Summary
Drosophila og pattedyr bloddannende system deler mange fælles træk, hvilket gør Drosophila en attraktiv genetisk model til at studere hæmatopoiese. Her demonstrerer vi dissektion og montering af store larver hæmatopoietisk organ for immunhistokemi. Vi beskriver også metoder til at analysere forskellige larver hæmatopoietiske rum, herunder cirkulerende hæmocytter og fastsiddende krystal celler.
Abstract
Der findes mange paralleller mellem Drosophila og pattedyr hæmatopoietiske systemer, selv om Drosophila mangler den lymfoid herkomst, der karakteriserer pattedyr adaptiv immunitet. Drosophila og pattedyr hæmatopoiese forekomme i rumligt og tidsligt adskilte faser at producere flere blodcellelinjer. Begge systemer opretholder reservoirer af blod-stamceller med til at udvide eller erstatte modne afstamninger. Det hæmatopoietiske system tillader Drosophila og pattedyr til at reagere på og tilpasse sig immune udfordringer. Vigtigere er de transkriptionelle regulatorer og signalveje, der styrer generation, vedligeholdelse og funktion af det hæmatopoietiske system bevaret fra fluer til pattedyr. Disse ligheder gør det muligt Drosophila skal anvendes til genetisk model hæmatopoietisk udvikling og sygdom.
Her er vi detalje analyser til at undersøge hæmatopoietiske system Drosophila larver. IIsær vi skitsere metoder til at måle blod celletal og koncentration, visualisere en bestemt moden afstamning in vivo, og udføre immunhistokemi på blodlegemer i cirkulation og i hæmatopoietisk orgel. Disse assays kan afsløre ændringer i genekspression og cellulære processer, herunder signalering, overlevelse, proliferation og differentiering og kan anvendes til at undersøge en række spørgsmål vedrørende hæmatopoiese. Kombineret med de genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, kan disse assays anvendes til at vurdere det hæmatopoietiske system ved definerede genetiske ændringer. Mens ikke specifikt beskrevet her, kan disse assays også anvendes til at undersøge effekten af miljømæssige ændringer, såsom infektion eller kost, på det hæmatopoietiske system.
Introduction
De komplekse mekanismer, der regulerer transskription faktorer og signalveje, der koordinerer udviklingen af det hæmatopoietiske system, og at fejl i hæmatologiske sygdomme stadig dårligt forstået. Disse transkriptionsfaktorer og signalveje, samt deres regulering, er stærkt konserverede mellem Drosophila og pattedyr hæmatopoiese 1-5. Drosophila hæmatopoietiske system udgør således en fremragende genetisk model til at definere de molekylære mekanismer, der styrer hæmatopoiese og underliggende hæmatologiske sygdomme.
Svarende til pattedyr, Drosophila generere blodlegemer, kaldet hæmocytter, i rumligt og tidsligt adskilte faser af hæmatopoiese. Traditionelt blev Drosophila hæmatopoiese tænkt at være begrænset til faser i det embryoniske mesoderm og i larvernes lymfekirtel. Nylige undersøgelser dokumenterer, at hæmatopoiese også forekommer i larvernes siddende kosters og i den voksne maven 6-8. Alle hæmatopoietiske faser producerer to typer af modne hæmocytter: plasmatocytes og krystal celler. Plasmatocytes er makrofaglignende celler involveret i fagocytose, medfødte immunitet, og sårheling. Krystal celler indeholder pro-phenoloxidaser kræves til melanin, en reaktion, der anvendes i insekt immunreaktioner og sårheling. Larve hæmatopoiese kan generere en tredje moden hemocyte type, der kaldes en lamellocyte, som svar på visse immune udfordringer såsom snyltehveps hveps infektion 9,10. Lamellocytes er store, klæbende celler, der fungerer sammen med plasmatocytes og krystal celler, at indkapsle og neutralisere hveps æg lagt i Drosophila larver. I fravær af parasitization, er lamellocytes ikke fundet i vildtype-larver. Melanotiske masser ligne melanized, indkapslet wasp æg; mange mutant Drosophila-stammer udvikler melanotiske masser i fravær af parasitization. Tilstedeværelsen af Lamellocytes og / eller melanotiske masserne kan være tegn af hæmatopoietiske abnormiteter. Faktisk har den melanotiske masse fænotype blevet anvendt til at identificere gener og pathways involveret i hæmatopoiese 11-14.
