptameergebaseerde methodiek wassucces toegepast op extracten van zoogdiercellijnen 18. Een RNA aptameer met verbeterde affiniteit voor streptavidine is ontwikkeld en gefuseerd aan een sequentie van belang (AU-rijk element (ARE) in dit geval). Het aptameer-ARE RNA werd gekoppeld aan streptavidine korrels en gemengd met cellysaat. Eiwitten die gekoppeld aan de ARE sequentie werden gezuiverd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Hoewel deze methode ontdekt associaties die zich buiten de mobiele instellingen (bijvoorbeeld in vitro), is het waarschijnlijk in de toekomst worden gewijzigd om de aptameren introduceren in het genoom kunnen kopen, waardoor de isolatie van eiwitten geassocieerd met het mRNA terwijl in de cellulaire milieu (dat wil zeggen, in vivo). In gist, waarbij genetische manipulaties goed zijn gevestigd, de snelle methode (ontwikkeld in Prof. Jeff Gerst's lab) geeft een beeld van de in vivo verenigingen 19. Rapid combineert de specifieke en sterke binding van het MS2 manteleiwit (MS2-CP) naar het MS2-RNA-sequentie, en de streptavidine-bindende domein (SBP) om geconjugeerde streptavidine beads. Dit maakt efficiënte zuivering van MS2-mRNA's hebben met streptavidine beads. Bovendien, de expressie van 12 exemplaren van MS2 lussen kunnen maximaal zes MS2-CP's gelijktijdig binden aan het RNA en verhoging van de efficiëntie van haar isolement. Dit protocol werd daarom voorgesteld om de identificatie van nieuwe mRNA-geassocieerde eiwitten mogelijk zodra de geëlueerde monsters worden onderworpen aan proteomics analyse met massaspectrometrie.
We hebben onlangs gebruikt om snelle nieuwe eiwitten geassocieerd met de gist PMP1 mRNA 20 identificeren. PMP1 mRNA werd eerder aangetoond geassocieerd te zijn met de ER membraan en het 3 'onvertaalde gebied (UTR) bleek een belangrijke determinant in dit verband 21 zijn. Aldus RBPs dat PMP1 3 'UTR binden waarschijnlijk een belangrijke rol spelen bij de lokalisatie. Snelle gevolgd door vloeistofchromatografiey-massaspectrometrie / massaspectrometrie (LC-MS / MS) resulteerde in de identificatie van vele nieuwe eiwitten die interageren met PMP1 20. Hierin geven we een gedetailleerd protocol van de snelle methode, belangrijke controles die moeten worden gedaan, en technische tips dat de opbrengst en specificiteit kunnen verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Plaats een die bestaat uit 12 MS2-bindingsplaatsen (MS2 loops; MS2L) in de gewenste genomische locus, meestal tussen het open leeskader (ORF) en de 3 'UTR. Een gedetailleerd protocol voor deze integratie is elders 22 verstrekt. Controleer de juiste inbrengen en expressie door PCR, Northern analyse of RT-PCR 20,23. Het is belangrijk te controleren dat aan de greep niet de synthese van de 3'UTR. Bovendien moet een plasmide dat MS2-CP gefuseerd met SBP onder de expressie van een induceerbare promoter (methionine depletie) worden ingebracht in de cellen 24. Een identieke stam, met uitzondering van het ingebrachte MS12 lussen worden gebruikt als controle voor de detectie van niet-specifieke signalen.
1. snelle zuivering
- 500 ml kweken van gistcellen (gebruik 250-1,000 ml gistcellen afhankelijk van het expressieniveau van het gen van belang) tot expressie MS2-mRNA hebben 20 enMS2-CP-GFP-fusie-eiwit SBP 24 OD 600 0,8-1,0 bij 30 ° C in het geschikte groeimedium (bijvoorbeeld Synthetic Dextrose (SD) selectief medium).
- Centrifugeer cellen bij 3000 xg gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant.
- Was de cellen in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), centrifuge zoals hierboven (stap 1,2), resuspendeer in een gelijk volume (stap 1,1) SD zonder methionine en incubeer gedurende 45 - 60 minuten bij 30 ° C om expressie van het MS2 induceren -CP-GFP-fusie-eiwit SBP.
Let op: Langere inductietijd kan aggregatie van GFP veroorzaken. - Zet opzij 10 ml van cellen en extraheren RNA uit dit monster met behulp van de eenvoudige "hot fenol" -methode 25. Let op: Fenol is zeer giftig en moet worden behandeld in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften.
