Introduction
RNA-bindende proteiner (RBPs) utgjør ca 10% av S. cerevisiae-proteiner 1,2 og omtrent 15% av pattedyrproteiner 3-5. De er innblandet i mange cellulære prosesser som mRNA post-transcriptional behandling og regulering, oversettelse, ribosom biogenesis, tRNA aminoacylering og modifikasjon, kromatin remodeling, og mer. En viktig undergruppe av RBPs blir mRNA-bindende proteiner (mRNPs) 6,7. I løpet av mRNA modning, ulike RBPs binde transkripsjon og formidle sitt atom foredling, eksport ut av kjernen, cellulær lokalisering, oversettelse og degradering 6-8. Dermed blir distinkt sett med RBPs bundet til et bestemt transkript som helst punkt bestemmer dens behandling og til slutt dets skjebne.
Identifiseringen av RBPs forbundet med en mRNA kunne forbedre vår forståelse av prosessene som ligger bak deres post-transcriptional regulering. Diverse genetisk, Mikroskopiske, biokjemiske og bioinformatikk metoder har blitt brukt for å identifisere proteiner involvert i mRNA regulering (anmeldt i 9-11). Imidlertid er bare noen få av disse fremgangsmåter muliggjøre identifisering av proteiner forbundet med en bestemt mål-mRNA. Av notatet er Gjær Tre hybrid system (Y3H), som utnytter mRNA av interesse som agn for å screene et uttrykk bibliotek i gjærceller. Positive kloner blir vanligvis observeres gjennom et utvalg vekst eller reporter uttrykk 12-14. Den viktigste fordelen med denne fremgangsmåten er det store antall proteiner som kan skannes i et cellulært miljø og evnen til å måle styrken av RNA-proteininteraksjon. Ulemper omfatter relativt stort antall falske positive resultater på grunn av ikke-spesifikk binding, og stort potensial for falske negative resultater skyldes delvis, til misfolding av fusjonsproteinet byttedyr eller agn RNA.
Et alternativ til den genetiske tilnærmingen er Affiniteten purifierkasjon av RNA med assosierte proteiner. Poly A-inneholdende mRNA kan bli isolert ved hjelp av oligo dT-kolonner, og deres assosierte proteiner blir detektert ved massespektrometri. RNA-protein interaksjon er bevart i sin cellulære sammenheng ved kryssbinding, noe som gjør kort rekkevidde kovalente bindinger. Bruken av oligo dT-kolonnen gir en global oversikt over hele proteome som er forbundet med en hvilken som helst poly A-holdig mRNA 3,5,15. Men dette betyr ikke gi en liste over proteiner som er knyttet til en bestemt mRNA. Svært få metoder er tilgjengelige for å utføre en slik identifikasjon. Paret Fremgangsmåten innebærer at transfeksjon av nukleinsyre med komplementære til mål-mRNA 16,17. Nukleinsyre er også knyttet til et peptid, som gjør det mulig kryssbinding til RBPs i umiddelbar nærhet til samspillet nettstedet. Etter tverrbinding, kan den RBP-peptid-nukleinsyre isoleres og underkastes proteomikk analyse. Nylig, en aptamer basert metodikk varvellykket anvendt utdrag fra pattedyrcellelinjer 18. En RNA aptamer med forbedret affinitet for streptavidin ble utviklet og sammensmeltet til en sekvens av interesse (AU-rik element (er), i dette tilfellet). Den aptamer-ARE RNA ble festet til streptavidin perler og blandet med cellelysat. Proteiner som er forbundet med ARE-sekvensen ble renset og identifisert ved massespektroskopi (MS). Selv om denne metoden har oppdaget forbindelser som oppstår utenfor de cellulære innstillinger (dvs. in vitro), er det sannsynlig å være endret i fremtiden, for derved å innføre aptamerer inn i genomet og derved muliggjøre isolering av proteiner forbundet med mRNA, mens i cellulært miljø (dvs. in vivo). I gjær, hvor genetiske manipulasjoner er godt etablert, den raske metoden (utviklet i Prof. Jeff Gerst lab) gir en visning av in vivo foreninger 19. RAPID kombinerer spesifikke og sterke binding av MS2-kappeprotein (MS2-CP) for å MS2 RNA-sekvens, og av den streptavidin-bindende domene (SBP) for å streptavidin konjugerte perler. Dette muliggjør effektiv rensing av MS2-merket mRNA gjennom streptavidin perler. Videre tillater ekspresjon av 12 kopier av MS2 sløyfer opptil seks MS2-KP til å binde samtidig til RNA og øke effektiviteten av isolasjonen. Denne protokollen ble derfor foreslått for å muliggjøre identifisering av nye mRNA-assosierte proteiner når de eluerte prøvene underkastes proteomforskning analyse ved massespektrometri.
