Summary
Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.
Abstract
Birçok paralellik. Drosophila memeli adaptif bağışıklık karakterize lenfoid soyu eksikliği olsa bile, Drosophila ve memeli hematopoetik sistemler arasında mevcut Drosophila ve memeli hematopoez çeşitli kan hücre soylarından üretmek için mekansal ve zamansal farklı aşamalarında ortaya çıkar. Her iki sistem de genişletmek veya olgun soy yerine hangi kan hücresi atalarıdır rezervuarları korumak. Hematopoetik sistem Drosophila ve memeliler yanıt vermek ve bağışıklık zorluklara uyum sağlar. Önemlisi, nesil, bakım ve hematopoetik sistemin fonksiyonunu kontrol transkripsiyonel düzenleyicileri ve sinyal yolları memelilere sinekler muhafaza edilir. Bu benzerlikler Drosophila genetik model, hematopoetik gelişimi ve hastalığa kullanılmasına izin.
Burada ayrıntı deneyleri Drosophila larvaların hematopoetik sistemi incelemek için. İçindeÖzellikle, biz, kan hücre sayıları ve konsantrasyonu ölçmek in vivo belirli bir olgun soy görselleştirmek ve dolaşımdaki ve hematopoetik organ kan hücrelerinde immünhistokimya gerçekleştirmek için yöntemler özetlemektedir. Bu deneyler, gen ifadesi değişikliklerini ve sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hücresel süreçleri ortaya çıkarabilir ve hematopoezisi ilgili çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Drosophila uygun genetik araçlar ile birlikte, bu deneyler, tanımlanmış genetik değişiklikler üzerine hematopoietik sistem değerlendirmek için de kullanılabilir. Özellikle, burada belirtilen olmasa da, bu deneyler, aynı zamanda hematopoietik sistemi üzerinde enfeksiyon veya diyet gibi çevresel değişiklikleri, etkisini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
hematolojik hastalıklarda hematopoetik sisteminin geliştirilmesi ve bu arızaya koordinat transkripsiyon faktörlerini ve sinyal yolları düzenleyen karmaşık mekanizmalar yeterince anlaşılamamıştır. Bu transkripsiyon faktörleri ve sinyal yolları, hem de bunların düzenlenmesi, yüksek Drosophila ve memeli hematopoez 1-5 arasında muhafaza edilir. Böylece Drosophila hematopoetik sistem hematopoezisi ve altta yatan hematolojik hastalıkları kontrol moleküler mekanizmaları tanımlamak için mükemmel bir genetik modeli temsil etmektedir.
Memelilere benzer şekilde, Drosophila hemopoeziste mekansal ve zamansal farklı aşamalarında hemocytes denilen kan hücreleri, üretir. Geleneksel olarak, Drosophila hematopoez embriyonik mezoderm ve larva lenf bezinde fazlar sınırlı olabileceği düşünüldü. hematopoez da larva sapsız CLU meydana geldiği Son çalışmalar kanıtsters 6-8 karın yetişkin. plazmatositler ve kristal hücreleri: Tüm hematopoetik fazlar olgun hemocytes iki türleri üretmek. Plazmatositler fagositoz, doğal bağışıklık ve yara iyileşmesinde rol makrofaj benzeri hücrelerdir. Kristal hücreleri melanization, böcek bağışıklık tepkilerinin ve yara iyileşmesinde kullanılan bir reaksiyon için gerekli olan ön-fenoloksidazlar içerir. Üçüncü olgun hemocyte türü oluşturabilir Larva hematopoez gibi parazitoit eşek arısı enfeksiyonu 9,10 gibi bazı bağışıklık zorluklara cevaben, bir lamellocyte çağırdı. Lamellocytes saklanması ve Drosophila larvalarının döşenen arısı yumurta nötralize etmek için, plazmatositler ve kristal hücreleri ile bağlantılı olarak, işlev büyük, yapışan hücreler bulunmaktadır. parazitlenme yokluğunda, lamellocytes vahşi tip larvaları bulunmaz. Melanotik kitleler melanized, kapsüllü yabanarısı yumurtalarını benzer; Birçok mutant Drosophila suşları Parazitlenme yokluğunda melanotik kitleleri geliştirmek. Lamello varlığılenfositler ve / veya melanotik kitleler hematopoetik anormalliklerin göstergesi olabilir. Aslında, melanotik toplu fenotipik hematopoez 11-14 katılan genler ve yolları belirlemek için kullanılmıştır.
