Summary
Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systeme haben viele gemeinsame Merkmale, Drosophila ein attraktives genetisches Modell machen Hämatopoese zu studieren. Hier zeigen wir Präparation und Lagerung des großen Larven hämatopoetischen Organ für die Immunhistochemie. Wir beschreiben Methoden auch verschiedene Larven hämatopoetischen Fächer einschließlich zirkulierenden Blutzellen und sessile-Zellen zu untersuchen.
Abstract
Viele Parallelen zwischen der Drosophila und Säugetieren hämatopoetischen Systems, obwohl Drosophila die lymphoiden Linie fehlt , die Säugetier-adaptive Immunität zu charakterisieren. Drosophila und Säugetieren Hämatopoese treten in räumlich und zeitlich getrennten Phasen mehrere Blutzelllinien zu erzeugen. Beide Systeme halten Stauseen von Blutvorläuferzellen mit dem reifen Linien zu erweitern oder zu ersetzen. Das hämatopoetische System ermöglicht Drosophila und Säugetieren zu reagieren und die Immun Herausforderungen anzupassen. Wichtig ist, dass die Transkriptionsregulatoren und Signalwege, die die Erzeugungssteuerung, Wartung und Funktion des hämatopoetischen Systems von Fliegen zu Säugetieren konserviert. Diese Ähnlichkeiten lassen Drosophila genetisch Modell hämatopoetischen Entwicklung und Krankheit verwendet werden.
Hier stellen wir ausführlich Assays , die die hämatopoetische System von Drosophila - Larven zu untersuchen. ImInsbesondere haben wir Methoden skizzieren Blutzellzahlen und Konzentration zu messen, eine bestimmte reife Linie in vivo sichtbar zu machen , und führen Sie die Immunhistochemie auf Blutzellen im Umlauf und in der hämatopoetischen Organ. Diese Assays können offenbaren Veränderungen in der Genexpression und zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung, Überleben, Proliferation und Differenzierung und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu untersuchen Hämatopoese über. In Kombination mit den genetischen Werkzeuge zur Verfügung , in Drosophila können diese Assays verwendet werden , um das hämatopoetische System auf definierten genetischen Veränderungen zu bewerten. Während hier nicht näher erläutert, können diese Assays auch die Wirkung von Umweltveränderungen, wie Infektionen oder Diät, auf das hämatopoetische System zu prüfen, verwendet werden.
Introduction
Die komplexen Mechanismen, um die Transkriptionsfaktoren und Signalwege regulieren, die die Entwicklung des hämatopoetischen Systems und dass eine Fehlfunktion in hämatologischen Erkrankungen koordinieren bleiben schlecht verstanden. Diese Transkriptionsfaktoren und Signalwege sowie deren Regulation, zwischen Drosophila und Säuger Hämatopoese 1-5 hoch konserviert. So stellt das Drosophila hämatopoetische System ein hervorragendes genetisches Modell der molekularen Mechanismen zu definieren Hämatopoese und hämatologischen Krankheiten zu steuern.
Ähnlich wie bei Säugetieren, erzeugen Drosophila Blutzellen, genannt hemocytes, in räumlich und zeitlich getrennten Phasen der Hämatopoese. Traditionell wurde Drosophila Hämatopoese dachte in der embryonalen Mesoderm und im Larven Lymphdrüsen auf die Phasen beschränkt. Aktuelle Studien belegen, dass die Hämatopoese tritt auch in Larven sessil clusters und im erwachsenen Bauch 6-8. Alle hämatopoetischen Phasen produzieren zwei Arten von reifen Blutzellen: plasmatocytes und Kristallzellen. Plasmatocytes sind Makrophagen wie in Phagozytose, angeborene Immunität beteiligten Zellen und Wundheilung. Kristallzellen enthalten pro-Phenoloxydasen für melanization erforderlich, eine Reaktion in Insektenimmunreaktionen und Wundheilung eingesetzt. Larval Hämatopoese kann eine dritte reifen hemocyte Typ erzeugen, eine so genannte lamellocyte, als Reaktion auf bestimmte Immun Herausforderungen wie Legimmen Infektion 9,10. Lamellozyten sind groß, anhaftenden Zellen , die mit plasmatocytes und Kristallzellen in Verbindung funktionieren, Wespe Eier in Drosophila - Larven gelegt zu kapseln und zu neutralisieren. In Abwesenheit von Parasitierungsleistung, Lamellozyten sind nicht in Wildtyp-Larven gefunden. Melanotische Massen ähneln melanisierten, verkapselte Wespe Eier; viele Mutantenstämme entwickeln Drosophila melanotic Massen in Abwesenheit von Parasitierungsleistung. Die Anwesenheit von lamellozyten und / oder melanotischen Massen können indikativ hämatopoetischer Anomalien sein. In der Tat hat die melanotic Massen Phänotyp verwendet worden in der Hämatopoese 11-14 beteiligten Gene und -wege zu identifizieren.