Opmerking: Dit RNA is een goede referentie voor de kwaliteit van geïsoleerde RNA (Figuur 1A). - Voor 500 ml cellen, voeg 1,35 ml 37% formaldehyde tot een uiteindelijke concentration van 0,1% aan het RNA-eiwitcomplexen verknopen. Verder incubatie bij 30 ° C gedurende 10 minuten. Let op: Formaldehyde is zeer giftig en moet worden behandeld in overeenstemming met de veiligheidsvoorschriften.
- Voeg 26,5 ml 2,5 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M en incubeer gedurende 3 min verknoping te stoppen. Vanaf deze stap op, zet alles op het ijs om RNA degradatie te minimaliseren.
- Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 4 min bij 4 ° C en wassen met 45 ml koude 1x PBS.
- Resuspendeer cellen in 1 ml RAPID Lysis buffer per 100 ml van de initiële celkweek.
- Gesplitst in porties van 500 pl in-schroefdop microcentrifugebuizen en voeg ~ 400 mg van gekoeld glazen kralen aan elke hoeveelheid (ongeveer een volle 0,2 ml PCR-buis).
- Lyse cellen in een kraal klopper gedurende 3 min. Meteen het lysaat op ijs.
Opmerking: Cell lysis releases cellulaire RNasen, die de belangrijkste oorzaak van RNA afbraak. Rapid Lysis buffer bevat een hoge concentratie van RNase inhibitors, zoals de niet-specifieke RNase inhibitor heparine en specifieke inhibitoren. Werken snel en het houden van alles koud is ook een aanrader. - Breng het lysaat nieuwe buizen. Pierce een klein gat in de bodem van elke microcentrifugebuis met een hete naald (0,8 mm x 40 mm) en plaats de micro-centrifugebuisjes bovenop de 15 ml buizen. Met de kop van een 5 ml spuit als adapter tussen de microfuge buizen en 15 ml buizen. Centrifugeer de buizen montage bij 3000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C
- Breng de doorstroom van de 15 ml buis naar een nieuwe 1,5 ml buis en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen.
- Pool supernatanten Uit 1,5 ml buizen in een 15 ml buis en vernietiging 1/50 en 1/100 volume van het lysaat voor RNA en eiwit isolatie, respectievelijk.
Opmerking: Deze zullen als "Input" monsters voor verdere analyse (figuur 1) dienen. - Voeg 300 ug per 500 ml avidine initial gistcultuur en incubeer gedurende 30 min (dit kan worden verminderd tot 10 min) bij 4 ° C onder constant rollen (10 rpm).
Opmerking: Avidine blokken biotine en gebiotinyleerde eiwitten binden aan de streptavidineparels. - Voorwas streptavidine korrels vóór incubatie met het cellysaat.
- Breng ongeveer 300 ul van de streptavidineparels slurry naar een 1,5 ml microcentrifugebuis en het bovendeel supernatant. Dit resulteert in 250 pl parels. Was de kralen tweemaal met 1 ml RAPID lysisbuffer. Centrifugeer de streptavidineparels bij 660 xg gedurende 2 min bij 4 ° C tussen elke stap.
- Blokkeer de kralen door het incuberen gedurende 1 uur met 0,5 ml van snelle lysis buffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA en 10 pl 10 mg / ml gist tRNA. Kralen kunnen worden gelaten O / N op blokkeeroplossing bij 4 ° C met rotatie indien noodzakelijk.
- Was tweemaal met 1 ml RAPID Lysis buffer.
Opmerking: Magnetische kralen kunnen ook worden gebruikt om de tijd en backgr verminderenond. Deze hebben echter een lagere capaciteit dan sepharose korrels.
- Voeg 250 ul van de voorgewassen streptavidine kralen om de avidine-bevattende lysaat (uit stap 1,14) en incubeer 1 uur bij 4 ° C met een constante rotatie (10 tpm).
Opmerking: Deze incubatietijd is een compromis tussen voldoende binding tijd en het minimaliseren kansen voor RNA-afbraak. - Centrifugeer bij 660 xg gedurende 2 min bij 4 ° C om de streptavidineparels wissen en breng het supernatant naar een nieuwe buis van 15 ml. Vernietiging 1/50 en 1/100 volume van het lysaat voor RNA en eiwit isolatie, respectievelijk.
Let op: Dit zullen de "niet geconsolideerd" samples. - Was de korrels met 1 ml RAPID lysisbuffer, schud voorzichtig naar een nieuwe 1,5-ml microcentrifuge buis en centrifugeer zoals in stap 1.17. Herhaal deze stap drie keer.