larva hematopoetik sistem en yaygın Bugüne kadar incelenen olduğunu. Bu hemolimf dolaşan hemocytes oluşur, sapsız hemocyte manikür altında desenli kümeleri ve hemocytes lenf bezinde ikamet eden. Lenf bezi dorsal kabına bağlanmış ikili lobların dizisidir. Lenf bezinin her birincil lob üç ana bölgeye ayrılmıştır. en dış bölge kortikal bölge olarak bilinir ve hemocytes olgunlaştırma içerir. iç bölge medüller bölgesi olarak adlandırılan ve sakin hemosit öncülerinin oluşur. Üçüncü bölge, arka sinyal merkezi, kök hücre benzeri niş olarak hareket lenf bezi dibinde küçük bir hücre grubudur. Erken çalışma Notch 15-18 için kritik işlevleri kurulmuş 19,20, JAK-STAT 18 ve Kanatsız 21 etkinlik larva lenf bezi gelişimini düzenler. Daha yeni çalışmalar BMP 22, FGF-Ras 23 ve Hippo 24,25 sinyal de larva lenf bezinde işlev olduğunu göstermiştir.
Burada belirtilen dört larva hematopoietik deneyleri 1) birim hacmi başına hücre sayısı olarak tanımlanır sirkülasyon hemocyte konsantrasyonunu ölçme 2) izole edilmesi ve sabitleme 3) in vivo olarak, kristal hücreleri görselleştirme, immünohistokimya için hemocytes sirkülasyon ve 4), sabitleme kesme ve montaj tarif lenf immünohistokimya için rakorlar. Bu deneyler, fonksiyonları ve larva hematopoietik sistem yolaklarını düzenlemeleri değerlendirmek için hematopoietik çıktılan olarak da kullanılabilir. Bu yöntemler, bu alanda daha önce kullanılmış olsa da, bu deneylerin görsel belgeler sadece son 8,26-30 başlamıştır. Burada belirtilen çeşitli yayınlar yardım vardırbenzer yöntemler ve hematopoietik işaretleri 26,31-33 tarif ful kaynaklar. Ayrıca, Trol ve Viking lenf bezi bazal membran kullanışlı göstergeleridir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sirkülasyon Hemocyte Konsantrasyon
- 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak.
- 1X fosfat tamponlu salin (PBS, Tablo 1) ile doldurulmuş bulaşık kuyu kesme larvaları toplamak.
- Her larva için, buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde PBS 1x 10 ul ve temiz bir diseksiyon pad üzerinde PBS 1x 10 ul yerleştirin. ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde diseksiyon yastık yerleştirin.
- bir doku üzerine yerleştirerek bireysel larva kurutun diseksiyon pad üzerinde bir PBS damla aktarmadan önce silin.
- forseps bir çift kullanarak, yavaşça açık gözyaşı ve dikkatle hemolimf serbest bırakmak için manikür ters çevirin.
NOT: kazımak veya bu potansiyel sesil hemocytes 29 serbest olabilir gibi manikür yumruk için özen gösterin. - bir pipet kullanılarak, kesme pedden hemolimf toplamak. co önlemekBöyle vücut yağ olarak larva enkaz llecting.