Die Larven hämatopoetische System ist das am intensivsten die bisher untersucht. Es besteht aus Hämocyten in der Hämolymphe Zirkulieren sessile hemocyte Clustern unter der Cuticula strukturiert und Hämozyten in der Lymphdrüsen wohnen. Die Lymphdrüsen ist eine Reihe von bilateralen Lappen zur dorsalen Gefäß angebracht ist. Jede Primärkeule der Lymphdrüsen gliedert sich in drei Hauptzonen. Die äußerste Zone wird als der Rindenzone bekannt und enthält Reifung Hämocyten. Die innerste Zone wird der Markzone bezeichnet und ruhender hemocyte Vorläufern besteht. Die dritte Zone, die posterior Signalisierungszentrum, ist eine kleine Gruppe von Zellen an der Basis der Lymphdrüsen, die als Stammzelle artige Nischen wirken. Frühe Arbeiten etablierte kritische Funktionen für Notch 15-18 19,20, JAK-STAT 18 und Aktivität Wingless 21 Larven Lymphdrüse Entwicklung zu regulieren. Neuere Studien haben gezeigt , dass BMP 22, FGF-Ras 23 und Hippo 24,25 Signalisierung auch innerhalb der Larven Lymphdrüse funktionieren.
Vier Larven hämatopoetischen Assays hier umrissenen beschreiben 1) Messung zirkulierender hemocyte Konzentration, definiert als Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit, 2) Isolieren und Befestigungs hemocytes für die Immunhistochemie zirkulierende, 3) Kristallzellen in vivo zu visualisieren, und 4) zu sezieren, Fixierens und Befestigungs Lymphdrüsen für die Immunhistochemie. Diese Assays können als hämatopoetische Ablesungen verwendet werden, um die Funktionen und Regeln von Signalwegen im Larven hämatopoetische System zu bewerten. Während diese Verfahren bisher in dem Gebiet, visuelle Dokumentation dieser Assays verwendet wurde erst vor kurzem begonnen 8,26-30. Mehrere Veröffentlichungen hier zitiert sind Hilfeful Ressourcen beschreiben ähnliche Verfahren und hämatopoetischen Marker 26,31-33. Zusätzlich Trol und Viking sind nützliche Marker der Lymphdrüsen Basalmembran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zirkulierende Hemocyte Konzentration
- Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2 - 6 h.
- Sammeln Larven in Sezieren dish Vertiefungen gefüllt mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Tabelle 1).
- Für jede Larve legen 10 ul 1x PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und 10 ul 1x PBS auf eine saubere Sezieren Pad. Legen Sie das Sezieren-Pad auf einem beleuchteten Stereobasis.
- Trocknen eine individuelle Larve, indem es auf ein Gewebe platzieren wischen, bevor es zu einer PBS Tropfens auf der Dissektion Pad zu übertragen.
- Mit einer Pinzette, reißen sanft öffnen und vorsichtig die Kutikula invertieren die Hämolymphe zu lösen.
HINWEIS: Achten Sie darauf , nicht die Nagelhaut zu kratzen oder jab , da dies möglicherweise sessil hemocytes 29 freigeben könnte. - Mit Hilfe einer Pipette, sammeln die Hämolymphe aus dem Sezieren Pad. vermeiden Sie collecting Larven Trümmer wie Fettkörper.
- Fügen Sie die Hämolymphe zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und mischen durch Pipettieren von oben und unten.
HINWEIS: Mehrere Proben können für bis zu einer Stunde auf einmal und auf Eis gehalten gesammelt werden. - Optional: Mix Trypanblau mit der Hämolymphe Probe in gleichen Teilen zu färben und tote Zellen auszuschließen. Zählen von Zellen innerhalb von 3 Minuten der Zugabe von Trypanblau, weil es toxisch für Zellen ist.
- Mischen Sie die Probe durch Pipettieren von oben und unten vor 10 ul in einem Hämocytometer Kammer geladen werden.
- Bei der Verwendung eines automatisierten Zellzähler, eingestellt entsprechenden Parameter für die Zellgröße und Zirkularität. Sie können beispielsweise eine Mindestzellengröße von 2 & mgr; m, eine maximale Zellgröße von 22 & mgr; m und einer Zirkularität von 75-80% Rundung auf normale, runde hemocytes 34 erkennen. Experimentieren Sie mit verschiedenen Parameter erfassen, um größere und spindelförmige hemocytes, wie Lamellozyten. Alternativ können Sie einen Hemocytometer manuell hemocytes zählen.
2. Circulating Hemocyte Immunhistochemie
- Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2 - 6 h.
- Legen Sie ein Deckglas in jeder Vertiefung einer 6- oder 12-Well-Platte.
HINWEIS: Quadrat Deckgläser (22 mm) passen in 6-Well-Platten und runden Deckgläschen (18 mm Durchmesser) passen in 12-Well-Platten. - Sammeln Larven in Sezieren Schale Brunnen mit 1x PBS gefüllt.