Vi har nylig benyttet hurtig for å identifisere nye proteinene forbundet med gjær PMP1 mRNA-20. PMP1 mRNA ble tidligere vist å være assosiert med ER membranen og dens 3'-utranslatert region (UTR) ble funnet å være en viktig bestemmende faktor i denne krets 21. Således RBPs som binder PMP1 3 'UTR vil kunne spille en viktig rolle i dets lokalisering. Hurtig etterfulgt av væskekromatografy-massespektrometri / massespektrometri (LC-MS / MS) resulterte i identifisering av mange nye proteiner som interagerer med PMP1 20. Heri gir vi en detaljert protokoll av den raske metodikk, viktige kontroller som må gjøres, og tekniske tips som kan forbedre utbyttet og spesifisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Sett en sekvens bestående av 12 MS2-bindingsseter (MS2 løkker; MS2L) inn i den ønskede genomiske lokuset, vanligvis mellom den åpne leserammen (ORF), og den 3 'UTR. En detaljert protokoll for denne integreringen er gitt andre steder 22. Kontroller riktig innsetting og uttrykk med PCR, Nord-analyse eller RT-PCR 20,23. Det er viktig å kontrollere at integreringen ikke gripe inn med syntesen av 3'UTR. I tillegg bør et plasmid som uttrykker-MS2-CP fusjonert til SBP under ekspresjonen av en induserbar promoter (metionin depletion) også bli innført i cellene 24. En identisk belastning, med unntak av de innførte løkker MS12, bør brukes som en kontroll for påvisning av ikke-spesifikke signaler.
1. Rapid Rensing
- Vokser 500 ml gjærceller (bruke 250-1000 ml gjærceller avhengig av ekspresjonsnivået av genet av interesse) som uttrykker MS2-merket mRNA 20 ogMS2-CP-GFP-SBP-fusjonsproteinet 24 til OD 600 0,8 til 1,0 ved 30 ° C i passende vekstmedium (for eksempel syntetisk Dextrose (SD) selektivt medium).
- Sentrifuger cellene ved 3000 xg i 4 min ved RT og kast supernatanten.
- Vask celler i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), sentrifuge som før (trinn 1,2), resuspendert i et like stort volum (trinn 1.1) av SD uten metionin, og inkuberes i 45 - 60 minutter ved 30 ° C for å indusere ekspresjon av MS2 -cp-GFP-SBP fusjonsprotein.
Merk: Lengre induksjons tid kan føre til aggregering av GFP. - Sett til side 10 ml celler og trekke RNA fra denne prøven ved hjelp av enkle "hot fenol" metoden 25. Forsiktig: Fenol er svært giftig og bør håndteres i henhold til sine sikkerhetsinformasjon.
Merk: Dette RNA er en god referanse for kvaliteten på isolert RNA (figur 1A). - For 500 ml celler, tilsett 1,35 ml 37% formaldehyd til en endelig concentration på 0,1% for å tverrbinde RNA-proteinkomplekser. Fortsett inkubering ved 30 ° C i 10 min. Forsiktig: Formaldehyd er svært giftig og bør håndteres i henhold til sine sikkerhetsinformasjon.
- Legg 26,5 ml av 2,5 M glycin til en endelig konsentrasjon på 0,125 M og inkuber i 3 minutter for å stanse kryssbinding. Fra dette trinnet på, legge alt på is for å minimere RNA degradering.
- Sentrifuger cellene ved 3000 xg i 4 min ved 4 ° C og vaskes med 45 ml kald 1 x PBS.
