Abstract
小さな非コードRNA（のsRNA）の多様性は急速に拡大し、生物学的プロセスにおける役割、遺伝子調節を含む、浮上しているされています。最も興味深いことに、sRNAsはまた、細胞の外で発見されており、安定的にすべての生物学的流体中に存在しています。このように、細胞外sRNAsは、疾患バイオマーカーの新規なクラスを表し、おそらく、細胞シグナル伝達および細胞間通信ネットワークに関与しています。バイオマーカーとしての可能性を評価するために、sRNAsは血漿、尿、および他の体液中で定量することができます。それにもかかわらず、完全に内分泌信号のような細胞外sRNAsの影響を理解するために、キャリアが輸送と細胞や組織は、細胞外のsRNAプールに貢献する生物学的流体（ 例えば、血漿）、でそれらを保護し、細胞や組織ができるされているかを決定することが重要です外のsRNAを受け入れ、利用します。これらの目標を達成するために、細胞外のキャリアの非常に純粋な集団を単離することが重要ですsRNAプロファイリングおよび定量化のため。我々は以前に、リポタンパク質、特に、高密度リポタンパク質（HDL）、細胞およびHDL-miRNAの間の機能的マイクロRNA（miRNAの）の輸送を大幅疾患において変化していることを実証しました。ここでは、詳細高の両方を使用して、miRNAを含むすべてのsRNAs、下流のプロファイリングおよび定量化のための高純度のHDLを得るために、密度勾配超遠心分離（DGUC）と高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）でタンデムHDL分離を利用した新しいプロトコルシーケンシングおよびリアルタイムPCRアプローチ-throughput。このプロトコルは、HDL上のsRNAsの調査のための貴重な情報源となります。
Introduction
細胞外の非コード小型RNA（sRNAs）疾患のバイオマーカーおよび潜在的な治療標的の新しいクラスを表し、おそらく細胞間コミュニケーション1を容易にします 。 sRNAの最も広く研究されているタイプは、長さが約22 NTSであり、長い前駆体型および一次転写産物2から処理されるマイクロRNA（miRNAを）です。 miRNAは、転写後ためにタンパク質翻訳及びmRNA分解2の誘導の抑制を介して遺伝子発現を調節することが実証されています。それにもかかわらず、miRNAはsRNAsの多くの種類のひとつです。 sRNAsは、親のtRNA（tRNAの由来sRNAs、TDR）、小核のRNA（のsRNA由来sRNAs、sndRNA）、小核小体のRNA（のsnoRNA由来sRNAs、snRNAの）、リボソームRNA（rRNAの由来sRNAs、RDRから切断することができるように）、YのRNA（YDR）、およびその他のRNA 1。これらの新規sRNAsのいくつかの例は、miRNAと同様に機能することが報告されています。しかし、生物学的府遺伝子調節における役割は3-6可能性があるが、これらのsRNAsの多くのnctionsは、まだ決定されていません。最も興味深いことに、miRNAおよび他のsRNAsは、唾液、血漿、尿、及び胆汁を含む細胞外液、中に安定に存在しています。外sRNAsは、おそらく、細胞外小胞（EV）、リポタンパク質、および/または細胞外リボ核タンパク質複合体との会合を通じてのRNaseから保護されています。
以前、我々は、リポタンパク質、即ち、高密度リポタンパク質（HDL）、血漿7における搬送miRNAを報告しました。この研究では、HDLは、連続密度勾配超遠心法（DGUC）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル濾過、FPLC）、およびアフィニティークロマトグラフィー（抗アポリポタンパク質AI（アポA-I）免疫沈降を用いて単離しました）7。リアルタイムPCRベースの低密度アレイと個々のmiRNAアッセイの両方を使用して、miRNAレベルは、HDLで定量治癒から単離されましたなたと高コレステロール血症の被験者7。このアプローチを用いて、miRNAをプロファイルし、高純度のHDL製剤における特定のmiRNAを定量することができました。 2011年以来、私たちは、アフィニティークロマトグラフィーは、HDLの純度を高めているが、抗体の飽和が大幅に収量を制限し、コスト高であることができると判断しました。現在、我々のプロトコルは、ダウンストリームRNA単離とのsRNAの定量化のために高品質のHDLサンプルを生成FPLC、続いDGUCの二段階の順次タンデム方式をお勧めします。近年の例えば sRNAsのハイスループットシークエンシング（sRNAseq）、の進歩、miRNAは、および他の非のmiRNAのsRNAクラスの意識向上に、sRNAseqは、現在の最先端のmiRNAおよびのsRNAプロファイリングです。このように、我々のプロトコルは、定量化miRNAおよびsRNAseqを使用して、HDLサンプル上の他のsRNAsをお勧めします。それにもかかわらず、HDLから単離した全RNAは、個々のmiRNAと他のsRNAsを定量またはリアルタイムPCR aを用いsRNAseq結果を検証するために使用することができますpproaches。ここでは、具体的に収集、精製、定量化、データ分析、および高純度のHDL-sRNAsの検証のためのプロトコルについて説明します。