- Platz 5 ul 1x PBS in der Mitte jedes Deckglas.
- Legen Sie die Platte auf einer beleuchteten Stereobasis.
- Trocknen Sie eine einzelne Larve auf einem Gewebe wischen und dann in der PBS auf dem Deckglas.
- Mit einer Pinzette vorsichtig reißen und vorsichtig die Kutikula invertieren. Bevor die Larven Kadaver entfernt haben, verwenden sie die Hämolymphe gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: Achten Sie darauf , nicht die Nagelhaut zu kratzen oder jab , da dies möglicherweise sessil hemocytes 29 freigeben könnte. - Repeat für alle Larven, die Hämolymphe eine Larve pro Deckglas zu sammeln. Erlauben Hämozyten zu den Deckgläsern für 5 anhaften - 8 Min . Bei Raumtemperatur RT Nicht 30 min vor der Fixierung überschreiten.
- Fix Hämocyten durch Zugabe von 5 & mgr; l von 7,5% igem Formaldehyd (Tabelle 1) zu jedem Deckglas für 15 min bei Raumtemperatur.
- Wash Deckgläschen dreimal mit 1x PBS. Tipp der Platte und absaugen PBS nach jeder Wäsche. Um Run-off der Permeabilisierung Lösung im nächsten Schritt zu verhindern, verwenden Sie die Saugvorrichtung Überschuss PBS aus Umfang der Deckgläser zu entfernen.
- Füge 100 & mgr; l Permeabilisierung Lösung (Tabelle 1) zu jedem Deckglas 20 min bei RT.
- Tipp und vorsichtig auf die Platte tippen Sie auf die Permeabilisierung Lösung abzusaugen.
- Verdünnte primärer Antikörper mit Antikörperlösung (Tabelle 1) gemäss Anbieterangaben. Hinzufügen, mindestens 500 & mgr; l primärer Antikörper-Lösung Deckgläser in 12-Well-Platten.Fügen mindestens 1,5 ml in 6-Well-Platten. über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Deck mit 1x PBS für 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler, dreimal.
- Verdünnen sekundären Antikörper mit Antikörperlösung gemäss Anbieterangaben. Hinzufügen, mindestens 500 & mgr; l sekundärem Antikörper Lösung Deckgläser in 12-Well-Platten. Fügen mindestens 1,5 ml für 6-Well-Platten. Inkubieren für mindestens 2 h bei RT.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und wasche Deck mit 1x PBS für 10 min auf einem Orbitalschüttler, wie in Schritt 2.10, dreimal.
- Während der Waschschritte, gleitet saubere Glasmikroskop mit 70% Ethanol (Tabelle 1) unter Verwendung von Gewebetüchern. Für jedes Deckglas legen 5 ul Befestigungspuffer (Tabelle 1) auf dem Glasobjektträger.
HINWEIS: Zwei Deckgläser passen auf einer Folie. - Saugen Sie das letzte Waschung PBS.
- Verwenden einer Pinzette vorsichtig die Deckgläser von den Platten entfernen und Platz, Inverted, auf der Oberseite des Montagepuffers.
Hinweis: Die Objektträger können vor der Bilderzeugung bei 4 ° C gelagert werden. Maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der Antikörper verwendet. 6- und 12-Well-Platten kann gespült und wiederverwendet werden.
3. In - vivo-Zelle Melanisierung
- Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2-6 Stunden.
- Bevor Sie beginnen, eingestellt bei 60 ° C eine Heizquelle.
HINWEIS: Ein Thermocycler-Programm von 60 ° C für 10 min (gefolgt von einem 25 ° C halten) funktioniert am besten, aber ein Wasserbad oder eine andere Wärmequelle ist ausreichend, solange die Wärme einheitlich verteilt und gleichmäßig über jede Larve. - Sammeln Larven in Sezieren Schüssel Vertiefungen gefüllt mit 1x PBS (Tabelle 1).
- Ein zu einer Zeit, trocknen eine Larve auf einem Gewebe wischen und Platz an der Unterseite eines Rohres PCR. Platzieren Sie jede Larvein einem separaten PCR-Röhrchen. (Siehe Abbildung 3A) .
- Um eine konstante Qualität zu gewährleisten, dass die Larven Aufenthalt am Boden der PCR-Röhrchen von Larven in den Rohren bei 4 ° C Kühlung 10 - 15 min und / oder sanft die Rohre vor dem Erhitzen tippen.
- Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler (oder Wasserbad). Hitze bei 60 ° C für 10 min.
- Entfernen Sie vorsichtig Larven aus den PCR-Röhrchen in die Schüssel Sezieren Brunnen mit frischem 1x PBS gefüllt.
- Trockene Larven auf einem Gewebe wischen und auf einer ebenen Fläche für die Bildgebung unter einem Stereomikroskop.
- Spiel Bilder von Larven blind durch mehrere Personen.