- Was de korrels met 1 ml wasbuffer snelle en ditmaal draaien (10 opm) gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap twee keer. Was de korrels met 1 ml 1x PBS en centrifugeer zoals hierboven.
- Was de korrels opnieuw met 120 pl 1x PBS. Centrifuge zoals hierboven, en neem de hele supernatant voor RNA en eiwit-extractie als de "Wash" sample.
Opmerking: Dit laatste wasbeurt monster zal de striktheid van de wassingen geven en van hetzelfde volume als de elutie monster moet zijn. Dit wordt het verwerken en laden vereenvoudigen volgende assays. - RNA en RNA-geassocieerde eiwitten uit de kolom, voeg 120 ul van 6 mM biotine in 1x PBS en incubeer gedurende 45 minuten bij 4 ° C met een constante rotatie (10 tpm).
- Centrifugeer de kralen als hierboven en het geëlueerde materiaal naar een nieuwe 1,5 ml buis. Spin de geëlueerde monster opnieuw en breng de bovenste fase naar een nieuwe 1,5 ml buis tot geen overdracht van kralen te garanderen.
- Monsters nemen voor RNA of eiwit-extractie.
Opmerking: Het volume genomen moet worden op het volgende test en expressie niveau van het RNA of eiwit van belang. Als richtlijn voor Noord-analyse 26, neemt 80% van de steekproef, voor Western blot 23,27 of RT-PCR 28, neemt 20%, en voor massaspectrometrie 29 om nieuwe eiwitten te ontdekken, neem het gehele monster.
2. RNA-extractie
- Voeg een gelijk volume van 2x verknoping Omkering buffer en incubeer gedurende 45 minuten bij 65 ° C. Doorgaan direct voor RNA-extractie.
Opmerking: De verknoping Reversal buffer bevat ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), die aanzienlijk verbeterd RNA-extractie 20. - Gebruik de standaard fenol: chloroform methode 26 RNA te extraheren uit de "input" en "niet-gebonden" monsters (stappen 1.13 en 1.17).
Opmerking: Deze monsters bevatten veel van de RNase inhibitor heparine, die daarop achterzijde Transcriptase- (RT) met gebruikmaking van assays kan remmen (bijvoorbeeld, RT-PCR), dus LiCl neerslag 30 wordt aangeraden om het te verwijderen. De WAsh "en" elutie "samples (stappen 1.21 en 1.24) bevatten lage hoeveelheden RNA en worden neergeslagen door middel van de volgende stappen. - Voeg een gelijk volume 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) en twee volumes 100% ethanol aan het "wassen" en "elutie" samples. Incuberen bij -80 ° C gedurende ten minste 2 uur.
Opmerking: Guanidinium zal efficiënt eiwitten denatureren en daardoor remmen RNases en proteasen in het monster. - Centrifugeer bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 30 min en gooi het supernatant. Was de pellet met koude 80% ethanol en centrifugeer opnieuw bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Los het RNA pellet in 400 ui van RNase vrij water en neer te slaan opnieuw om overgebleven GuHCl of andere verontreinigingen te verwijderen. Voeg 40 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,2 en 800 pi 100% ethanol, incuberen bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
- Centrifuge en was als in stap 2.4 en verwijder alle ethanol met een 10 ul tip. Resuspendeer de RNA Pellet in 10 pi RNase vrij water. Wees extra voorzichtig als het RNA pellet is meestal niet zichtbaar is.
Opmerking: De monsters kunnen worden gebruikt voor Northern-analyse zoals beschreven in 23 (figuur 1).
3. Eiwit Voorbereiding voor Western Blot of massaspectrometrie Analyse
- Voeg 1/3 volume van 4 x Laemmli monsterbuffer (LSB) eiwit monsters en incubeer 45 minuten bij 65 ° C om de verknoping van RNA en eiwitten te keren.
Opmerking: De monsters worden bewaard bij -20 ° C. - Run eiwitten op een SDS-polyacrylamidegel (SDS-PAGE) 31. Stel het percentage van de gel volgens de grootte van de eiwitten te analyseren.
Opmerking: 10% acrylamidegel geeft uiteenlopende scheiding en is goed als een eerste benadering. - Transfer eiwitten aan het membraan volgens de standaard immunoblot analyse 27 voor het regelen van isoleerrendement (figuur 1C). Kleuren met Coomassie Blue ofwel R250 of zilver vlek voor massaspectrometrie analyse.