- Resuspender celler i 1 ml hurtig Lysis-buffer per 100 ml initial cellekultur.
- Del inn prøver av 500 mL i skrukork mikrofugerør og legge til ~ 400 mg av kjølte glassperler til hver delmengde (omtrent en full 0,2 ml PCR rør).
- Lyse celler i en vulst beater i 3 min. Umiddelbart sette lysat på is.
Merk: cellelyse utgivelser cellulære RNases, som er den viktigste årsaken til RNA degradering. RAPID Lysis-buffer inneholder en høy konsentrasjon av RNase inhibitors, slik som ikke-spesifikk RNase inhibitor heparin og spesifikke inhibitorer. Arbeid raskt og holde alt kaldt er også anbefalt. - Overfør lysatet til nye rør. Pierce et lite hull i bunnen av hver mikrosentrifugerør med en varm nål (0,8 mm x 40 mm) og plassere mikrofugerør på toppen av 15 ml rør. Bruk hodet til en 5 ml sprøyte som en adapter mellom mikrofugerør og 15 ml rør. Sentrifuger rørene forsamlingen på 3000 xg i 1 min ved 4 o C.
- Overfør gjennomstrømnings fra 15 ml rør i et nytt 1,5 ml rør og sentrifuger ved 10 000 xg i 10 min ved 4 ° C for å fjerne cellerester.
- Pool supernatanter fra alle 1,5 ml rør i et enkelt 15 ml tube, og satt til side 1/50 og 1/100 volum av løsningen til RNA og protein isolasjon, henholdsvis.
Merk: Disse vil fungere som "input" prøver for senere analyse (figur 1). - Tilsett 300 mikrogram av avidin per 500 ml initial gjærkultur og inkuber i 30 minutter (dette kan reduseres til 10 min) ved 4 ° C under konstant valse (10 rpm).
Merk: Avidin blokker biotin og biotinylerte proteiner fra binding til streptavidin perlene. - Forvask streptavidin perlene før inkubering med cellelysatet.
- Overfør 300 ul av streptavidin perler oppslemmingen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og fjerne den øvre supernatanten. Dette vil resultere i 250 mL av perler. Vask perlene to ganger med 1 ml av rask lysis buffer. Sentrifuger kulene streptavidin ved 660 xg i 2 minutter ved 4 ° C mellom hvert trinn.
- Sperre kulene ved inkubering i 1 time med 0,5 ml av hurtig lyseringsbuffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA og 10 ul av 10 mg / ml gjær tRNA. Perler kan stå O / N i blokkeringsløsning ved 4 ° C med rotasjon om nødvendig.
- Vask to ganger med 1 ml av rask Lysis buffer.
Merk: Magnetiske perler kan også brukes til å redusere tid og background. Disse, men har lavere kapasitet enn sepharosekuler.
- Tilsett 250 ul av de forvasket streptavidin perler til avidin-inneholdende lysat (fra trinn 1.14) og inkuberes i 1 time ved 4 ° C med konstant rotasjon (10 rpm).
Merk: Denne inkubasjonstiden er et kompromiss mellom å gi tilstrekkelig binding tid og minimere sjansene for RNA-degradering. - Sentrifuger ved 660 xg i 2 min ved 4 ° C for å fjerne streptavidin perlene og Overfør supernatanten til et nytt 15 ml tube. Sett til side 1/50 og 1/100 volum av løsningen for RNA og protein isolasjon, henholdsvis.
Merk: Dette vil være de «Unbound" samples. - Vask kulene med 1 ml av hurtig Lysis-buffer, riste forsiktig, overføring til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger som i trinn 1,17. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Vask perlene med 1 ml Rapid vaskebuffer, og denne gangen rotate (10 rpm) i 5 min ved 4 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger. Vask kulene med 1 ml av 1 x PBS og sentrifuger som ovenfor.
- Vask kulene igjen med 120 ul av 1 x PBS. Sentrifuger som ovenfor, og ta hele supernatanten for RNA og protein utvinning som "Wash" prøven.