この論文の全体的な目標は、ヒト血漿から分離された高純度のHDLでのsRNA定量化の実現可能性とプロセスを実証することです。
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Protocol
1. HDL精製（〜5.5日）
- 密度勾配超遠心分離（DGUC、〜5日）
- 新鮮な静脈血から分離された血漿の9 mLに100倍の抗酸化剤の90μLを追加します。
- ステップ1.1.1（0.0278グラム/ mLの臭化カリウム血漿）からの血漿の9 mLに0.251グラムのKBrを追加することによって、1.025グラム/ mLに1.006グラム/ mLのKBrを持つプラズマ密度を調整します。すべての塩は室温で溶解し、チューブを超遠心し、すべての気泡がトップに上昇を確認するために転送されるまで、プラズマをロック。
- ベンド先端から90℃で1センチメートル18-G針の先端は、ベベル側が上を向きます。シリンジと18ゲージの針を使用して、慎重にプラズマ（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃1の3ミリリットルを配置します。
注：曲がった針は、すべてのVLDL / IDL、LDLを確保し、HDLがオーバーレイと混合せずに削除されます。 - チューブの上部とcarefuにメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2を残して、上部の気泡の大部分を削除しますLLY SW-40Tiバケットにチューブを配置します。
- バランスに（キャップ付き）各バケットを計量し、正反対のバケット（バケット+キャップ）とのバランス：第6位に＃1〜＃4、＃5から＃2、＃3。
注：これらのバケットは、常にバランスと一致する必要があります。 - （材料のリスト）超遠心機ロータを配置します。 ＃4の中間ブレーキと4℃で24時間274400×gで遠心分離します。
- 慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。
- 慎重に注射器と曲がった針を使用してオーバーレイの最上層から2ミリリットルを削除します。これは、4℃で保存することができるVLDL / IDL画分となり °Cまたは-80 °C。
- VLDL / IDL画分を除去した後、サンプル（血漿）の残りの7ミリリットルを収集し、15 mLコニカルチューブに入れてください。オーバーレイ溶液＃2（ 表1）で9 mLに試料の体積を起動します。
- 使用してのKBrと1.080グラム/ mLに1.025グラム/ mLのサンプル密度を調整します9 mLのサンプルまたは0.0828グラムで約0.746グラムのKBr /サンプルのmLでのKBr。すべてのKBr（約20分）に溶解し、確実に気泡がトップに上昇しながら、チューブを超遠心に転送されるまで、慎重にサンプルを揺すります。
- 注射器と針で、慎重にサンプル（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃3の3ミリリットルを配置します。管の上部にメニスカスから3ミリメートルのスペース - 2のままにしておきます。
- チューブの上部に残っている気泡の大部分を除去し、慎重にSW-40Tiバケット内に充填された超遠心管を配置します。
- バランスに（キャップ付き）各バケットを計量し、正確1.1.5のように、反対側のバケット+キャップでバランスをとります。
- （材料のリストを参照してください）超遠心機ロータを配置します。 ＃4の中間ブレーキと4℃で24時間274400×gで遠心分離します。
- 慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。
- 慎重に注射器を使用してオーバーレイの最上層から2ミリリットルを削除してあることntの針。これは、4℃で保存することができるLDL画分となり °Cまたは-80 °C。
- LDL画分を除去した後、サンプル（血漿）の残りのおおよその7ミリリットルを収集し、新しい15 mLコニカルチューブに入れてください。 1.080グラム/ mLの溶液＃4（ 表1）で9 mlまでの試料（血漿）の音量を持参。
- 1.30グラムのサンプルの各mLのための3.33 9 mLのサンプル（血漿）中のグラムとKBrまたは0.37グラムのKBrを使用してのKBrと/ mLに1.080グラム/ mLのサンプル密度を調整します。ロックまたはわずかにすべてのKBr（塩）が溶解するまでサンプルを攪拌し、管を超遠心する転送します。
- 注射器と針で、慎重にサンプル（ 表1）の上にオーバーレイ溶液＃5の3ミリリットルを配置します。
- 管の上部にメニスカスから2〜3ミリのスペースを残して、管の上部に残っている気泡の大部分を除去し、慎重にSW-40Tiバケット内に充填された超遠心管を配置します。