4. Larval Lymphdrüse Immunhistochemie
HINWEIS: Die Drüse Lymphe befindet sich etwa ein Drittel der Länge von dem vorderen Ende einer Larve leicht unter dem Gehirn auf der Rückenseite. (Siehe Pfeil in 3B) . Die Lymphdrüsen Flanken des Schiffes dorsalen und wird am einfachsten an den Mund hoo seziertks oder an das Gehirn. Wildtyp, dritten Häutungsstadium Lymphdrüsen sind sehr kleine Strukturen; Die primären Keulen sind ungefähr 100 bis 200 & mgr; m in der Länge. (Siehe Abbildung 4A) .
- Um Larven von etwa der gleichen Entwicklungsstufe für diesen Test zu erhalten, beschränken Eiersammlung von Frauen ermöglicht, Eier zu legen für einen festen Zeitraum von 2 - 6 h.
- Lymphdrüsen Dissektion
- Für jede Versuchsbedingung, 1 ml 1x PBS (Tabelle 1) eine Vertiefung einer 24-Well - Platte.
- 1 Tropfen von 0,1% PBST (Tabelle 1) in jede Vertiefung eine Einweg - Transfer - Pipette.
HINWEIS: Detergens, wie Tween 20, zugegeben, um die Oberflächenspannung zu senken, so dass das Gewebe an den Boden des Bohrlochs zu versenken. - Legen Sie die Platte flach auf dem Eis.
- Sammeln Larven in Sezieren Schale Brunnen mit 1x PBS gefüllt.
- Setzen Sie eine saubere Sezieren-Pad auf einem beleuchteten Stereobasis. Verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette Smal zu platzierenl Tropfen von 0,01% PBST (Tabelle 1) auf der Unterlage. Übertragen Sie eine Larve zu einem PBST Tropfen für die Präparation.
- Halten Sie die Larve mit einer Zange etwa ein Viertel der Länge von dem hinteren Ende, Rückenseite nach oben.
- Verwenden Sie eine andere Zange die Kutikula zu greifen sofort an die Zange anterioren, die die Larve halten. Ziehen Sie die Nagelhaut zu dem vorderen Ende, bis die Mundhaken ausgesetzt sind.
HINWEIS: Das Ziel ist es, die Kutikula zu schälen, ohne irgendwelche internen Strukturen zu stören. - Lassen Sie die Kutikula und verwenden beide Zange die Larve in zwei zu schneiden. Entfernen Sie das hintere Ende aus dem PBST Tropfen.
HINWEIS: Wenn die Kutikula nicht den ganzen Weg zu den Mundhaken nicht schälen, schneiden Sie die Larve in zwei und das hintere Ende zu entfernen. Verwenden Sie eine Zange den Rand der Kutikula zu halten, und mit der anderen Zange die Mundhaken durch die Öffnung zu schieben. Dadurch wird die Kutikula invertieren und die Mundhaken aus. Dies kann als altern verwendet werdenaß auch Dissektion Methode. - Verwenden Sie eine Zange die Kutikula festzunageln (entweder die ventrale Kutikula, die dorsale Kutikula Klappe oder beides) für Stabilität.
- Verwenden Sie eine andere Zange die freiliegenden Mund Haken zu greifen und sie vorsichtig heraus.
Hinweis: das wird die Kutikula von den inneren Strukturen zu trennen. Idealerweise wird das Auge / antennal Imaginalscheiben, Gehirn, Ring Drüse und Lymphdrüsen flankieren das Rückengefäß an den Mundhaken befestigt bleiben. - Während noch die Mundhaken halten, vorsichtig entfernen unerwünschte Strukturen wie die Speicheldrüsen, Fettkörper und Darm.
HINWEIS: Wenn das Gehirn aus den Mundhaken trennt, kann die Lymphdrüsen noch zu und mit dem Gehirn gesammelt angebracht werden. In diesem Fall halten Sie die Bauchmark statt der Mundhaken. - Unter Verwendung der Mundhaken oder Bauchmark als Griff, übertragen Sie den sezierten Komplex die Lymphdrüsen zum Brunnen auf Eis enthält. Nicht mehr als 30 Minutenvor der Fixierung.
- Fixierung und Immunhistochemie
- Legen Sie die 24-Well-Platte auf der Stereobasis.
- Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig die PBST aus dem Bohrloch zu entfernen.
HINWEIS: Leer, sind benachbarte Brunnen nützlich vorübergehend Abfall zu deponieren. - Fügen Sie vorsichtig 200 ul 3,7% Formaldehyd (Tabelle 1) an der Seite des Brunnens und schwenken Sie die Platte , um sicherzustellen , dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind.
- Bringen Sie die Platte auf Eis für 30 min. Wenn die Lymphdrüsen fluoreszierendes Protein (e) exprimieren, halten Sie die Platte Photobleichens zu verhindern abgedeckt.
- Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig das Fixiermittel zu entfernen.
- Waschen mit 200 ul 1x PBS zum gut Zugabe und die Platte auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten bei Raumtemperatur setzt. Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig die PBS zu entfernen.