Merk: Denne siste vaskeprøve vil indikere nivåene av vasker og bør være av samme volum som den Eluering prøven. Dette vil forenkle behandlingen og lasting i senere analyser. - For å eluere RNA og RNA-assosierte proteiner fra kolonnen, tilsett 120 ul av 6 mM biotin i 1 x PBS og inkuberes i 45 min ved 4 ° C med konstant rotasjon (10 rpm).
- Sentrifuger kulene som ovenfor, og overføre det eluerte materiale i et nytt 1,5 ml rør. Spinn eluerte prøven igjen, og overføre den øvre fase i et nytt 1,5 ml rør for å sikre at ingen overføring av perler.
- Ta prøver for RNA eller protein utvinning.
Merk: Volum tatt skal avhenge av den følgende analyse og ekspresjonsnivå av RNA eller protein av interesse. Som en retningslinje for northern analyse 26, kan 80% av prøven, for Western blot 23,27 eller RT-PCR 28, kan 20%, og for massespektrometri 29 for å oppdage nye proteiner, ta hele prøven.
2. RNA Utvinning
- Legge til et likt volum av 2x Tverrbinding Tilbakeføring buffer og inkuberes i 45 min ved 65 ° C. Fortsett rett for RNA ekstraksjon.
Merk: Kryssbinding Tilbakeføring Buffer inneholder ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), som forbedrer RNA ekstraksjon 20. - Bruk standard fenol: kloroform metode 26 for å trekke RNA fra "input" og "ubundet" samples (trinn 1.13 og 1.17).
Merk: Disse prøvene inneholder en stor mengde av RNase inhibitor heparin, som kan hemme påfølgende Reverse Transcriptase- (RT) benytter analyser (f.eks RT-PCR), derfor LiCl nedbør 30 er bedt om å fjerne det. Den "wash "og" elusjonstester "samples (trinn 1.21 og 1.24) inneholder lave mengder av RNA og felles ut gjennom følgende trinn. - Legge til et likt volum av 8M Guanidinium-HCl (GuHCI) og to volumer av 100% etanol til "vaske" og "eluering" prøver. Inkuber ved -80 ° C i minst 2 timer.
Merk: Guanidinium vil effektivt denaturere proteiner og dermed hemme RNases og proteaser i prøven. - Sentrifuger ved 20.000 xg, 4 ° C i 30 minutter og supernatanten kastes. Vask pelleten med kald 80% etanol og sentrifuger på nytt ved 20 000 xg, 4 ° C i 15 min.
- Løs opp RNA pellet i 400 mL av RNase fritt vann og bunnfall igjen for å fjerne eventuelle tiloversblevne GuHCI eller andre forurensninger. Legg 40 ul 3 M natriumacetat, pH 5,2 og 800 pl 100% etanol, inkuberes ved -20 ° C i minst 1 time.
- Sentrifuger og vask som i trinn 2,4 og fjerne all etanol med en 10 mL tips. Resuspender RNA pellet i 10 mL RNase fritt vann. Vær ekstra forsiktig som RNA pellet er vanligvis ikke synlig.
Merk: Prøver kan bli brukt for Northern analyse, som beskrevet i 23 (figur 1).
3. Protein Forberedelse til Western Blot eller massespektrometri Analyse
- Legge til 1/3 volum på 4 x Laemmli-prøvebuffer (LSB) til proteinprøver og inkuberes 45 minutter ved 65 ° C for å reversere tverrbindingen av RNA og proteiner.
Merk: Prøver kan oppbevares ved -20 ° C. - Kjører proteiner på en SDS-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Juster prosentandelen av gelen i henhold til størrelsen av proteinene som skal analyseres.
Merk: 10% akrylamid gel gir et bredt spekter av separasjon og er god som en første tilnærming. - Overfør proteiner til membranen som i standard immunoblotanalyse 27 for kontroll av isolasjon effektivitet (figur 1C). Flekk med enten Coomassie Blue R250 eller sølvfarge før massespektrometrianalyse.