Opmerking: zilverkleuring is de voorkeur omdat deze gevoeliger en zorgt voor een betere detectie (Figuur 1B). Kleuring kan met handmatig bereide oplossingen of commerciële kits. De incubatietijd van de gel in de uiteindelijke kleurstofoplossing moet experimenteel worden bepaald. Lange incubatietijd kan een lage overvloedige eiwitten zichtbaar te maken, maar kan leiden tot sterk uitgedrukt eiwitten zoals MS2-CP-SBP-GFP tot meer dan lood en kunnen de omliggende eiwitten maskeren in hun nabijheid. Daarnaast kan een hoge achtergrond plaatsvinden. Volg de reactie zorgvuldig en voeg Stop Solution op het juiste moment. - Knip bands uit de gel en overbrengen naar 1,5 ml buizen. WINKEL monsters bij -20 ° C, of stuur voor eiwitextractie en trypsine digestie gevolgd door LC-MS / MS analyse 32.
- Als alternatief proteomische benadering van de gel scheidingsstap sluiten verteren geëlueerde materiaal uit stap 1,24 ZODATlutie met behulp van trypsine en onderworpen aan LC-MS / MS analyse 33.
Let op: weglaten van de SDS-PAGE scheiding vereenvoudigt het protocol en verhoogt de opbrengst. Echter mogelijk monsters het reinigingsmiddel NP-40, die massaspectrometrie analyse remt bevatten. Om dit probleem op te lossen, voert u de volgende stappen:- Run eiwit op SDS-PAGE 31 gedurende 10 - 15 min.
- Knip het hele gedeelte van de baan (dat wil zeggen, waar de eiwitten zich bevinden).
Opmerking: Het eiwitmonster kan een aanzienlijke hoeveelheid van het MS2-CP-SBP eiwit dat signalen van lage abundantie proteïnen kunnen verhullen omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Snelle maakt de isolatie van een specifieke doel-RNA met zijn geassocieerde eiwitten. Cruciaal voor het succes houdt het RNA intact zoveel mogelijk, waardoor een voldoende hoeveelheid eiwitten verkregen. Om de isolatie efficiëntie en kwaliteit van RNA te bepalen, wordt Northern analyse uitgevoerd (Figuur 1A). Northern-analyse heeft het voordeel van de efficiëntie en kwaliteit van de snelle rechtstreeks rapporteert. Aldus kan de relatieve hoeveelheden van volledige lengte en afbraakproducten worden bepaald in een enkele run. Ribosomaal RNA (rRNA) worden gemakkelijk gedetecteerd in de ethidiumbromide kleuring, en het gebrek aan rRNA in de elutie monster duidt de stringentie van zuivering. De stringentie en specificiteit van de zuivering wordt verder aangetoond door het ontbreken van een signaal van een niet-gecodeerde mRNA in de elutie monsters (ACT1 onderste paneel). De schijnbare signaal in de FPR1 baan, die niet van de omvang van WERKW1, een overblijfsel uit prevorige hybridisatie met de probe MS2L. De Northern-analyse blijkt dat de input RNA enigszins gedegradeerd vergelijking met RNA dat werd gezuiverd met de hete fenol protocol (c / o ACT1 probe paneel). Dit wordt toegeschreven aan de langere en ingewikkelder snelle protocol. Niettemin een aanzienlijke hoeveelheid van volledige lengte, hebben specifiek RNA geïsoleerd, zoals blijkt uit de sterke signaal in de elutiefractie (MS2L probe).
Eiwitmonsters kunnen worden op SDS-PAGE en gekleurd door zilverkleuring vóór proteomics analyse (Figuur 1B). Een monster geïsoleerd van controle, ongemerkte cellen (-MS2L) is nuttig bij het onderscheiden van niet-specifieke verenigingen uit RNA-afhankelijke degenen. Derhalve is slechts bands die sterker in het gelabelde monster (+ MS2L) zijn uit de gel gesneden en meegenomen voor LC-MS / MS. Western-analyse met algemene RBPs wordt ook aanbevolen om de efficiëntie van eiwitten co-zuivering vermeld (figuur1C). Hierin gebruikten we Yef3, waarvan bekend is dat interactie met PMP1 20 of GFP, waardoor de algehele efficiëntie en specificiteit van de isolatie geeft. Interessant is dat de efficiëntie van Yef3 isolatie lijkt te verschillen PMP1 en FPR1 en veel lager vergeleken met GFP.