Larvestadiet hæmatopoietiske system er den mest omfattende undersøgt til dato. Det består af hæmocytter cirkulerer i hemolymph, fastsiddende hemocyte klynger mønstrede under neglebånd og hæmocytter bosiddende i lymfeknuder kirtel. Den lymfekirtel er en række bilaterale lapper fastgjort til den dorsale fartøj. Hver primære Lap af lymfeknuder kirtel er inddelt i tre hovedzoner. Den yderste zone er kendt som den kortikale zone og indeholder modning hæmocytter. Den inderste zone kaldes medullære zone og består af hvilende hemocyte forstadier. Den tredje zone, den bageste signalering centrum, er en lille gruppe af celler ved basen af lymfekirtel, der fungerer som en stamcelle-lignende niche. Tidligt arbejde etableret kritiske funktioner for Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18, og Vingeløse 21 aktivitet til at regulere larvernes lymfe kirtel udvikling. Nyere undersøgelser har vist, at BMP 22, FGF-Ras 23, og Hippo 24,25 signalering også fungere inden larve lymfekirtel.
Fire larval hæmatopoietiske assays beskrevet her beskriver 1) måling cirkulerende hemocyte koncentration, defineret som antal celler pr volumenenhed, 2) isolering og fiksering cirkulerende hæmocytter for immunhistokemi, 3) visualisere krystal celler in vivo, og 4) dissecting, fastsættelse og montering lymfekirtler for immunhistokemi. Disse assays kan anvendes som hæmatopoietiske udlæsninger at vurdere de funktioner og forskrifter signalveje i larvernes hæmatopoietiske system. Mens disse metoder, der tidligere er blevet anvendt inden for området, har visuelle dokumentation af disse assays begyndt først for nylig 8,26-30. citeret her flere publikationer hjælpful ressourcer der beskriver lignende metoder og hæmatopoietiske markører 26,31-33. Derudover Trol og Viking er nyttige markører for lymfeknuder kirtel basalmembranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cirkulerende Hemocyte Koncentration
- For at opnå larver af nogenlunde samme udviklingsstadiet for denne analyse, begrænser indsamling af æg ved at tillade kvinder at lægge æg for en tidsbegrænset periode af 2 - 6 timer.
- Indsamle larver i dissekere dish brønde fyldt med 1x phosphatpufret saltvand (PBS, tabel 1).
- For hver larve anbringes 10 pi 1x PBS i et mikrocentrifugerør på is og 10 pi 1x PBS på en ren dissekerende pad. Placer dissekere pad på en oplyst stereomikroskop base.
- Tør en individuel larve ved at placere den på et væv tørre, før du overfører det til en PBS dråbe på dissektion pad.
- Ved hjælp af en pincet, forsigtigt rive åben og omhyggeligt invertere neglebånd at frigøre hemolymph.
BEMÆRK: Pas på ikke at skrabe eller jab neglebånd, da dette potentielt kan frigive fastsiddende hæmocytter 29. - Ved hjælp af en pipette, indsamle hæmolymfen fra dissekere pad. Undgå collecting larvernes affald, såsom fedt kroppen.
- Tilsæt hæmolymfe til et mikrocentrifugerør og blandes ved pipettering op og ned.
BEMÆRK: Flere prøver kan indsamles på en gang og holdes på is i op til en time. - Valgfrit: Bland Trypan blå med hæmolymfe prøve i lige dele at farve og udelukke døde celler. Tæl celler i 3 min med tilsætning Trypan blå, fordi det er giftigt for celler.
- Prøven blandes ved pipettering op og ned, før du lægger 10 pi i et hæmocytometer kammer.
- Hvis du bruger en automatiseret celletæller, sæt passende parametre for cellestørrelse og cirkularitet. For eksempel indstille en cellestørrelse på mindst 2 um, en maksimal cellestørrelse på 22 um og en cirkularitet på 75 - med 80% rundhed at detektere normale, runde hæmocytter 34. Eksperimenter med forskellige parametre til at opdage større og spindel-formet hæmocytter, såsom lamellocytes. Alternativt kan du bruge et hæmocytometer til manuelt at tælle hæmocytter.
2. Cirkulerende Hemocyte Immunhistokemi
- For at opnå larver af nogenlunde samme udviklingsstadiet for denne analyse, begrænser indsamling af æg ved at tillade kvinder at lægge æg for en tidsbegrænset periode af 2 - 6 timer.