- （各バケットを計量バランス上のキャップ）、そして正確に1.1.5のように、反対側のバケット+キャップでバランスをとります。
- （材料のリストを参照してください）超遠心機ロータを配置します。 ＃4ブレーキと4℃で48時間274400×gで遠心分離します。
- 慎重にバケットから、ロータからバケットやチューブを取り外します。
- 慎重に注射器と曲がった針を使用してオーバーレイの最上層から約2ミリリットルを削除します。これは、4℃または-80℃で保存することができるHDL画分です。
注：DGUC HDL後は、高塩溶液を除去するために透析することができます。 - 密閉された透析スリーブ（10,000 MWカットオフ）に集めHDL画分を配置し、1 L 1×PBS中で一晩透析、透析します。変更透析緩衝液（1×PBS）24時間かけて3回。磁気撹拌棒を含むPBSの穏やかな摂動は、透析が向上します。
- BCA法8を使用してDGUC-HDLのタンパク質濃度を決定します。
- 高速タンパク質液体CHROグラフィー（FPLC）またはサイズ排除クロマトグラフィー（〜6時間）
- 0.22μmのマイクロ遠心フィルターを通して500μLでDGUC-HDL（総タンパク質）の1.2 mgのフィルタ注入する直前に、（材料のリストを参照してください）。
注：0.22μmのフィルターの前に0.45μmのマイクロ遠心フィルターを通してDGUC-HDLサンプルの追加のフィルタリングは、いくつかのサンプルのために必要な場合があります。 - フィルタリングDGUC-HDLサンプルを収集し、FPLC（記入）注射器、およびFPLCに注入する前に、シリンジ内に気泡がないことを確認をロードします。
- 2.6 MPaの圧力限界で0.3 ml /分のFPLC流量を設定します。注射をサンプリングする前に、緩衝液の0.2カラム容量（約15mL）でカラムを平衡化します。 FPLC（注入ループ）機器内にバッファの3 mLのサンプルを注入し、実行を開始します。 72画分の合計1.5 mL画分を収集します。
- 0.22μmのマイクロ遠心フィルターを通して500μLでDGUC-HDL（総タンパク質）の1.2 mgのフィルタ注入する直前に、（材料のリストを参照してください）。
2.高スループット小さなRNAシーケンシング（sRNAseq、〜9日）
- RNA単離（〜1日）
- 製造業者の説明書に従って比色分析キットを用いて総コレステロールレベルを測定することによりDGUC-HDLに相当するFPLC画分を同定します。 DGUC-HDLを含む7 FPLC画分 - このFPLCセットアップを使用して、6を見つけることを期待しています。
- DGUC-HDL FPLC画分からすべてのボリューム（約8 -1 0 mLのプール1.45 mLの画分の容積）を収集し、使用して集中10kDaのMWカットオフ遠心分離フィルターユニット1時間4000×gで4℃、またはHDL濃縮まで約100μLです。
- HDL濃縮物を収集し、BCA法8を用いて、HDL、総タンパク質濃度を定量します。
- セット内の各サンプルから小分けしすることができ、最大1 mgのHDL総タンパク質の最高濃度を、決定します。例えば、各試料のHDL、総タンパク質の同量のRNAを単離します。
- 使用して、RNAの単離を行います改良プロトコール （材料のリストを参照してください）。
- 1分間のサンプルと渦（材料のリストを参照してください）フェノール溶解試薬の10倍のボリュームを追加します。
- 5分間、室温でインキュベートします。
- クロロホルム（ステップ2.1.5.1で使用されるフェノール溶解試薬の体積の20％）を加え、15秒間激しく振ります。
- 3分 - 2室温でインキュベートします。
- 冷却遠心機で4℃、12,000×gで15分間遠心。
- 間期を避け、新たなチューブに上部の水相を転送します。
- 1分間水相とボルテックスに100％エタノールの1.5倍体積を加えます。
- 少なくとも1時間または一晩-80℃で保存サンプル。
- 提供ミニカラムを用いてRNA単離プロトコールを続行します。
- 30μLのRNaseフリーのH 2 Oで溶出まず、フリットに直接2分間低速（2,000×gで）でスピンをH 2 Oの15μLを追加し、その後、1分間高速（最大）で回転します。 H 2 Oの追加の15μLと、この手順を繰り返します
- 直ちに-80℃でのsRNAライブラリ生成またはストアに進みます。
- ライブラリーの生成（〜6時間）
- 以下に詳述するように、PCR増幅に1修正を加えて、製造業者の指示に従って、のsRNAライブラリー生成キットのプロトコルを使用してのsRNA cDNAライブラリーを準備します。
- 0.5μLのDNase / RNaseフリーのH 2 Oを含む氷上でPCRマスターミックスを準備し、15μLのPCRミックス（PML）と1μLRNA PCRプライマー（RP1）サンプル毎（エラーをピペッティングするための追加の10％を含みます）。
- 各（cDNA）をサンプルにPCRミックスの16.5μLを追加します。