Figuur 1. Specifieke Isolatie van MS2L-gelabeld RNA's en identificatie van geassocieerde eiwitten. De resultaten van twee verschillende RNA's die werden onderworpen aan een snelle (PMP1 en FPR1) worden gepresenteerd. (A) Northern blot analyse van RNA-monsters gezuiverd uit een snelle experiment. RNA werd op een agarosegel en gekleurd met ethidiumbromide (bovenste paneel). De gel werd geblot op nylonmembraan en onderworpen aan hybridisatie met de probes aangegeven (onderste panelen). De geanalyseerde monsters zijn: fast-cellyse (hot fenol [stap 1.4]), RaPID cellysis (ingang [stap 1.13]) en na elutie met biotine (elutie [stap 1.24]). (B) Silver vlek van eiwitten uit RAPID met MS2-gelabelde en ongelabelde cellen. Eiwitmonsters van elutiefracties van MS2-gelabelde PMP1 (+ MS2L) of untagged (-MS2L) controle werden in SDS-PAGE en zilverkleuring. Banden met differentiële intensiteit (aangeduid met een asterisk) werden uit de gel gesneden en bepaald met massaspectrometrie analyse. De pijl geeft het MS2-CP-GFP-fusie-eiwit SBP, die gelijk eiwitbelading aantoont. Irrelevant rijstroken werden uitgesneden voor de duidelijkheid. (C) Western analyse van de positieve controles. Western blot met antilichamen die de Yef3 of GFP rest van het MS2-CP fusie-eiwit herkennen uitgevoerd. Irrelevant rijstroken werden uitgesneden voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende methoden de isolatie van specifieke mRNAs hun geassocieerde eiwitten 11,34 35 identificeren. Deze werkwijzen passen in vitro en in vivo strategieën RNA-eiwitinteracties sonde. In vitro werkwijzen Incubeer exogeen RNA getranscribeerd met cellysaat te isoleren RBPs vangen en RNP-complexen 36,37. Een effectieve aanpak van dit type werd onlangs gepresenteerd, die de identificatie van nieuwe eiwitten die een regulerende RNA-motief 18 binden ingeschakeld. Een nadeel van deze werkwijzen is de binding van aspecifieke RBPs omdat de koppeling plaatsvindt buiten de cellulaire omgeving. In vivo werkwijzen, waarbij eiwitten worden verknoopt terwijl in hun natuurlijke omgeving, kan een beter zicht op RNA-eiwitassociatie verschaffen. Bovendien verknoping maakt hogere stringentie tijdens isolatie en dus hogere specificiteit. De PAIR benadering 17 maakt gebruik van de transfectie van de antisensesequentie aan het doel-RNA om een peptidedeel tot nabij RBPs sturen. Het peptide-RBPs kan vervolgens worden verknoopt en geïsoleerd door middel van kralen die zijn gekoppeld aan een sequentie die complementair is aan de antisense sequentie. De PAIR methode is zeer voordelig vanwege de eenvoudige toepassing van vele celtypen zonder omslachtige genomische manipulaties. Het is echter afhankelijk van de efficiëntie van transfectie en wanneer een laag percentage cellen accepteren antisense zal lage werkzaamheid hebben. Bovendien wordt de isolatie van de RBP-peptide-antisense sequentie verkregen door middel van magnetische streptavidine korrels die zijn gekoppeld met gebiotinyleerd oligonucleotide complementair is aan de antisense nucleïnezuur. De veelheid van interacties (magnetische korrels, streptavidine-biotine en basenparing) kan de stringentie en efficiëntie van de isolatie te beperken. De snelle methode 24 hier beschreven biedt een alternatief voor deze beperkingen in een aantal aspecten. Eerst, thij integratie van het MS2 lussen in de genomische loci zodat alle cellen uitdrukken, waardoor het rendement toeneemt. Ten tweede maakt de hoge affiniteitsinteractie van de MS2-CP-GFP-SBP twaalf MS2 lussequenties mogelijk maakt die in vivo te binden. Ten derde, de fixatie van de RNA-eiwit-interactie stelt strengere wast en vermindert de identificatie van niet-specifiek gebonden eiwitten. Tenslotte de SBP domein bindt streptavidine parels met hoge affiniteit en gemakkelijk geëlueerd met vrij biotine.