- Bir mikrosantrifüj tüp hemolimf ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
Not: bazı örnekleri bir kez toplanır ve bir saat kadar buz üzerinde muhafaza edilebilir. - İsteğe bağlı: boya ve ölü hücreleri hariç eşit parçaya hemolimf örneği ile Tripan mavisi karıştırın. Bu hücreler için toksik olduğundan, tripan mavi ilave 3 dakika içinde hücre sayımı.
- yukarı pipetleme ve aşağı hemositometre odasına 10 ul yüklemeden önce örnek karıştırın.
- otomatik bir hücre sayacı durumunda, hücre boyutu ve dairesellik için uygun parametreleri ayarlanır. Normal, yuvarlak hemocytes 34 tespit etmek için% 80 yuvarlaklığı - Örneğin, 2 um'den az hücre boyutu, 22 um maksimum hücre boyutuna ve 75 bir daireselliğe ayarlayın. farklı parametrelerle denemeler gibi lamellocytes gibi büyük ve iğ biçimli hemocytes tespit etmek. Alternatif olarak, el ile hemocytes saymak için bir hemasitometre kullanın.
2. Circulating Hemocyte İmmunohistokimya
- 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak.
- 6 veya 12 oyuklu bir plakanın her bir bir lamel yerleştirin.
Not: Kare lamelleri (22 mm), 6-yuvalı plakalar ve yuvarlak lamelleri (18 mm çapında) fit 12 oyuklu plakalar içinde uyum sağlar. - 1x PBS ile dolu çanak kuyuları diseksiyon larvaları toplayın.
- Her lamel merkezinde 5 ul 1x PBS yerleştirin.
- ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde plaka koyun.
- silme bir doku üzerinde bireysel larva kurutun ve daha sonra lamel PBS içinde yerleştirin.
- forseps bir çift kullanarak, yavaşça gözyaşı ve dikkatle manikür ters. larva karkas çıkarmadan önce, eşit hemolimf yaymak için kullanabilirsiniz.
NOT: kazımak veya bu potansiyel sesil hemocytes 29 serbest olabilir gibi manikür yumruk için özen gösterin. - Repealamel başına bir larva hemolimf toplama, tüm larvaları için t. Hemocytes 5 için lamelleri uymak için izin ver -. Oda sıcaklığı oda sıcaklığında 8 dakika fiksasyonu 30 dakika önce aşmayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika süre ile, her lamel% 7.5 formaldehid (Tablo 1) 5 ul ekleyerek hemocytes sabitleyin.
- Yıkama 1x PBS ile üç kez lamelleri. plaka İpucu ve her yıkamadan sonra PBS aspire. Bir sonraki adımda permeabilization solüsyonu akmasını önlemek için, lamelleri çevresinden aşırı PBS kaldırmak için aspiratör kullanın.
- Oda sıcaklığında 20 dakika süre ile, her lamel 100 ul permeabilizasyon çözeltisi (Tablo 1) ekleyin.
- İpucu ve yavaşça permeabilization çözüm aspire plaka dokunun.
- Sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi (Tablo 1), birincil antikor seyreltilir. 12 oyuklu plakalar içinde, en az 500 ul lamelleri primer antikor çözeltisi ekleyin.6-yuvalı plakalar içinde en az 1.5 ml ilave edilir. gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Primer antikor solüsyonu çıkarın ve bir orbital çalkalayıcıda, üç kez 10 dakika boyunca 1 x PBS ile lamelleri yıkayın.
- sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi ile sekonder antikoru ile seyreltilir. 12 oyuklu plakalar içinde lamelleri en az 500 ul ikincil antikor solüsyonu ekleyin. 6-delikli plakalardaki için en az 1.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle inkübe edin.
- ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Adım 2.10 üç kez gibi bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca 1 x PBS ile lamelleri yıkayın.
- Yıkama adımları sırasında, temiz bir cam mikroskop dokusu, ıslak mendilleri kullandıktan,% 70 etanol (Tablo 1) ile kayar. Her lamel için, cam slayt 5 ul montaj tampon (Tablo 1) yerleştirin.