- 多重化のために各サンプルにインデックス/バーコード番号を割り当て、サンプルに（対応する数）1μLのPCRプライマーのインデックスを追加します。
- マイクロフュージを使用してクイックスピンを実行します。
注：合計ボリュームがすべき今サンプル当たり30μLです。 - 表2および3に詳述するようにPCR増幅のためのサイクル条件を行います。
- 以下に詳述するように、PCR増幅に1修正を加えて、製造業者の指示に従って、のsRNAライブラリー生成キットのプロトコルを使用してのsRNA cDNAライブラリーを準備します。
- サイズアダプタを削除するためのsRNAライブラリを選択します。アダプタ（〜1.5時間）
- ターゲット：156 bpの、スタート：135 bpの、エンド：177 bpの、範囲旗：ブロード以下のサイズのパラメータを持つあたり、製造元の指示として自動DNAサイズセレクタを使用してライブラリのサイズ選択を行います。
- DNAクリーンアップ（〜0.5時間）
- 製造元の指示に従って、サイズ選択のsRNAのcDNAをクリーンアップします。
- クリーン溶出し、2×7μLのDNase / RNaseフリーのH 2 OでのsRNAするcDNAを濃縮します
- sRNA cDNAライブラリーの収量と品質（〜1時間）を定量化し、評価します
- manufactあたりとしてバイオアナライザー（材料のリスト）上に高感度DNAチップを用いたsRNAのcDNAライブラリーの品質と大きさを評価しますurerの指示。
- 製造業者の指示に従って、高感度DNA分析（材料のリスト）を使用して、個々のsRNA cDNAライブラリーの濃度を定量します。
注：これは、可能な場合は、別のインデックスを持つすべてのサンプルがフローセルの同じレーン上で実行することが推奨されています。複数のレーンが必要な場合、適切ケースおよびコントロールサンプルを混ぜます。
- ハイスループットのsRNAシーケンシング（〜7日）
- プール個人が等モル濃度に基づいてのsRNAライブラリのインデックスを作成しました。
- 画面は、バイオアナライザー上で高感度DNAチップを用いて、品質のsRNAライブラリをプールし、2.5.1のようにライブラリーDNA濃度を決定 - 2.5.2。
- 製造業者の説明書（材料のリスト）に従ってシーケンシングライブラリーのqPCR定量キットを使用して適切な配列決定の深さを確保するために、アダプタコンテンツの定量的PCR（定量PCR）を行います。
- 単一の読み取りを使用してシークエンシングを行い、50 B25 Mは、製造業者の指示に従って、/サンプルを読み取り - Pプロトコルは、約20の深さに到達します。
3.データ解析（〜1日）
- 逆多重化されたサンプルの前処理生FASTQファイル（材料のリスト）に、ユーザーガイドの指示に従って、bcl2fastq2を使用してください。
- 使用Cutadaptアダプタ9をトリミングして削除するには、ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、長さ<16ヌクレオチド（NTS）を読み出します。
- ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、NGSPERLの枠組みの中でremoveSequenceInFastq機能を使用して、アダプタのキャリーオーバー（CTACAGTCCGACGATC）：ストップ・ソリューション・シーケンス（CCACGTTCCCGTGG STP）を含む、のsRNAライブラリに存在する汚染配列を除去。
- ユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、FastQCは定量的科学研究センター（CQS）ツールを使用して、品質管理メトリックを実行します。
- （読み取り、「同一」崩壊redundaの非冗長リストを生成読み込み）とユーザーガイドの指示（材料のリスト）に従って、CQSToolsを使ってレコードコピー数のnt。
- 、ユーザーガイド当たりの命令（材料のリスト）として：整列は1ミスマッチ（-a -m 100 --best --strata -v 1オプション）を可能にするBowtie1.1.2を用いて、ヒトのゲノムに読み込みます。
- アライメント、カウントを読んで実行し、ユーザーガイドの指示に従って、NGSPERLを使用して集計作業をもたらします。
- スプレッドシートファイルにエクスポートカウントテーブルを変換します。
- ノーマライズは、そのクラスの読み込み（ 例えば、miRNAの総数は読み込み）やパーがmiRNA（RPMM）にマッピング読み込みとして信号を報告総数に対する特定のクラス（ 例えば、miRNAの）の読み取り。 （ 例えば 、RPMM =（miRNAののmiR-X /総＃読み取り）* 1,000,000）。
- 低レベルと高レベルの差のためにソフトウェアに一般的な単一色の技術としてカウントテーブルを正規化した入力は、ユーザーガイドの指示（材料のリスト）ごとに分析しています。