Insertie van het MS2-lus de RNA raadzaam tussen de ORF en de 3 'UTR translatie verstoring te minimaliseren en om expressie van alle lussen te garanderen. Zes tot 24 MS2 lus herhaalt zijn eerder gebruikt voor het visualiseren van mRNA lokalisatie 38-40. De insertie van een lange reeks MS2 lussen kunnen veranderingen in de verwerking en de structuur van het RNA te veroorzaken; het zou het transcript destabiliseren of het repertoire van RBPs gebonden veranderente. In onze ervaring, 12 loops voldoende zijn om een efficiënte elutie van MS2-gelabeld RNA 20 te krijgen. In dit verband merken we op dat we meestal waargenomen extra kortere transcripten in onze noordelijke hybridisaties. Northern analyses met verschillende probes gebleken dat deze kortere vorm onder de MS2L en een deel van de 3 'UTR 20, indicatief voor voortijdige transcriptie terminatie. Dergelijke gevallen zijn waarschijnlijk de efficiëntie van de isolatie van eiwitten verbonden aan de 3 'UTR te verminderen. Daarom moet het aantal ingevoegde loops en hun locatie binnen het RNA worden verdeeld hoog rendement pull-down en transcript stabiliteit.
Het RNA moet intact blijven tijdens protocol efficiënte isolatie en detectie van de maximale reeks van eiwitten mogelijk maken. Kansen voor externe RNase besmetting kan worden verminderd door het dragen van handschoenen, zorgen voor een schone werkplek, het voorbereiden oplossing met RNase-vrij water, en bondig werkenen efficiënt protocol te verminderen. Niettemin vonden we dat de grootste bijdrage aan RNA afbraak de afgifte van cellulaire RNases het lysaat bij cellysis. Voorgesteld werd cryogeen malen van gistcellen met een mechanische molen resulteert in een betere 41 RNA zuivering. Dit kan worden berecht in de gevallen waarin significante afbraak wordt waargenomen met dit protocol.
Een gemeenschappelijk nadeel van pull-down assays is de isolatie van talrijke eiwitten die niet specifiek aan de kolom binden. Daarom is het gebruik van een giststam met niet-gecodeerde RNA is een belangrijke controle. Deze stam drukt de MS2-CP-GFP-fusie-eiwit SBP verder sluiten eiwitten die binden aan het fusie-eiwit en niet het doel-RNA. We merken op dat dit niet eiwitten die de MS2 lus zelf kunnen binden uit te sluiten, en deze moeten verder gevalideerd met het eiwit pull-down test. Figuur 1B laat zien dat we in staat waren om een aantal eiwitten die binden identificerenspecifiek aan PMP1 mRNA, en sommige werden vervolgens gevalideerd door een co-IP-test 20.
De snelle methode is momenteel beperkt tot gist systemen, met gebruikmaking van haar gerenommeerde site-specific integratie methodieken. Plaatsspecifieke integratieprotocollen worden momenteel ontwikkeld voor genen in andere systemen met de CRISPR-Cas systeem 42,43. Deze zullen van groot belang zijn in het uitbreiden van het gebruik van de snelle om extra systemen. Andere toekomstige toepassing van Rapid wordt voor de isolatie van RNA's die zijn gekoppeld aan een mRNA van belang. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het onderwerpen van het geïsoleerde materiaal RNA-seq plaats van LC-MS / MS. Gezien de belangrijke rol van kleine RNA's bij het reguleren van mRNA-expressie, deze toepassing waarschijnlijk van groot belang. Tenslotte verbeteringen in massaspectrometrie (MS) analyse en het gebruik van kwantitatieve MS methoden zoals SILAC zal resulteren in de kwantitatieve meting van mRNA-gebonden Proteins onder verschillende omstandigheden. RAPID kan worden gebruikt met gist gekweekt in medium verrijkt met zware isotopen en vergeleken met cellen gekweekt onder verschillende omstandigheden (zoals stress) met ongelabelde media 44,45. Toepassing van de snelle werkwijze met kwantitatieve MS analyse nauwkeurige metingen van de veranderingen in de RBP repertoire die zijn gekoppeld aan een bepaalde mRNA verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Prof. Jeff Gerst en Boris Slobodin voor hun nuttige adviezen bij het opzetten van de snelle protocol en het verstrekken van de noodzakelijke plasmiden. We danken ook dr Avigail Atir-Lande voor haar hulp bij het vaststellen van dit protocol en Dr Tamar Ziv uit de Smoler Proteomics Center voor haar hulp bij de LC-MS / MS analyse. Wij danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) voor de YEF3 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door subsidie 2011013 van de binationale Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R.
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