NOT: İki lamelleri bir slayt sığacak. - Nihai PBS yıkama aspire.
- dikkatle plakalar ve yeri, inv gelen lamelleri çıkarmak için forseps kullanınMontaj tampon üstüne, erted.
Not: Mikroskop slaytları önce görüntüleme 4 ° C'de saklanabilir. Maksimum saklama süresi kullanılan antikorların istikrar bağlıdır. 6 ve 12-kuyucuklu plakalar çalkalanır ve yeniden kullanılabilir.
Vivo Kristal Hücre melanization 3.
- Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, dişiler 2-6 saat sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak.
- başlamadan önce, 60 ° C'de bir ısıtma kaynağı olarak ayarlayın.
Not: (25 ° C beklemeye elde edilmiş), 10 dakika boyunca 60 ° C'lik bir termal döngü cihazı programı en iyi şekilde çalışır, fakat ısı yine her bir larva üzerinde sürekli olarak ve eşit olarak dağıtılan bir su banyosu ya da başka bir ısı kaynağı sürece benzerlik yeterlidir. - 1x PBS (Tablo 1) ile dolu çanak kuyuları diseksiyon larvaları toplayın.
- Bir kerede bir, bir doku üzerinde bir larva bir PCR tüpün alt kısmında silin ve yer kurutun. Her larva yerleştirinAyrı bir PCR tüpü içinde. (Şekil 3A bakınız.)
- 15 dakika ve / veya yavaşça ısıtmadan önce tüpleri dokunarak - tutarlı sonuçlar için, 10, 4 ° C'de tüpler içinde larvaları soğutma PCR tüpleri altındaki bu larvalar konforu sağlamak için.
- termal döngü cihazı (veya su banyosu) PCR tüpleri yerleştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C'de ısıtın.
- Dikkatle taze 1x PBS ile dolu çanak kuyuları diseksiyon içine PCR tüpleri larvaları çıkarın.
- Bir doku üzerinde kuru larvaları silin ve bir stereomikroskop altında görüntüleme için düz bir yüzey üzerinde düzenleyin.
- körü körüne birden bireyler tarafından larva görüntüleri skor.
4. Larva Lenf Bezi İmmunohistokimya
NOT: Lenf bezi hafifçe sırt tarafında beynin altında bir larva ön ucundan yaklaşık üçte birinin uzunluğu yer almaktadır. (Şekil 3B oka bakın.) Lenf bezi dorsal damar kuşatan ve en kolay ağız hoo bağlı disseke edilirks veya beyne. Wild-tip, Üçüncü dönem lenf bezleri çok küçük yapılardır; Uzunluğu 200 mm - birincil lob yaklaşık 100 vardır. (Şekil 4A bakın.)
- 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak.
- Lenf bezi diseksiyonu
- Her bir deney koşulu için, 24-çukurlu plakanın bir oyuğuna PBS 1X 1 ml (Tablo 1) ekleyin.
- Her bir tek kullanımlık bir aktarım pipeti kullanarak,% 0.1 PBST (Tablo 1) 1 damla ekleyin.
Not: Deterjan, örneğin Tween 20 gibi doku kuyunun dibine çöker sağlayan yüzey gerilimini düşürmek için ilave edilir. - Buz üzerinde düz plaka koyun.
- 1x PBS ile dolu çanak kuyuları diseksiyon larvaları toplayın.
- ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde temiz bir diseksiyon yastık yerleştirin. smal yerleştirmek için atılan bir transfer pipetlemeyin kullanınl yastığı% 0.01 PBST (Tablo 1) düşer. diseksiyon için bir PBST damla bir larva transferi.
- arka ucundan biri yaklaşık forseps çifti bir çeyrek uzunluk, dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde larva tutun.
- manikür hemen larva tutan forseps ön kapmak için forseps başka bir çift kullanın. ağız kanca maruz kadar hafifçe ön sonuna doğru manikür çekin.