注：現在、十分に特徴付けられたハウスキーピング遺伝子がある/ SRNHDL-のsRNAについて。スパイクインコントロールを使用することができるが、問題となり得ます。総タンパク質入力またはボリュームをHDLへ正規化すると、お勧めします。最も重要なことは、リアルタイムPCRまたは定量的PCRを用いたmiRNAとsRNAsを定量化するために様々な戦略の一つにより配列決定の結果を検証することをお勧めします。
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Representative Results
このプロトコルは、ハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCR（ 図1）により、高純度HDL上のsRNAsの定量化を可能にするために一緒にリンクされている確立された方法のシリーズです。このプロトコルの実現可能性と影響を実証するために、HDLは、タンデムDGUCおよびFPLCの方法によって、ヒト血漿から精製しました。 HDL（コレステロール分布による）に対応する収集FPLC画分を濃縮し、全RNAをHDL 1mgの（全タンパク質）から単離しました。 sRNAライブラリは、n = 4健康なヒト被験者から収集されたHDLで生成されました。全てのヒト血液/血漿サンプルは、アクティブな治験審査委員会プロトコル（＃070416）の下で収集した、医学のバンダービルト大学によって承認されたヒト被験者はインフォームドコンセントに登録しました。準備のsRNAライブラリは、高度なゲノム（VANTAGE）DNA配列決定センターとデータ分析を行ったためヴァンダービルト・テクノロジーズで配列決定しました社内のパイプラインを使用して。データの視覚化は、ソフトウェアをグラフによって作成されました。
DGUC後HDL分離のための第二の方法（FPLC）を実行するための重要な必要性は、電気自動車の可能性共精製によるものです。電気自動車は、膜由来の多胞体（エキソソーム）に由来小胞、形質膜出芽（微小胞）、およびアポトーシス体10を含む他のプロセスの一般的なクラスです。電気自動車、すなわちエキソソームは、小さなHDL（ 図2A）と同様の密度を有することが報告されており、従って、HDL濃度の画分に存在することができる- DGUC 11,12後（1.063 1.21グラム/ミリリットル）。 EVや他のリポタンパク質（ 例えば 、LDL）を削除するには、DGUC-HDLから、FPLCは、サイズによって他の小胞および粒子から独立したHDLに使用しました。 HDL（7 -直径12ナノメートル）やEV（40 -直径220ナノメートル）を容易に、それらのサイズの違い（ 図2A、B）に分画しています。 HDL画分S起因コレステロールの分布に容易に明らかであり、そしてDGUC-HDL FPLC画分をプールし、10 kDaカットオフ遠心フィルターを用いて濃縮しました。濃縮HDLを回収し、下流のRNA分析（ 図2B）のために使用しました。この点を説明するために、プラズマ前DGUCはFPLCおよびリン脂質の分布（ホスファチジルコリン、PC）を用いて分画しました。総コレステロール（TC）、およびタンパク質のレベルを定量し、画分にわたってプロットしました。 PC、TC、およびタンパク質のレベルは、3つの比色分析キットを用いて定量しました。およびVLDL / LDL画分（14から18） - 全ての3つのパラメータが明らかにHDL画分（24 19）を定義しました。 FPLC分画血漿では、タンパク質や脂質シグナルは最小限に検出されたか、されない（オレンジボックスの左側）VLDL（ 図3A）よりも大きなサイズの小胞に対応する画分では全く検出されました。 HDLのDGUC分離を実証するために、DGUC-HDLはまた、FPLCやPC、TCによって分画し、タンパク質レベルはquantifましたIED（ 図3B）。これらの値をプロットするDGUCを用いてLDLの少量の共分画を示し、高純度のHDLを単離するためにタンデムDGUC-FPLCアプローチを使用する必要性を強調しています。電気自動車がDGUC中にHDLと同時分別すると予測されていますが、LDL（ 図3B）よりも大きなサイズを小胞に対応する画分中の脂質とタンパク質で見つかったなしにはほとんどなかったです。 FPLC（データは示していない）により分画した場合に予測されたサイズ範囲のEV脂質およびタンパク質シグネチャーもDGUC-VLDLとDGUC-LDLの最小限検出可能なまたは存在しません。 RNA分析のために、全RNAのsRNAライブラリー生成のためのタンデム精製HDLの1ミリグラムから単離しました。簡単に説明すると、アダプターは、3 '、その後、5' miRNAおよびTDRS（ 図4A）を含むsRNAsの末端に連結しました。ライゲーション産物は、逆（RT）に転写され、PCRは、ダウ中多重サンプルのために設計され、特定のインデックスを保有するPCRプライマーを用いて増幅しましたnstream配列決定反応（ 図4A）。各アダプタは、長さが61 NTSです。したがって、連結したのmiRNA（長さ約22 NTS）は、長さが144 NTSの製品を生産することになります。