- Placer en dækglas i hver brønd af en 6- eller 12-brønds plade.
BEMÆRK: Square dækglas (22 mm) passer i 6-brønds plader og runde dækglas (18 mm diameter) passer i 12-brønds plader. - Saml larver i dissekere fad brønde fyldt med 1x PBS.
- Placer 5 pi 1x PBS i midten af hver dækglas.
- Placer pladen på et oplyst stereomikroskop base.
- Tør en individuel larve på et væv tørre og derefter placere i PBS på dækglasset.
- Ved hjælp af en pincet, forsigtigt rive og omhyggeligt invertere neglebånd. Før du fjerner larve slagtekroppen, bruge den til at sprede hemolymph jævnt.
BEMÆRK: Pas på ikke at skrabe eller jab neglebånd, da dette potentielt kan frigive fastsiddende hæmocytter 29. - Repeat for alle larver, indsamle hemolymph én larve pr dækglas. Tillad hæmocytter at overholde de dækglas for 5 -. 8 minutter ved stuetemperatur RT må ikke overstige 30 minutter før fiksering.
- Fix hæmocytter ved tilsætning af 5 pi 7,5% formaldehyd (tabel 1) til hvert dækglas i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vask Dækglas tre gange med 1x PBS. Tip pladen og aspireres PBS efter hver vask. For at forhindre afstrømning af permeabiliseringen løsning i næste trin, skal du bruge sug til at fjerne overskydende PBS fra omkredsen af dækglas.
- Tilsæt 100 pi permeabilisering opløsning (tabel 1) til hvert dækglas i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Tip og forsigtigt trykke pladen at aspirere permeabilization løsning.
- Fortynd primært antistof med antistof opløsning (tabel 1) ifølge leverandørens specifikationer. Tilsæt mindst 500 pi primære antistof løsning på dækglas i 12-brønds plader.Tilføje mindst 1,5 ml i plader med 6 brønde. Der inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Fjern det primære antistofopløsning og vask dækglas med 1x PBS i 10 minutter på en orbitalryster, tre gange.
- Fortynd sekundært antistof med antistof opløsning ifølge leverandørens specifikationer. Tilsæt mindst 500 pi sekundært antistof løsning på dækglas i 12-brønds plader. Tilføje mindst 1,5 ml for 6-brønds plader. Inkuber i mindst 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjern det sekundære antistof opløsning og vask dækglas med 1x PBS i 10 minutter på en orbitalryster som i trin 2.10, tre gange.
- Under vasketrinene rent glas objektglas med 70% ethanol (tabel 1) under anvendelse af væv klude. For hver dækglas, placere 5 pi monterings puffer (tabel 1) på objektglasset.
BEMÆRK: To dækglas være på én slide. - Aspirer endelige PBS vask.
- Brug pincet til forsigtigt at fjerne de dækglas fra pladerne og sted, INVerted, på toppen af den monterings buffer.
Bemærk: mikroskopobjektglas kan opbevares ved 4 ° C før billeddannelse. Maksimal opbevaringstid afhænger af stabiliteten af de anvendte antistoffer. 6- og 12-brønds plader kan skylles og genbruges.
3. In vivo Crystal Cell melanin
- For at opnå larver af nogenlunde samme udviklingsstadiet for denne analyse, begrænser indsamling af æg ved at tillade kvinder at lægge æg for en tidsbegrænset periode på 2-6 timer.
- Før begyndelsen, angive en varmekilde ved 60 ° C.
BEMÆRK: En termisk cykliseringsapparat program på 60 ° C i 10 minutter (efterfulgt af en 25 ° C hold) virker bedst, men et vandbad eller en anden varmekilde er tilstrækkelig, så længe varmen fordeles ensartet og jævnt over hver larve. - Indsamle larver i dissekere dish brønde fyldt med 1x PBS (tabel 1).
- En ad gangen, tørre en larve på et væv tørre og sted i bunden af en PCR-rør. Placer hver larvei et separat PCR-rør. (Se figur 3A.)
- For konsistente resultater, at larver ophold i bunden af PCR-rørene ved nedkøling larver i rørene ved 4 ° C i 10 - 15 min og / eller forsigtigt at banke rørene inden opvarmning.