Merk: Silver stain er det foretrukne valg, fordi den er mer følsom og gir bedre deteksjon (figur 1B). Farging kan gjøres med enten manuelt utarbeidet løsninger eller kommersielle kits. Inkubasjonstiden til gelen i den endelige fargeoppløsning bør bestemmes eksperimentelt. Long inkubasjon kan avsløre lave rikelig proteiner, men kan forårsake svært uttrykte proteiner som MS2-CP-SBP-GFP å være over farget og kan maskere rundt proteiner i sin nærhet. I tillegg kan en høy bakgrunn forekomme. Følg reaksjonen nøye, og legge stoppløsningen på riktig tidspunkt. - Skjær ut band fra gelen og overføre dem til 1,5 ml rør. Oppbevar prøver ved -20 ° C, eller sende for proteinekstraksjon og trypsin fordøyelse etterfulgt av LC-MS / MS-analyse 32.
- Som et alternativ proteomikk tilnærming for å utelukke gelen separasjonstrinnet, fordøye eluert materiale fra trinn 1,24 i såning ved hjelp av trypsin og under LC-MS / MS-analyse 33.
Merk: Hvis du utelater SDS-PAGE separasjon forenkler protokollen og øker utbyttet. Imidlertid prøvene kan inneholde spor av vaskemiddel NP-40, som hemmer massespektrometrianalyse. For å løse dette problemet ved å utføre følgende trinn:- Kjør protein på SDS-PAGE 31 for 10 - 15 min.
- Kutt ut hele delen av kjørefelt (dvs. hvor proteinene er plassert).
Merk: proteinprøven kan inneholde en betydelig mengde av MS2-CP-SBP protein som kan tilsløre signaler om lav overflod proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAPID muliggjør isolering av en spesifikk mål-RNA med assosierte proteiner. Kritisk for dens suksess er å holde den RNA intakte så mye som mulig, for derved å oppnå en tilstrekkelig mengde av proteiner. For å bestemme isolasjon effektiviteten og kvaliteten av RNA, er northern analyse utført (figur 1A). Nord-analyse har fordelen av direkte rapportering effektiviteten og kvaliteten av raske. Således kan de relative mengder av full lengde og nedbrytningsproduktene bestemmes i en enkelt kjøring. Ribosomale RNA (rRNAs) registreres lett i etidiumbromidfarging, og mangelen på rRNAs i elueringen prøven indikerer stringensen av rensing. Stringensen og spesifisiteten av rensingen blir videre demonstrert ved mangelen på et signal fra et ukodet mRNA i elueringsprofiler prøver (ACT1 nedre panel). Den tilsynelatende signal i FPR1 kjørefelt, som ikke er av størrelsen på ACT1, er en rest fra prerige hybridisering med proben MS2L. Den northern analyse viser også at inngangs RNA er noe mer nedbrutt sammenlignet med RNA som ble renset ved hjelp av den varme fenol-protokollen (c / o ACT1 sonde panelet). Dette skyldes den lange og mer komplisert RAPID-protokollen. Ikke desto mindre en betydelig mengde av full-lengde, merket RNA isoleres spesielt, slik det er åpenbart av det sterke signalet i elueringen fraksjon (MS2L probe).
Proteinprøver kan kjøres på SDS-PAGE og farget med sølvfarge før proteomforskning analyse (figur 1B). En prøve isolert fra kontroll, umerkede celler (-MS2L) er nyttig i skille ikke-spesifikke assosiasjoner fra RNA-avhengige seg. Derfor er det bare bånd som er sterkere i den kodede prøve (+ MS2L) kuttet ut av gelen og tatt for LC-MS / MS. Western analyse med generelle RBPs anbefales også å indikere effektiviteten av protein co-rensing (Figur1C). Heri anvendes vi Yef3, som er kjent for å interagere med PMP1 20, eller GFP, som angir den totale effektiviteten og spesifisiteten av isolasjon. Interessant, effektiviteten av Yef3 isolasjon ser ut til å variere mellom PMP1 og FPR1, og er mye lavere i forhold til GFP.