HINWEIS: Fest Lymphknoten können bis Lymphdrüsen auf Eis in PBS gelassen werden für alle experimentellen Bedingungen dissected und fixiert. - Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male die Schritte.
- In 200 ul Permeabilisierung Lösung (Tabelle 1) auf den Brunnen. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 45 min bei RT.
HINWEIS: 45 min ist der "Goldstandard" für die Permeabilisierung Lymphdrüse aber die Autoren haben Erfolg nach nur 20 Minuten. - Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette p200.
- Verdünnte primärer Antikörper mit Antikörperlösung (Tabelle 1) gemäss Anbieterangaben. In 300 ul primären Antikörperlösung zum Brunnen und sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind. über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Verwenden Sie eine p200 Pipette den primären Antikörper zu entfernen.
- Waschen mit 200 ul 1x PBS zum gut Zugabe und die Platte auf einem Orbitalschüttler platziert für 10 min bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine p200 Pipette vorsichtig die PBS zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male die Schritte.
- Verdünnen Sekundär einntibody mit Antikörperlösung gemäss Anbieterangaben. In 300 ul sekundären Antikörper-Lösung zum Brunnen und sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe vollständig untergetaucht sind. Inkubieren auf einem Orbitalschüttler für mindestens 2 h bei RT.
- Verwenden Sie eine p200 Pipette den sekundären Antikörper zu entfernen und waschen wie in den Schritten 4.3.12 & 4.3.13 beschrieben. Sie nicht die PBS nach der letzten Wäsche zu entfernen.
- Lymphdrüsen Montage
- Saubere Glasobjektträger 70% Ethanol (Tabelle 1) und Gewebetücher verwenden.
- Für jede experimentelle Bedingung, einen Tropfen Puffer (Tabelle 1) auf dem Glasträger Befestigungs.
HINWEIS: Zwei Bedingungen passen auf einer Folie. Puffervolumen hängt Drüsen auf die Anzahl der Lymphe Montage montiert werden. Verwenden 2 & mgr; l für etwa 18 bis 20 Lymphknoten, 1 & mgr; l für 10 bis 12 und 0,5 & mgr; l für 5 oder weniger. - Platzieren Sie den Objektträger auf einer beleuchteten Stereobasis.
- Für bis zu zwei Bedingungen zu einer Zeit, übertragen alle der Lymphdrüsen aus dem Bohrloch zu dem Montagepuffer mit einer Pinzette, die Mundhaken oder Bauchmark als Griff verwendet wird.
- Raum, um die sezierten Gewebe gleichmäßig in einer kreisförmigen oder rechteckigen Form, die Montagepuffer in dem Prozess zu verbreiten.
- Für jede der sezierten Gewebe, einzeln Schieben einer Zange der Zange unter die dorsale Gefäß und sanft in Richtung auf die Peripherie des Montagepuffers ziehen.
Hinweis: das wird die Lymphe Drüse aus dem Rest der sezierten Gewebe ziehen und die Lymphdrüsen auf dem Glas glätten. - Mit einer Zange der Zange und eine Sägebewegung, schneiden Sie das Rückengefäß zwischen der Lymphdrüsen und das Gehirn.
- Bewegen Sie den Rest der sezierten Gewebe zu der gegenüberliegenden Seite der Lymphdrüsen, am äußersten Rand des Puffers.
HINWEIS: Die unerwünschten sezierten Gewebe werden schließlich einen Umfang um die Lymphknoten bilden und als Unterstützung bei whic dienenh das Deck ruhen wird. - Wiederholen, bis alle der Lymphknoten aus den sezierten Gewebe getrennt sind, eine der unerwünschten zergliederte Gewebe Reservierung in der Mitte zu platzieren.
- Nehmen Sie ein Deckglas zwischen zwei Fingern. Überprüfen Sie, ob das Deckglas frei von Staub und Fingerabdrücke. Verwenden Sie bei Bedarf ein Gewebe wischen und 70% Ethanol, um das Deckglas zu reinigen.
- Sicherzustellen, dass der Rand des Deckglases an der Kante des Objektträgers parallel ist, sorgfältig das Deckglas über dem Montagepuffer senken.
HINWEIS: Die Objektträger können vor der Bilderzeugung bei 4 ° C gelagert werden. Maximale Lagerzeit hängt von der Stabilität der Antikörper verwendet. 24-Well-Platten gespült und wiederverwendet werden.
5. Imaging
- Bild fixiert hemocytes und montiert Lymphdrüsen auf einem geeigneten Standard-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskop bei 20facher oder höherer Vergrößerung nach Herstellerbetriebsanleitung. Bild ganze Larven auf einem Ständerard Stereomikroskop bei 2-facher Vergrößerung Bedienungsanleitung des gemäß Hersteller.