多くの非miRNAのsRNAsはわずかに長いのmiRNAよりも（ 例えば 、30 -長さが35 NTS）。このように、製品の私たちの目標と長さは、長さが156ベーシス・ポイントでした。長さが177ベーシス・ポイントを収集した（ 図4A） -増幅産物は、サイズ選択自動DNAサイズセレクタ135は、全てのcDNA産物を使用していました。サイズ選択されたライブラリーの質をバイオアナライザー（ 図4B）を用いた高感度DNAチップによって評価しました。このサイズののsRNA cDNAライブラリーは、分析中に効果を「バブリング」可能性に起因するサイズが若干大きく見えました。多重配列決定のために、cDNAライブラリーの等モル濃度は、プールされた洗浄し、濃縮し、バイオアナライザー（ 図4B）を用いて再分析しました。多重化されたサンプルは、その後sequenましたシングルリードの50 bpのプロトコルを使用してをced。社内データ解析パイプラインは、インデックスに基づいてサンプルを分離するために使用された、アダプターをトリム、実行品質管理メトリックは、ヒトゲノムに整列し、注釈付きのsRNAsを数えます。長さは22国税庁と34 - - HDL（ 図4C）上の長さが35国税庁の正規化の分布はsRNAs 20の濃縮を示して、読み込みの長さで、> 16 NTS（100万、RPMを読み込み）。
アライメントと4 HDL-のsRNAライブラリはの38％がヒトのゲノムの注釈付きの領域に位置合わせする読み取ることがわかったの計数分析は、miRNAの（ 図5A）でした。 （37％）も同様に豊富なsRNAs由来のtRNA（TDRS）からでした。 sRNAs由来雑多のRNA（ 例えば 、YのRNA）、rRNAを、smRNAs、のsnoRNA、および長い非コードRNA（lincRNAs）からは、HDL（ 図5A）にも存在しました。合計数に正規化した後、各クラスの上位50最も豊富なのmiRを読み取りNASは、TDRS（パーのmiRNA、RPMM、 図5Bをマップされた読み込み）（パーはTDRS、RPMT、 図5Cにマッピングされた読み込み）、および他の非のmiRNA非TDR sRNAsはヒートマップによって組織された（PERはのsRNA、RPMS、 図5Dにマップされた読み込み） 。これらのデータは、健康な被験者（ 図5B-D）全体の最も豊富なHDL-sRNAsの（ 例えば、HDL-のmiRNA）との不一致（ 例えば 、TDRS）の類似性を示しています。これらの結果は、HDLによってsRNAsの輸送に顕著な洞察を提供するために、この戦略とプロトコルの力を発揮します。それにもかかわらず、のsRNA配列決定は絶対定量のために信頼するべきではありません。関心のsRNAsは、リアルタイムPCRによって検証されるべきです。同様に、多くの研究者は、HDL上の個々のmiRNAの定量化が必要な場合があります。このように、総HDL RNAは、リアルタイムPCRを使用してHDL-miRNAの相対的定量化のために各被験者から単離しました。 sRNAseqによってHDLで検出された、より豊富なmiRNAのファイブはレアのために使用されましたLタイムPCRアッセイは、それぞれHDL試料（ 図5E）にそれらのレベルを決定します。 RNAの単離13にHDL蛋白入力1000μgのに正規化-相対定量値は、任意のハウスキーピング32のCT（ΔCtArbRQV = 2）を用いて計算しました。リアルタイムPCR研究の結果は、このプロトコルは、HDL-miRNAを検出し、個人の全体の違いを定量化にも価値があることを示しています。まとめると、提示回路図は、メソッドの重要な詳細を定義し、ハイスループットシークエンシングおよびリアルタイムPCRの両方のアプローチからの結果は、このプロトコルの成果を表しています。
議定書の 1. 代表的フローチャート図 。純粋なHDLは、密度勾配超遠心分離および高速タンパク質液体chromatogから単離します raphy。総HDL次いで、RNAを小さなRNA（のsRNA）配列決定のために利用することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HDLの 図2. 単離リポタンパク質および細胞外小胞（EV）の密度および直径の（A）チャート。血漿分離、密度勾配超遠心分離（DGUC）、高速タンパク質を含むシーケンシャルタンデムHDL分離の（B）の回路図、液体クロマトグラフィー（FPLC）、ろ過、濃縮。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PLOAD / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
。リポタンパク質 EV、細胞外ベシクルの 図3. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）分離 ; VLDL、超低密度リポタンパク質。 LDL、低密度リポタンパク質。 HDL、高密度リポタンパク質。 FP、自由なタンパク質; PC、ホスファチジルコリン;そして、TC、総コレステロール。レッドライン、TC;ブルーライン、タンパク質、およびブラックライン、PC。前密度勾配超遠心分離（DGUC）とDGUC後（B）HDL画分への（A）ヒト血漿からのリポタンパク質の分離。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