Figur 1. Spesifikk Isolering av MS2L-merket RNA og identifikasjon av Associated Proteiner. Resultater fra to ulike RNA som ble utsatt for rask (PMP1 og FPR1) er presentert. (A) Northern blot analyse av RNA prøver renset fra en rask eksperiment. RNA ble kjørt på en agarosegel og farget med etidiumbromid (øvre panel). Gelen ble blottet på nylonmembran og underkastet hybridisering med de indikerte sonder (nedre paneler). De analyserte prøvene er: rask cellelyse (varme fenol [trinn 1,4]), RaPID cellelyse (input [trinn 1.13]) og etter eluering med biotin (eluering [skritt 1,24]). (B) Silver flekk av proteiner fra Rapid med MS2-merkede og umerkede celler. Proteinprøver fra elusjonstester fraksjoner av MS2-taggede PMP1 (+ MS2L) eller ukodet (-MS2L) kontroll ble kjørt i SDS-PAGE og sølvfarget. Bånd med differensial intensitet (indikert med stjerner) ble kuttet ut av gelen og bestemt ved massespektrometri-analyse. Pilen indikerer MS2-CP-GFP-SBP-fusjonsprotein, noe som viser tilsvarende protein lasting. Irrelevante baner ble klippet ut for klarhet. (C) Western analyse av positive kontroller. Western blot med antistoffer som gjenkjenner den Yef3 eller GFP-delen av MS2-CP-fusjonsprotein ble utført. Irrelevante baner ble klippet ut for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskjellige fremgangsmåter bruker isolasjon av spesifikke mRNA for å identifisere de tilknyttede proteiner 11,34 35. Disse fremgangsmåter gjelder in vitro og in vivo strategier for å probe RNA-protein interaksjoner. In vitro metoder Inkuber eksogent transkribert RNA med cellelysat å fange RBPs og isolere RNP komplekser 36,37. En effektiv tilnærming av denne typen ble presentert nylig, noe som muliggjorde identifisering av nye proteiner som binder en regulerende RNA motiv 18. En ulempe med disse metodene er bindingen av uspesifikke RBPs fordi foreningen oppstår utenfor cellemiljøet. In vivo metoder, der proteinene er kryssbundet mens i sine naturlige omgivelser, kan gi en bedre oversikt over RNA-protein forening. Videre gir kryssbinding høyere stringens under isolasjon og derfor høyere spesifisitet. Paret tilnærmingen 17 utnytter transfeksjon av antisenssekvensen til target RNA for å rette en peptid-del til nærheten av RBPs. Peptid-RBPs kan da være tverrbundet og isolert ved perler som er knyttet til en sekvens som er komplementær til antisens-sekvens. Paret metodikk er meget fordelaktig på grunn av sin enkle anvendelse til mange celletyper, uten behov for kompliserte genomiske manipulasjoner. Det er, imidlertid, avhengig av effektiviteten av transfeksjon, og tilfeller hvor en lav prosentandel av celler som godtar antisens vil ha lav effekt. Dessuten er isolering av RBP-peptid-antisense-sekvens fås gjennom magnetiske streptavidin perler som er kombinert med biotinylert oligonukleotid komplementært til den antisense nukleinsyre. Mangfoldet av interaksjoner (magnetiske kuler, streptavidin-biotin og baseparring) kan begrense stringens og effektiviteten av isolasjonen. Den raske fremgangsmåte 24 som er beskrevet her gir et alternativ til disse begrensningene i flere aspekter. Først than integrering av MS2 sløyfene til den genomiske loci sikrer at alle celler uttrykker det, og dermed øke dens utbytte. For det andre bruker den høyaffinitets interaksjonen av MS2-CP-GFP-SBP til tolv MS2 sløyfe sekvenser og tillater dem å binde in vivo. For det tredje, fiksering av RNA-proteininteraksjon muliggjør strengere vaskinger og reduserer identifikasjon av ikke-spesifikt bundne proteiner. Til slutt, SBP domene bindes streptavidin perler med høy affinitet og er lett elueres med fritt biotin.