- Placer PCR-rørene i det termiske cykliseringsapparat (eller vandbad). Der opvarmes til 60 ° C i 10 min.
- Fjern forsigtigt larver fra PCR rør i dissekere skålen brønde fyldt med frisk 1x PBS.
- Tør larver på et væv tørre og arrangere på en flad overflade til billeddannelse under et stereomikroskop.
- Score billeder af larver blindt af flere personer.
4. Larver lymfekirtel Immunhistokemi
BEMÆRK: lymfekirtel er placeret omtrent en tredjedel længde fra den forreste ende af en larve lidt under hjernen på den dorsale side. (Se pilen i figur 3B). Den lymfekirtel flankerer den dorsale fartøj og lettest dissekeret fastgjort til mundingen hooks eller til hjernen. Wild-type, tredje stadiums lymfeknuder er meget små strukturer; de primære flige er ca. 100 - 200 um i længden. (Se figur 4A.)
- For at opnå larver af nogenlunde samme udviklingsstadiet for denne analyse, begrænser indsamling af æg ved at tillade kvinder at lægge æg for en tidsbegrænset periode af 2 - 6 timer.
- Lymfeknuder kirtel dissektion
- For hver eksperimentel betingelse, tilsættes 1 ml 1x PBS (tabel 1) til en brønd i en plade med 24 brønde.
- Tilsættes 1 dråbe 0,1% PBST (tabel 1) til hver brønd med en engangs transfer pipette.
BEMÆRK: Vaskemiddel, såsom Tween 20, tilsættes til nedsætte overfladespændingen, hvilket tillader vævet at synke til bunden af brønden. - Pladen fladt på is.
- Saml larver i dissekere fad brønde fyldt med 1x PBS.
- Placer en ren dissekere pad på en oplyst stereomikroskop base. Brug en engangs overførselspipette at placere small dråber på 0,01% PBST (tabel 1) på puden. Overfør en larve til en PBST drop for dissektion.
- Hold larve med et par tænger ca. en fjerdedel længde fra den bageste ende, dorsale side op.
- Brug et andet par pincet til at gribe neglebånd straks anterior til tangen, der holder larven. Træk forsigtigt neglebånd mod forreste ende, indtil munden krogene er udsat for.
BEMÆRK: Målet er at skrælle neglebånd uden at forstyrre nogen interne strukturer. - Slip neglebånd og bruge begge pincet til at skære larve i to. Fjern den bageste ende fra PBST dråbe.
BEMÆRK: Hvis kutikula ikke skaller hele vejen til munden kroge, skåret larve i to og fjerne den bageste ende. Brug en tang til at holde på kanten af neglebånd, og bruge det andet par pincet til at skubbe munden krogene gennem åbningen. Dette vil vende neglebånd og eksponere munden krogene. Dette kan bruges som en alternspiste dissektion metode samt. - Brug en tang til at pin ned neglebånd (enten ventrale neglebånd, den dorsale neglebånd flap, eller begge) for stabilitet.
- Brug et andet par pincet til at få fat i de udsatte munden krogene og træk dem forsigtigt ud.
BEMÆRK: Dette vil adskille neglebånd fra de interne strukturer. Ideelt set vil øjet / antennal imaginære skiver, hjerne, ring kirtel, og lymfe kirtel flankerer dorsale fartøj forblive på munden krogene. - Mens han stadig holder munden kroge, forsigtigt fjerne uønskede strukturer såsom spytkirtlerne, fedt kroppen, og tarmen.
BEMÆRK: Hvis hjernen adskiller fra munden kroge, kan lymfeknuder kirtel stadig være knyttet til og opsamles med hjernen. I dette tilfælde holde den ventrale nerve ledning i stedet for munden kroge. - Brug af munden kroge eller ventral nerve ledning som et håndtag, overføre det dissekerede kompleks, der indeholder lymfeknuder kirtel til brønden på is. Må ikke overstige 30 minfør fiksering.
- Fiksering og immunhistokemi
- Placer plade med 24 brønde på stereomikroskop base.
- Brug en P200 pipette til forsigtigt at fjerne den PBST fra brønden.
BEMÆRK: Tøm, tilstødende brønde er nyttige for midlertidigt at deponere affald. - Tilføj forsigtigt 200 pi 3,7% formaldehyd (tabel 1) ned side af brønden og hvirvel pladen for at sikre, at de dissekerede væv er fuldstændigt neddykket.