- Folgen Softwareanbieter Anweisungen für Dekonvolution, falls gewünscht.
| Lösung | Zusammensetzung | Lagerung | Bemerkungen |
| 1x PBS | 200 mg / l Kaliumchlorid | Zimmertemperatur | |
| 200 mg / l monobasisches Kaliumphosphat | |||
| 8000 mg / L Natriumchlorid | |||
| 1.150 mg / l Natriumhydrogenphosphat | |||
| dH 2 O | |||
| Fixativ | 3,7% oder 7,5% Formaldehyd in PBS 1x | Raumtemperatur im Dunkeln | Formaldehyd ist toxisch. |
| Permeabilisierung Lösung / Antikörper-Verdünnungsmittel | 0,4% Triton | 4 ° C | Die Standardformel verwendet 0,4% Triton aber die Autoren verwenden 0,1% Tween 20 mit Erfolg. Verwenden Sie zur primären und sekundären Antikörper verdünnt nach Anbieter empfohlenen Konzentrationen. |
| 5% Rinderserumalbumin, normales Ziegenserum oder normalem Eselserum | |||
| 1x PBS | |||
| 70% Ethanol | 70% 200 Proof Ethanol in dH2O | Zimmertemperatur | |
| Montagepuffer | 0,5% N-Propylgallat | 4 ° C im Dunkeln | N-Propylgallat ist schädlich. DAPI ist ein mutagen. |
| 80% Glycerol | |||
| Optional: 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) | |||
| 1x PBS | |||
| 0,1% PBST | 0,1% Tween 20 in 1x PBS | Zimmertemperatur | |
| 0,01% PBST | 1:10 Verdünnung von 0,1% PBST | Zimmertemperatur |
Tabelle 1. Lösungen in diesem Protokoll verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zirkulierende Hemocyte Konzentration
Hemocyte Zahlen erhöhen gesamten Larvenentwicklung 35. Zu veranschaulichen, dass diese Methode erkennt Unterschiede in hemocyte Zahlen und Konzentration, unabhängig von der biologischen Ursache wir gemessen hemocyte Konzentrationen von verzögerten und unverzögerten Larven. Der Verlust der Prothorakotropes Hormon (PTTH) durch genetische Ablation von PTTH produzierenden Neuronen (PTTH> grimmig) eine Verzögerung bei der Larvenentwicklung 36. Für jeden Genotyp wurden hemocyte Konzentrationen gemessen, wie in Protokoll 1 für mindestens 8 Einzel Larven erhöht, bei 25 ° C beschrieben. Bei 120 h nach 2 h Eiersammlung, die durchschnittliche hemocyte Konzentration pro verzögert Larve (PTTH> grimmig) kleiner ist als die durchschnittliche hemocyte Konzentration pro Steuer Larve (PTTH). Erst nach 9 Tagen hat die durchschnittliche hemocyte Konzentration pro verzögert Larve Ansatz, dass der Kontrollen (
Bilder aus einem automatisierten Zellzähler genommen zeigen eine saubere, wünschenswert Hämolymphe Probe und eine Probe , die Trümmer, die zu einer ungenauen Messung (Abbildung 1C) führen könnte. Minimale und maximale Zellgrößen wurden jeweils auf 2 & mgr; m und 22 & mgr; m eingestellt. Circularity wurde auf 75-80% Rundung gesetzt. Diese Parameter werden als Richtlinien gedacht und sollte empirisch optimiert werden.
Zirkulierende Hemocyte Immunhistochemie
Zirkulieren hemocytes exprimierenden grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden gesammelt, fixiert, gewaschen und mit einer Mischung aus plasmatocyte-spezifischen Antikörpern (P1a und P1b, István Andó) 31 , wie in 2 beschriebenen Protokoll(Abbildung 2). Das Bild wurde auf einem Standard-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und wird dabei unverändert und nach erzwungener iterative Entfaltungs gezeigt. In diesem Fall Entfaltungs nicht verbessert drastisch die Bildqualität.
In Vivo-Zelle Melanisierung
Larven wurden vor an der Unterseite des PCR - Röhrchen gegeben , um wärmeinduzierte Melanisierung Kristallzelle , wie in Protokoll 3 (3A) beschrieben wird . Rote Pfeile zeigen Röhren, in denen Larven sind zu weit von dem Boden und möglicherweise ungleichmäßig erwärmt werden. Eine ungleichmäßige Verteilung der Wärme über einzelne Larve kann Variabilität in der melanization von Kristallzellen innerhalb der Larve erhöhen.
Ein Wildtyp-Larve auf einem Standard-Stereomikroskop abgebildet zeigt das typische Muster von melanisierten Kristallzellen in sessile Cluster nach der Hitzeexposition (3B). Melanisierten Kristallzellen in der Lymphdrüsen sind manchmal zu sehen.
Larval Lymphdrüse Immunhistochemie
Dritte Larvenstadium Larven Lymphknoten wurden seziert, fixiert und montiert , wie in Protokoll 4. Ein Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bild auf einem Standard - Fluoreszenzmikroskop zeigt die primären und sekundären Lymphdrüsen Keulen flankieren das Rückengefäß (4A) genommen beschrieben.