小RNAライブラリーの 図4 世代。小さなRNA（のsRNA）ライブラリcの（A）の回路図onstructionとサイズ選択。 miRNA、マイクロRNA; TDR、のtRNA由来sRNAs。 sRNA、非miRNAの非TDR sRNAs。 RTは、逆転写。 BP、塩基対。およびHDL-のsRNAのcDNAを、DNAをクローン化した。（B）HDL-のsRNAライブラリの分析多重化の前と後の高感度DNAチップやバイオアナライザーを使用して。（C）の長さの分布は、配列決定した後に読み取ります。 RPMは、百万分の読み込みます。 M、男性被験者; F、女性被験者。およびNT、ヌクレオチド。 N = 4。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HDL-sRNAsの 図5. 多様性。のsRNAクラス全体でHDL-sRNAsの（A）の分布。割合は、ヒトゲノム中の注釈付きsRNAsに整列読み取り。 （BD）ヒートマップN = 4 HDL-のsRNAサンプル。
| リポタンパク質の分離のための1.酸化防止剤 | 100倍で原液を作ります |
| EDTA | エチレンジアミン四酢酸（0.5 M株） |
| AZT | 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール：42 mg / mlとH 2 O |
| BHT | ブチル化ヒドロキシトルエン：25ミリグラム/ 100μLのEtOH |
| トロロックス | （+） - 6-ヒドロキシ2,5,7,8-tetramethylchromane -2-カルボン酸：41.7ミリグラム/ 500μLのEtOH |
| 2.オーバーレイソリューション | |
| 溶液＃1 | H 2 O中の 1.019グラム/ mLの |
| 溶液＃2 | 1.025グラム/ mLでのKBr / H 2 O |
| 溶液＃3 | 1.063グラム/ mLでのKBr / H 2 O |
| 溶液＃4 | 1.080グラム/ mLでのKBr / H 2 O |
| 溶液＃5 | 1.255グラム/ mLでのKBr / H 2 O |
| 3. FPLCバッファー | </ TR> |
| 1 Lのレシピ | 50mLの3MのNaCl; 20 mLの0.5のTris-HCl、pHが7.6、 10％アジ化ナトリウムを2mL。 930 mLのH 2 O |
表1.特殊な試薬。
| ステージ | 温度（°C） | 時間 | サイクル |
| A | 98 | 30秒 | 1 |
| B | 98 | 10秒 | 25 |
| 60 | 30秒 | ||
| 72 | 15秒 | ||
| C言語 | 72 | 10分 | 1 |
表2。ライブラリの生成増幅手順。
| プライマー | シーケンス |
| 入門1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| 入門2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
表3のPCRプライマー。
| ステージ | 温度（°C） | 時間 | サイクル |
| A | 95 | 10分 | 1 |
| B | 95 | 10秒 | 40 |
| 60 |
表4.ライブラリ定量増幅手順。
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Discussion
このプロトコルは、非常に純粋なHDLのハイスループットシークエンシングまたはリアルタイムPCRによりmiRNAおよび他のsRNAsを定量化するために設計されています。いずれのアプローチと同様に、特別な配慮を浄化HDLおよびRNAのプロセスの各ステップに与えられ、その後sRNAsを定量化する必要があります。このプロトコルは、プラズマの≥2 mLで始まるプロジェクトのために設計されています。それにもかかわらず、高品質のRNAの分析は、正常アフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトまたはマウス血漿のわずか80μLから精製したHDLで完了することができます。しかし、より大きな出発プラズマボリュームがここに提示される方法を使用して、より良いデータを生成します。サンプル処理及び抽出方法が劇的なmiRNA /のsRNAの品質と歩留まりを変更することができます。抗凝固剤の使用は、血漿採取のために不可欠ながら、おそらく下流の抽出に影響を与えます。例えば、ヘパリンは、容易にRNA抽出14,15の間に除去されず、PCR 16-18において利用下流の酵素を阻害することができます。また、第EREは、クエン酸ナトリウムはまた、EDTA試料からのmiRNAは、クエン酸ナトリウムサンプル16,19,20に比べて発現プロファイルを改善したことが示されているのqPCR測定を妨害し得ることが報告されています。