- Returnere pladen til is i 30 minutter. Hvis lymfekirtlerne udtrykker fluorescerende protein (er), holde pladen dækkes for at forhindre fotoblegning.
- Brug en P200 pipette til forsigtigt at fjerne den fiksativ.
- Vask ved tilsætning af 200 pi 1x PBS til brønden og pladen anbringes på en orbitalryster i 5 minutter ved stuetemperatur. Brug en P200 pipette til forsigtigt at fjerne PBS.
BEMÆRK: Fast lymfeknuder kan efterlades på is i PBS indtil lymfekirtler for alle eksperimentelle betingelser er dissected og fast. - Gentag vasketrin to gange mere.
- Der tilsættes 200 pi permeabilisering opløsning (tabel 1) til brønden. Pladen anbringes på en orbital ryster i 45 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: 45 min er "gold standard" for lymfekirtel permeabilisering men forfatterne har succes efter kun 20 min. - Fjern løsning med en P200 pipette.
- Fortynd primært antistof med antistof opløsning (tabel 1) ifølge leverandørens specifikationer. Der tilsættes 300 pi primære antistof opløsning til brønden og sikre, at de dissekerede væv er fuldstændigt neddykket. Der inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Brug en p200 pipette til fjernelse af primære antistof.
- Vask ved tilsætning af 200 pi 1x PBS til brønden og pladen anbringes på en orbital ryster i 10 minutter ved stuetemperatur. Brug en P200 pipette til forsigtigt at fjerne PBS.
- Gentag vasketrin to gange mere.
- Fortynd sekundær etntibody med antistof opløsning ifølge leverandørens specifikationer. Tilsæt 300 pi sekundært antistof opløsning til brønden og sikre, at de dissekerede væv er fuldstændigt neddykket. Inkuber på en orbitalryster i mindst 2 timer ved stuetemperatur.
- Brug en p200 pipette til fjernelse af sekundære antistof og vask som beskrevet i trin 4.3.12 & 4.3.13. Fjern ikke PBS efter den sidste vask.
- Lymfekirtel montering
- Ren mikroskopglasplader med 70% ethanol (tabel 1) og væv klude.
- For hver eksperimentel betingelse, placere en dråbe montering puffer (tabel 1) på objektglasset.
BEMÆRK: To betingelser være på én slide. Montering buffervolumen afhænger af antallet af lymfeknuder, der skal monteres. Bruge 2 pi i ca. 18 - 20 lymfekirtler, 1 pi i 10 - 12 og 0,5 pi til 5 eller derunder. - Placer objektglasset på et oplyst stereomikroskop base.
- For op til to betingelser på et tidspunkt, overføre alle de lymfeknuder fra brønden til montering buffer med pincet, ved hjælp af munden kroge eller ventrale nerve ledning som håndtag.
- Space de dissekerede væv jævnt i en cirkulær eller rektangulær form, spreder den stigende buffer i processen.
- For hver af de dissekerede væv, individuelt skubbe en tong af tangen under den dorsale fartøj og træk forsigtigt mod periferien af monteringselementet buffer.
BEMÆRK: Dette vil trække lymfeknuder kirtel ud fra resten af de dissekerede væv og flade lymfeknuder kirtel på glasset. - Brug en tang af pincet og en savning bevægelse, skære dorsale fartøj mellem lymfeknuder kirtel og hjernen.
- Flyt resten af dissekerede væv til den modsatte side af lymfekirtel, ved den yderste kant af bufferen.
BEMÆRK: De uønskede dissekerede væv i sidste ende vil danne en omkreds omkring lymfekirtlerne og tjene som en støtte på which dækglasset vil hvile. - Gentag indtil alle lymfekirtlerne er adskilt fra de dissekerede væv, reservere en af de uønskede dissekerede væv til at placere i midten.
- Tag et dækglas mellem to fingre. Kontroller, at dækglasset er fri for støv og fingeraftryk. Brug om nødvendigt et væv tørre og 70% ethanol til at rengøre dækglasset.
- Sikre, at kanten af dækglasset er parallel med kanten af objektglasset, sænk forsigtigt dækglasset over monterings buffer.
BEMÆRK: mikroskopobjektglas kan opbevares ved 4 ° C før billeddannelse. Maksimal opbevaringstid afhænger af stabiliteten af de anvendte antistoffer. Plader med 24 brønde kan skylles og genbruges.