A Lymphdrüsen, in dem der Markzone und die hintere Signalzentrum wurden genetisch mit verbesserten blau fluoreszierendes Protein (EBFP2) markiert und GFP bzw. wurde mit einem Antikörper gegen das Notch intrazelluläre Domäne (C17.9C6, Developmental Studies Hybridoma Bank) gefärbt, wie in Protokoll beschrieben 4. Z-Stapel-Bilder wurden auf einem Standard-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Ein einziges Maximum int ichte Projektionsbild erscheint unverändert und nach erzwungener iterative Entfaltungs (4B). In diesem Fall verbessert Entfaltungs drastisch die Qualität und Detail des Bildes.
Abbildung 1. Hemocyte Konzentration Zirkulierende. A) Ein Teil des Standard Drosophila Medium wurde entfernt (rechts) Eiablage während einer 2 h Ei Erfassungszeitraum. B) Die durchschnittliche hemocyte Konzentration pro entwicklungspolitisch verzögert Larve (PTTH> grimmig) zu fördern war niedriger als die durchschnittliche hemocyte Konzentration pro Kontrollarven (PTTH) 120 Stunden nach der Eiablage (AEL). Die durchschnittliche hemocyte Konzentration pro verzögert Larve genähert Steuerungsebene 9 Tage AEL. Fehlerbalken stellen ± SEM C) Hämolymphe Proben ohne (links) und mit (rechts) Schutt. Maßstabsbalken repräsentieren 0,1 mm.href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Umlauf Hemocyte Immunhistochemie. Blutzellen genetisch, die GFP wurden gesammelt und auf einem Deckglas fixiert. Ein plasmatocyte-spezifischen Antikörper wurde auf Flecken plasmatocytes (rot) verwendet. DAPI-Färbung ist in Blau dargestellt. Unverändertes Bildes mit einem Fluoreszenzmikroskop (links) entnommen. Das gleiche Bild nach der Dekonvolution (rechts). Maßstabsbalken stellen 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. In Vivo A) Larven wurden einzeln in PCR - Röhrchen vor dem Erhitzen platziert. Rote Pfeile zeigen Larven , die nicht an der Unterseite der Rohre B) Eine typische Kristallzelle melanization Muster nach dem Erhitzen, die manchmal die Lymphdrüsen zeigt (Pfeil;. Dorsalen Seite gezeigt, anterior links). Maßstabsbalken entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Larval Lymphdrüse Immunhistochemie. A) Ein DIC Bild eines dritten Häutungsstadium Larven das Rückengefäß zeigt Lymphdrüsen (dv), primäre Keulen (1 °) und Nebenkeulen (2 °). Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. B) Ein Vertreter dritten Häutungsstadium Larven Lymphdrüse from eine Larve genetisch EBFP2 in der Markzone und GFP im hinteren Signalzentrum ausdrückt. Die Lymphknoten wurden mit einem Antikörper gegen das Notch intrazelluläre Domäne (rot) gefärbt. Unverändertes Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop (oben) entnommen. Das gleiche Bild nach der Dekonvolution (unten). Maßstabsbalken stellen 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bei genetische oder umweltbedingte Veränderungen, die vier hier beschriebenen Verfahren können einzeln oder in Verbindung verwendet werden , um unterschiedliche Prozesse während der Hämatopoese analysieren wie Signalisierung, Überleben, Proliferation und Differenzierung Drosophila Hämatopoese ist ein dynamischer Prozess. die Anzahl der Hämozyten pro Tier erhöht 35 und die Struktur und die Genexpression der Lymphdrüsen ändert 32 während der Entwicklung. Vor dieser Tests durchführen, deshalb ist es wichtig, Ei Sammlungen zu beschränken, indem Weibchen so dass Eier für eine bestimmte Zeit zu legen und die gewünschte Larvenentwicklungsstadium zu bestätigen. Für kürzere Ei Sammlungen (weniger als 6 Stunden) oder für Fälle, in denen Frauen ungesund oder knapp sind, kann die Eiablage durch die Schaffung von Spalten in der Nahrung gefördert werden. Dies kann durch Entfernen eines Teils von Lebensmitteln mit einem Ethanol-gereinigt Spatel durchgeführt werden. Wenn die überschüssige Flüssigkeit in der Nahrung sammelt, wischt Verwendung Gewebe aufzusaugen dieFlüssigkeit. (Siehe Abbildung 1A) .