Innsetting av MS2 sløyfe inn i RNA er tilrådelig mellom ORF og 3'-UTR å minimalisere oversettelse perturbasjon, og for å sikre ekspresjon av alle sløyfer. Seks til 24 MS2 sløyfe gjentas ble tidligere brukt for visualisering av mRNA lokalisering 38-40. Imidlertid innsetting av en lang sekvens av MS2 sløyfer kan føre til endringer i behandlingen og strukturen av RNA; det kan destabilisere karakterutskriften eller endre repertoar av RBPs bundettil det. I vår erfaring, 12 sløyfer er tilstrekkelig for å få en effektiv eluering av MS2-merket RNA 20. I denne sammenheng ser vi at vi vanligvis observert flere kortere transkripsjoner i våre nordlige hybridizations. Northern analyser med forskjellige prober avslørte at disse kortere former inkludert MS2L og en del av det 3'-UTR 20, indikativ for for tidlig transkripsjonsterminering. Slike tilfeller kan redusere effektiviteten av isolering av proteiner forbundet med den 3 'UTR. Derfor bør antallet innsatte sløyfer og deres plassering innenfor RNA balanseres mellom høy effektivitet pull-down og transkripsjon stabilitet.
RNA har til å forbli intakt gjennom hele protokoll for å muliggjøre effektiv isolering og detektering av den maksimale matrise av bundne proteiner. Sjansene for ekstern RNase forurensning kan reduseres ved å bruke hansker, noe som sikrer et rent arbeidsområde, forbereder løsning med RNase-fritt vann, og arbeider konsistog effektivt for å redusere protokoll tid. Likevel fant vi at den største bidragsyteren til RNA degradering er utgivelsen av cellulære RNases til lysatet på cellelyse. Det ble foreslått at kryogen sliping av gjærceller med en mekanisk mill resulterer i forbedret RNA rensing 41. Dette kan bli prøvd i tilfeller hvor betydelig degradering er observert med denne protokollen.
En felles ulempe ved pull-down-analyser er isolering av en rekke proteiner som binder ikke-spesifikt til kolonnen. Derfor er bruken av en gjærstamme med umerket RNA en viktig kontroll. Denne stamme uttrykker MS2-CP-GFP-SBP-fusjonsprotein for å utelukke ytterligere proteiner som binder til fusjonsprotein, og ikke den target RNA. Vi merker oss at dette ikke utelukker proteiner som kan binde MS2 sløyfe selv, og disse trenger ytterligere validering med protein pull-down analysen. Figur 1B viser at vi var i stand til å identifisere flere proteiner som binderspesielt for å PMP1 mRNA, og noen ble senere bekreftet av en co-IP-analysen 20.
Den raske metoden er foreløpig begrenset til gjær systemer, utnytte sine veletablerte stedsspesifikke integrasjonsmetoder. Stedsspesifikke integrasjonsprotokoller er under utvikling for gener i andre systemer som bruker CRISPR-Cas system 42,43. Disse vil være av stor betydning i å utvide utnyttelsen av raske til flere systemer. En annen fremtidig bruk av Rapid er for isolering av RNA som er forbundet med en mRNA av interesse. Dette kan enkelt oppnås ved å utsette den isolerte materiale til RNA-seq snarere enn LC-MS / MS. Tatt i betraktning de viktige rollene små RNA i regulering mRNA uttrykk, er dette programmet vil trolig være av stor betydning. Til slutt, forbedringer i massespektroskopi (MS) -analyse og bruken av kvantitative MS metoder som SILAC vil resultere i den kvantitative måling av mRNA-bundet Proteinkonns under forskjellige forhold. Hurtig kan brukes sammen med gjær dyrkes i media anriket med tunge isotoper og sammenlignet med celler dyrket under forskjellige betingelser (f.eks spennings) med umerkede media 44,45. Påføring av rask metode sammen med kvantitativ MS-analyse vil gi nøyaktige målinger av endringer i RBP repertoar som er knyttet til en bestemt mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker professor Jeff Gerst og Boris Slobodin for deres nyttige råd i å sette opp den raske protokollen og gi de nødvendige plasmidene. Vi takker også Dr. Abigail Atir-Lande for hennes hjelp i å etablere denne protokollen og Dr. Tamar Ziv fra Smoler Proteomics Senter for hennes hjelp med LC-MS / MS-analyse. Vi takker professor TG Kinzy (Rutgers) for YEF3 antistoff. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet 2011013 fra binational Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R.
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