5. Imaging
- Billede faste hæmocytter og monteret lymfeknuder på en passende standard fluorescens eller konfokalmikroskop på 20X eller højere forstørrelse efter fabrikantens brugerhåndbog. Billede hel larver på et stativard stereomikroskop ved 2X forstørrelse efter fabrikantens brugerhåndbog.
- Følg software udbyderens instruktioner til udfoldning, hvis det ønskes.
| Løsning | Sammensætning | Opbevaring | Kommentarer |
| 1x PBS | 200 mg / l kaliumchlorid | stuetemperatur | |
| 200 mg / l monobasisk kaliumphosphat | |||
| 8.000 mg / l natriumchlorid | |||
| 1.150 mg / l natriumphosphat dibasisk | |||
| dH2O | |||
| fikservæske | 3,7% eller 7,5% formaldehyd i 1 x PBS | stuetemperatur i mørke | Formaldehyd er giftigt. |
| Permeabilisering løsning / antistoffortynder | 0,4% Triton | 4 ° C | Standardformlen anvender 0,4% Triton men forfatterne anvender 0,1% Tween 20 med succes. Bruges til at fortynde primære og sekundære antistoffer i henhold til udbydernes anbefalede koncentrationer. |
| 5% bovint serumalbumin, normalt gedeserum, eller normal donkey serum | |||
| 1x PBS | |||
| 70% ethanol | 70% 200 proof ethanol i dH2O | stuetemperatur | |
| Montering buffer | 0,5% N-propylgallat | 4 ° C i mørke | N-propylgallat er skadeligt. DAPI er et mutagen. |
| 80% glycerol | |||
| Valgfrit: 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% Tween 20 i 1 x PBS | stuetemperatur | |
| 0,01% PBST | 1:10 fortynding af 0,1% PBST | stuetemperatur |
Tabel 1. Løsninger anvendt i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cirkulerende Hemocyte Koncentration
Hemocyte tal stige i hele larver udvikling 35. For at illustrere at denne metode bestemmes forskelle i hemocyte tal og koncentration, uanset den biologiske årsag, målte vi hemocyte koncentrationer af forsinket og ikke forsinkede larver. Tab af prothoracicotropic hormon (ptth) ved genetisk ablation af ptth-producerende neuroner (ptth> grim) producerer en forsinkelse i larvernes udvikling 36. For hver genotype blev hemocyte koncentrationer målt som beskrevet i protokol 1 i mindst 8 individuelle larve rejst ved 25 ° C. På 120 timer efter en 2 timers indsamling af æg, gennemsnitlige hemocyte koncentration pr forsinket larve (ptth> grim) er mindre end den gennemsnitlige hemocyte koncentration pr kontrol larve (ptth). Først efter 9 dage gør den gennemsnitlige hemocyte koncentration pr forsinket larve tilgang, kontrol (
Billeder taget fra en automatiseret celletæller viser en ren, ønskelig hemolymph prøve og en prøve, der indeholder rester, som kan føre til unøjagtige målinger (figur 1C). Minimum og maksimum cellestørrelser blev sat til 2 um og 22 um, hhv. Cirkularitet blev indstillet til 75-80% rundhed. Disse parametre er beregnet som retningslinjer og bør empirisk optimeres.
Cirkulerende Hemocyte Immunhistokemi
Cirkulerende hæmocytter udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) blev opsamlet, fikseret og inkuberet med en blanding af plasmatocyte-specifikke antistoffer (P1a og P1b, István ando) 31 som beskrevet i protokol 2(Figur 2). Billedet blev taget på en standard fluorescens mikroskop og er vist uændret og efter nødsaget iterativ udfoldning. I dette tilfælde havde udfoldning ikke drastisk forbedre billedkvaliteten.
In vivo Crystal Cell melanin
Larver blev anbragt i bunden af PCR-rør før varmefremkaldt krystalcelle melanin som beskrevet i protokol 3 (figur 3A). Røde pile angiver rør, hvori larver er for langt fra bunden og kan opvarmes ujævnt. Ujævn fordeling af varme tværs enkelte larve kan øge variationen i melanin af krystal celler i larve.
En vildtype-larve afbildes på en standard stereomikroskop viser det typiske mønster af melanized krystal celler i sessile klynger efter varme- eksponering (Figur 3B). Melanized krystal celler i lymfeknuder kirtel undertiden ses.