Allein die beschriebenen Methoden hier haben ihre Grenzen. Zum Beispiel erfasst Änderungen in hemocyte Überleben oder Proliferation zirkulierenden hemocyte Konzentration messen, aber liefert keine Informationen über hemocyte Abstammung Verteilung oder aus einer Linie Störung, die auf genetische oder umweltbedingte Veränderung konsequent sein könnten. Im Gegensatz dazu Immunhistochemie zirkulierender hemocytes zeigt Veränderungen in spezifischen hemocyte Abstammungslinien in der Hämolymphe aber nur relativ, nicht absolut, Zahlen. Kristallzelle melanization in vivo ist schwierig zu quantifizieren , wie ein Kristall Zellverteilung ist variabel und sessile hemocytes sind dynamisch 8.10. Vielmehr sollten mehrere Personen blind Kristallzelle melanization punkten. Schließlich Beobachtungen in einem hemocyte Fach möglicherweise nicht unbedingt zutreffen, in anderen Fächern aus.
Wenn sie zusammen verwendet werden, können diese Assays angewendet werden Gens zu unterscheiden,tic Veränderungen, die Proliferation oder Überleben von denen regulieren die Genexpression oder Differenzierung regulieren. Zum Beispiel kann eine genetische Veränderung Proliferation von Hämozyten erhöhen, so dass hemocyte Konzentration steigt aber die relativen Anteile der hemocyte Abstammungslinien gleich bleibt. Alternativ kann eine genetische Veränderung Veränderungen ohne Auswirkungen auf die Gesamt hemocyte Konzentration hemocyte Differenzierung in bestimmte Abstammungslinien zu fördern. Die Kristallzellpopulation kann schnell und einfach die in vivo melanization Methode abgefragt werden, genetischen Screens und genetische Studien zu Wechselwirkungen zu erleichtern. Dieses Verfahren kann in Erhärtung mit genetischen Untersuchungen verwendet werden , die Prophenoloxidase 1 (PPO1, auch genannt schwarzen Zellen, Bc) Mutantenallelen oder immunhistochemischen Assays verwenden , die ussigkristallzelle-spezifische Antikörper verwenden. Die Larven Lymphdrüse kann verwendet werden, um ähnliche Fragen in Bezug auf hämatopoetischen Zellprozesse zu adressieren. zahlreichSignalwege werden bei der Festlegung und Aufrechterhaltung der Lymphdrüsen und seine Hauptzonen beteiligt. Jede Zone hat deutliche Genexpression und Funktion in Larven- Hämatopoese. Zusätzlich können autonom und nicht autonomen Funktionen innerhalb der Lymphdrüsen Zonen oder Lymphdrüsen hemocytes zeigen die Lymphdrüsen verwendet.
Relevante Methoden zur Untersuchung von Drosophila Hämatopoese haben erst vor kurzem 26,27 in umfangreichen textbasierten Ressourcen zusammengestellt. Obwohl unverzichtbar für das Feld, werden diese Ressourcen in ihrem Umfang begrenzt. Verfahren zur Messung hemocyte Konzentration, beispielsweise wurden nicht berücksichtigt. Schriftliche Verfahren, insbesondere solche, beschreibt Dissektion Techniken, kann eine Herausforderung sein schnell zu meistern. Zusätzliche Beiträge vorgenommen wurden, visuelle Ressourcen Bereitstellung von Methoden zur Unterstützung, wurden aber noch in der Zahl und in ihrem Umfang begrenzt 28,29. Die hier beschriebenen Methoden, aber auch nicht alle Informationen, avai zu den Ressourcen hinzufügenLabel in der Studie von Drosophila Hämatopoese zu unterstützen.
Wir bieten Modifikationen und Alternativen zu bestehenden Protokolle. Zum Beispiel gibt es mehrere Vorteile hemocyte Konzentration mit einem automatisierten Zellzähler anstatt eines manuellen Hemocytometer, einschließlich der erhöhten Geschwindigkeit, Leichtigkeit und Objektivität zu messen. Nach unserer Erfahrung ein Wasserbad Larven für Kristallzelle Visualisierung aufzuheizen resultierte in stark variable Ergebnisse, vor allem, wenn die Larven in den Phiolen erhitzt werden, in der sie angehoben werden. Heizung Larven in einzelnen PCR-Röhrchen ergab weniger variabel und reproduzierbare Ergebnisse. Die Lymphdrüsen Dissektion hier beschriebene Methode, obwohl zuvor in einem schriftlichen Protokoll dargelegt 26, bietet eine Alternative zu bestehenden visuellen Referenzen 28. Schließlich, wenn der Zugang zu einem konfokalen Mikroskop begrenzt ist, empfehlen wir, dass Entfaltungs von Standard-Fluoreszenzbilder könnte ein geeigneter Ersatz für die konfokale Bilder sein. Deconvolutientweder auf Algorithmen entfernen oder neu zuzuweisen out-of-focus durch herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie erfasst Licht, die Auflösung zu verbessern und im Prinzip der Eliminierung von out-of-focus Licht durch konfokale Mikroskopie ähnlichen Kontrast und kann bis zu 2-dimensionalen und 3 angewendet werden, dimensionalen (Z-Stack) Bilder. Für einige Anwendungen, wie hier gezeigt, kann drastisch Dekonvolution Bilder verbessern, mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopen gemacht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine oder finanzielle Interessen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M.
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M.
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