NOT: Amaç herhangi bir iç yapılarını bozmadan manikür soymak etmektir. - manikür bırakın ve iki larva kesmek için her iki forseps kullanabilir. PBST açılan arka ucunu çıkarın.
NOT: kütikül ağız kanca tüm yol soymak etmezse, iki larva kesti ve arka ucunu kaldırır. manikür kenarına tutun ve delikten ağız kanca itmek için forseps diğer çifti kullanmak için forseps bir çift kullanın. Bu manikür ters ve ağız kancalar gösterecektir. Bu altern olarak kullanılabiliryanı sıra diseksiyon yöntemi yedik. - istikrar için kütikül (ya ventral manikür, dorsal manikür kanadı, veya her ikisi) aşağı pin forseps bir çift kullanın.
- maruz ağız kanca kapmak ve onları hafifçe çekin forseps başka bir çift kullanın.
Not: Bu iç yapılardan manikür ayıracaktır. İdeal olarak, göz / anten hayali diskler, beyin, halka bezi ve dorsal damar yan lenf bezi ağız kanca takılı kalır. - Hala ağız kanca tutarken dikkatli böyle tükürük bezleri, yağ vücut ve bağırsak gibi istenmeyen yapıları kaldırmak.
NOT: beyin ağız kanca ayrılırsa, lenf bezi hala takılı ve beyin ile tahsil edilebilir. Bu durumda, ventral sinir kablosu yerine ağız kancaları tutun. - Bir kolu olarak ağız kanca veya ventral sinir kablosunun kullanılması. Buz üzerinde kuyuya lenf bezi içeren disseke kompleksi transferi 30 dakika aşmayıntespitten önce.
- Sabitleme ve immünhistokimya
- stereomikroskop bazında 24 oyuklu plaka koyun.
- dikkatle Kuyudan PBST kaldırmak için bir P200 pipet kullanın.
NOT: Boş, komşu kuyu geçici atık yatırmak için faydalıdır. - Yavaşça kuyunun aşağı tarafı 200 ul% 3.7 formaldehit (Tablo 1) ekleyin ve disseke dokuların tamamen sular altında olduğundan emin olmak için plakayı girdap.
- 30 dakika için buza geri plaka dönün. Lenf bezleri floresan proteini (ler) ini ifade ederse, photobleaching önlemek için kapalı plaka tutun.
- dikkatlice fiksatif kaldırmak için bir P200 pipet kullanın.
- oyuğuna 200 ul 1 x PBS eklenerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka yerleştirerek yıkayın. dikkatlice PBS kaldırmak için bir P200 pipet kullanın.
NOT: Tüm deney koşulları d olan için sabit lenf bezleri lenf bezlerinde kadar PBS içinde buz üzerinde bırakılabilirissected ve sabit. - Yıkama iki kez daha adımları tekrarlayın.
- Kuyuya 200 ul permeabilizasyon çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka ayarlayın.
NOT: 45 dk lenf bezi permeabilization için "altın standart" olduğunu ancak yazarlar sadece 20 dakika sonra başarı var. - P200 pipet ile çözüm çıkarın.
- Sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi (Tablo 1), birincil antikor seyreltilir. kuyuya 300 ul birincil antikor çözüm ekleyin ve disseke dokuların tamamen sular altında olduğundan emin olun. gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- birinci antikorları ayıklamak için P200 pipet kullanın.
- oyuğuna 200 ul 1 x PBS eklenerek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka yerleştirerek yıkayın. dikkatlice PBS kaldırmak için bir P200 pipet kullanın.
- Yıkama iki kez daha adımları tekrarlayın.
- İkinci bir seyreltiksağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi ile ntibody. kuyuya 300 ul ikincil antikor çözüm ekleyin ve disseke dokuların tamamen sular altında olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin.
- ikinci antikorları ayıklamak ve Adımlar 4.3.12 ve 4.3.13 de tarif edildiği gibi yıkama P200 pipet kullanın. Nihai yıkamadan sonra PBS çıkarmayın.