Larver lymfekirtel Immunhistokemi
Tredje stadiums larver lymfekirtler blev dissekeret, fikseret, og monteret som beskrevet i protokol 4. En differentieret interferens kontrast (DIC) billede taget på en standard fluorescensmikroskop viser de primære og sekundære lymfeknuder kirtel lapper flankerer dorsale fartøj (Figur 4A).
En lymfeknude i hvilken medullære zone og den posteriore signalering center blev genetisk mærket med forbedret blåt fluorescerende protein (EBFP2) og GFP henholdsvis blev farvet med et antistof mod Notch intracellulære domæne (C17.9C6, Developmental Studies Hybridoma Bank) som beskrevet i protokol 4. Z-stack billeder blev taget på en standard fluorescens mikroskop. En enkelt maksimal int ensity projektion billede vises uændret og efter nødsaget iterativ udfoldning (figur 4B). I dette tilfælde, udfoldning drastisk forbedret kvaliteten og detaljerne i billedet.
Figur 1. Cirkulerende Hemocyte Concentration. A) En del af standard Drosophila medium fjernet (til højre) for at fremme æglægning i løbet af en 2 hr ægudtagning periode. B) Den gennemsnitlige hemocyte koncentration pr udviklingsmæssigt forsinket larve (ptth> grim) blev lavere end den gennemsnitlige hemocyte koncentration pr kontrol larver (ptth) 120 timer efter æglægning (AEL). Den gennemsnitlige hemocyte koncentration pr forsinket larve nærmede kontrolniveau 9 dage AEL. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM C) hemolymph prøver uden (venstre) og med (højre) debris. Scale søjler repræsenterer 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cirkulerende Hemocyte Immunhistokemi. Hæmocytter genetisk udtrykker GFP blev indsamlet og fastgjort til et dækglas. En plasmatocyte-specifikt antistof blev anvendt til at farve plasmatocytes (rød). DAPI-farvning er vist i blåt. Uændrede billede taget med et fluorescensmikroskop (venstre). Det samme billede efter udfoldning (højre). Scale søjler repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. In vivo A) larver blev anbragt individuelt i PCR-rør før opvarmning. Røde pile angiver larver, der ikke er i bunden af rørene B) En typisk krystal celle melanin mønster efter opvarmning, hvilket undertiden afslører lymfekirtel (pil;. Dorsale side vist, anterior er venstre). Skala søjle repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Larver lymfeknuder Gland Immunhistokemi. A) En DIC billede af en tredje stadie larver lymfe kirtel viser dorsale fartøj (dv), primære lapper (1 °), og sekundære lapper (2 °). Scale søjle repræsenterer 100 um. B) En repræsentant tredje stadie larver lymfe kirtel from en larve genetisk udtrykke EBFP2 i medullære zone og GFP i den bageste signalering centrum. Lymfeknuder kirtel blev farvet med et antistof mod Notch intracellulære domæne (rød). Uændrede billede taget med et fluorescensmikroskop (øverst). Det samme billede efter udfoldning (nederst). Scale søjler repræsenterer 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved genetisk eller miljømæssig ændring, kan de fire metoder, der er beskrevet her, kan anvendes enkeltvis eller sammen for at analysere forskellige processer under hæmatopoiese såsom signalering, overlevelse, proliferation og differentiering Drosophila hæmatopoiese er en dynamisk proces.; antallet af hæmocytter per dyr øger 35 og strukturen og genekspression af lymfeknuder kirtel skifter 32 under udviklingen. Forud for udførelse af disse analyser, derfor er det vigtigt at begrænse æg samlinger ved at tillade kvinder at lægge æg for et fast beløb af tid, og at bekræfte den ønskede larver udviklingsstadiet. For kortere æg samlinger (mindre end 6 timer) eller til tilfælde, hvor kvinder er usunde eller knappe, kan æglægning fremmes ved at skabe sprækker i maden. Dette kan opnås ved at fjerne en del af fødevarer med en ethanol-renset spatel. Hvis overskydende væske ophobes i maden, bruge væv vådservietter til at opsuge denvæske. (Se figur 1A.)