抗凝固剤を選択する際にこれらの研究は、慎重に検討する必要性を実証します。さらに、凝固時の細胞溶解のための増加の可能性に起因し、血清サンプルを、人工的にリポタンパク質と関連することができる溶解した携帯のmiRNAとして推奨されていません。同様に、プラズマは、理想的に溶解し、白血球を含む他の末梢血液細胞からの汚染を避けるために、全血からすぐに分離されています。低温が広く、血小板活性化に影響を与えることが知られているように、全血試料を、室温で15分間、3,000×gで、赤血球、白血球および血小板から離れて回転させます。彼らはhemol中に流すことができるmiRNAを含むので、破裂した赤血球は、またのmiRNA結果21,22に影響を与えることが報告されているように溶血も悪い助言されますysis 23,24。血漿を2、4℃で保存することができる- 4週間または代替的に、プラズマは、miRNAの含有量は、短期および長期記憶（最大4年）25の両方で安定であり、実行可能である-80℃で凍結されてもよいです。私たちの現在の知識に、血漿サンプルを凍結することは、HDL-miRNAおよび凍結血漿サンプルを分析するのに適しているに害を与えることが予測されていません。リポタンパク質および他の全血液成分は、食物摂取の影響を受けることができるように、空腹時の血液採取が好ましいです。
上記のように、血漿HDLはDGUC、FPLC、およびアポA-Iに対するアフィニティークロマトグラフィーを含む標準的な方法、多くのを通して単離することができます。 。、LDL の（d = 1.006〜1.063グラム/ mL）およびHDL の（d = 1.063から1.21 - Redgravesによって記載されているようにKBrを使用してDGUCによる血漿リポタンパク質の単離、 ら 26、VLDL（1.006グラム/ mLのD = 0.94）を分離グラム/ mL）およびプラズマの大容量（2のための理想的な方法である - サンプルあたり60ミリリットル）。制限単独でこのアプローチを使用するエキソソームと電気自動車を含む他のmiRNAは、HDLと同様の密度を有することが報告されており、DGUC HDL（ 図2A）中に存在してもよいということです。他の欠点は、可能な構造バッファと強い超遠心力の高い塩暴露からのタンパク質へのダメージだけでなく、HDLサブクラス27,28の差動安定性が含まれます。それは、プラズマ29の1ミリリットルあたりのHDLタンパク質1mgのに近い生産、HDLタンパク質の高収率をもたらすようにもかかわらず、DGUCは、一般的に使用されます。 、サイズ排除ゲル濾過を含むFPLCアプローチは、流量（約6時間）に応じて、より少ない時間を必要とし、電気自動車などの大きい（サイズによって）アポB含有リポタンパク質からHDLを分離精度およびそれらのサブクラスを有しますHDLよりもはるかに大きいですが、同様の密度を有すること。直径が75nmでない - 約220の間にプラズマ小胞をこのプロトコルで詳述した方法を使用することに留意すべきですFPLCによって分離された場合に検出可能な脂質やタンパク質の署名を引き出します。げっ歯類のプラズマと小さな冷凍アリコートのために有用である1ミリリットル、 - セットアップに応じて、FPLCは比較的小さな入力、0.3が必要です。迅速な比色コレステロールアッセイはHDLまたは他のリポタンパク質画分の分布を確認するために、FPLCを次のも重要です。分別は、サンプルおよびリポタンパク質を希釈します。しかしながら、試料はその後（ 例えば、10 kDaのカットオフフィルターをMW）は、標準的な遠心サイズのフィルターを用いて濃縮することができます。マイクロスピンカラムを用いて、アポA-I IPによるHDL単離は、3つのアプローチの最も速いですが、低入力によって制限されている（0.08から1μL）容量と低収量（約0.1 mg）を。アポA-I IPが面倒になることができますが、この方法は、低容量細胞培養上清に最適です。これらの各メソッドは長所と短所を有しているがタンデムで使用した場合、これらを低減することができる（ 例えば 、DGUCはFPLCを追いました）。タンデムに二つのアプローチを使用して、より多くの純度をもたらしますmiRNAおよびのsRNA分析のためのHDL。
ここでは、FPLC、続いDGUCのタンデム方式を用いて、高純度のHDLを分離するために必要な手順を詳述し、ハイスループットシークエンシングやリアルタイムPCRのいずれかを使用して、HDL-miRNAおよびsRNAsを定量化するために使用する手順を概説しました。このプロトコルは、HDLのために設計されていますが、それはそれらの密度や大きさに基づいて、LDL及びVLDL、を含む他のリポタンパク質、上のsRNAsを定量化に大きな可能性を有します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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