Alene, de her beskrevne metoder har begrænsninger. For eksempel måler cirkulerende hemocyte koncentration fanger ændringer i hemocyte overlevelse eller proliferation men giver ingen oplysninger om hemocyte afstamning distribution eller enhver afstamning forstyrrelser, der måtte være konsekvent for genetisk eller miljømæssig ændring. Omvendt immunhistokemi af cirkulerende hæmocytter afslører ændringer i specifikke hemocyte slægter i hæmolymfe men kun i de relative, ikke absolut, tal. Krystalcelle melanin in vivo er vanskeligt at kvantificere som krystal cellefordeling er variabel og fastsiddende hæmocytter er dynamiske 8,10. I stedet bør flere personer score krystal celle melanin blindt. Endelig observationer foretages i en hemocyte rum måske ikke nødvendigvis holder stik i andre rum.
Når de anvendes sammen, kan disse assays anvendes til at skelne gentic ændringer, der regulerer proliferation eller overlevelse fra dem, der regulerer genekspression eller differentiering. For eksempel kan en genetisk ændring øge proliferation af hæmocytter således at hemocyte koncentrationen stiger, men de relative andele af hemocyte afstamninger forbliver den samme. Alternativt kan en genetisk ændring fremme ændringer i hemocyte differentiering i specifikke slægter uden effekt på den samlede hemocyte koncentration. Krystal cellepopulation kan afhørt hurtigt og nemt ved hjælp af in vivo-melanin metode, letter genetiske skærme og genetiske interaktionsstudier. Denne metode kan anvendes i bekræftelse med genetiske undersøgelser, der anvender prophenoloxidase 1 (PPO1, også kaldet sorte celler, BC) mutante alleler eller immunhistokemiske assays, der anvender krystal cellespecifikke antistoffer. Den larver lymfe kirtel kan bruges til at behandle lignende spørgsmål vedrørende bloddannende cellulære processer. Talrigesignalveje er involveret i etablering og vedligeholdelse lymfeknuder kirtel og dets vigtigste zoner. Hver zone har særskilte genekspression og funktion i larvernes hæmatopoiese. Derudover kan udnytte lymfeknuder kirtel afsløre selvstændige og ikke-selvstændige funktioner inden for lymfeknuder kirtel zoner eller lymfe kirtel hæmocytter.
Relevante metoder til at studere Drosophila hæmatopoiese er blevet samlet i omfattende tekst-baserede ressourcer først for nylig 26,27. Selvom uundværlig for området, er disse ressourcer begrænset omfang. Metoder til måling hemocyte koncentration, for eksempel, blev ikke inkluderet. Skriftlige metoder, især dem der beskriver dissektion teknikker, kan være en udfordring at mestre hurtigt. Ekstra bidrag er foretaget, giver visuelle ressourcer til at hjælpe med metoder, men var stadig begrænset i antal og omfang 28,29. Metoderne beskrives her, mens også ikke omfattende, føje til de ressourcer Avallable at støtte i studiet af Drosophila hæmatopoiese.
Vi tilbyder modifikationer og alternativer til eksisterende protokoller. For eksempel er der flere fordele ved at måle hemocyte koncentration med en automatiseret celletæller snarere end en manuel hæmocytometer, herunder øget hastighed, lethed, og objektivitet. Det er vores erfaring, anvendelse af et vandbad for at opvarme larver for krystalcelle visualisering resulterede i stærkt varierende resultater, især hvis larverne opvarmes i hætteglassene, hvor de er rejst. Varme larver i individuelle PCR-rør gav mindre variable og mere reproducerbare resultater. Den lymfeknuder kirtel dissektion her beskrevne fremgangsmåde, selvom tidligere skitseret i en skriftlig protokol 26, er et alternativ til de eksisterende visuelle referencer 28. Endelig, hvis adgang til et konfokalt mikroskop er begrænset, foreslår vi, at udfoldning af standard fluorescens billeder kunne være en passende erstatning for konfokale billeder. Deconvolutipå algoritmer enten fjerne eller overflytte ude af fokus lys fanget af konventionel fluorescens mikroskopi, forbedre opløsning og kontrast svarer i princippet til fjernelse af out-of-fokus lys ved konfokal mikroskopi, og kan anvendes til 2-dimensional og 3- dimensionelle (Z-stack) billeder. For nogle programmer, som påvist her, udfoldning kan dramatisk forbedre billeder taget med konventionelle fluorescens mikroskoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M.
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M.
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