- bezi montaj Lenf
- Temiz cam mikroskop% 70 etanol (Tablo 1) ve doku ıslak mendilleri kullandıktan kayar.
- Her bir deney koşulu için, cam slayt tamponu (Tablo 1) montajı bir damla yerleştirin.
NOT: İki koşullar bir slayt sığacak. tampon hacmi montaj lenf bezlerinde sayısı monte edilecek bağlıdır. 20 lenf bezleri, 10, 1 | il - - 12, 5 veya daha az, 0.5 ul, yaklaşık 18 2 ul kullanın. - ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde bir mikroskop lamı yerleştirin.
- Bir defada en fazla iki koşullar için, bir sap olarak ağız kanca veya ventral sinir kablosu kullanarak, forseps ile montaj tamponu iyi lenf bezlerinin hepsi aktarın.
- Uzay işlemi montaj tampon yayılan dairesel veya dikdörtgen şeklinde eşit parçalara dokular.
- parçalara dokuların her biri için, tek tek, dorsal teknenin altında forseps bir maşa slayt ve yavaşça monte tampon çevresine doğru çekilir.
NOT: Bu lenf disseke dokuların geri kalanından bezi ve cam üzerine lenf bezi dümdüz çekecektir. - bir forseps maşa ve bir testere hareketi kullanarak, lenf bezi ve beyin arasındaki dorsal gemi kesti.
- tampon dış kenarında, lenf bezi karşı tarafına parçalara dokuların geri kalan hareket ettirin.
NOT: İstenmeyen disseke dokular sonunda lenf bezlerinde etrafında bir çevre oluşturmak ve yüklenebileceğini üzerine bir destek olarak görev yapacaklamel duracaktır h. - lenf bezlerinde her merkeze yerleştirmek için istenmeyen Diseke dokuların bir saklı kalmak üzere, disseke dokulardan ayrılır kadar tekrarlayın.
- iki parmak arasında bir lamel atın. lamel toz ve parmak izi olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, bir doku bez kullanın ve% 70 etanol lamel temizlemek için.
- lamel kenarı cam slayt kenarına paralel olmasını sağlamak, dikkatlice montaj tampon üzerinde lamel indirin.
Not: Mikroskop slaytları önce görüntüleme 4 ° C'de saklanabilir. Maksimum saklama süresi kullanılan antikorların istikrar bağlıdır. 24 oyuklu plakalar, durulanmış ve yeniden kullanılabilir.
5. Görüntüleme
- Görüntü hemocytes sabit ve üreticinin kullanma kılavuzuna göre 20X veya daha yüksek büyütmede uygun bir standart floresan veya konfokal mikroskop lenf bezleri monte edilmiş. Bir stand görüntü bütün larvalarıÜreticinin kullanım kılavuzuna göre 2X büyütme ard stereomikroskopta.
- istenirse, Dekonvolüsyonun için yazılım sağlayıcının talimatları izleyin.
| Çözüm | kompozisyon | Depolama | Yorumlar |
| 1X PBS | 200 mg / L potasyum klorür | oda sıcaklığı | |
| 200 mg / L potasyum fosfat monobazik | |||
| 8.000 mg / L sodyum klorür | |||
| 1.150 mg / L sodyum fosfat dibazik | |||
| dH 2 O | |||
| Sabitleme | % 3.7 ya da% 7.5 formaldehid, PBS içinde 1 x | oda sıcaklığında karanlıkta | Formaldehit toksiktir. |
| Permeabilizasyon çözelti / antikor inceltici | % 0.4 Triton | 4 ° C | standart bir formül% 0,4 Triton kullanır, ancak yazarlar başarı ile Tween 20% 0.1 kullanın. sağlayıcıların tavsiye konsantrasyonlara göre primer ve sekonder antikorlar sulandırmak için kullanın. |
| % 5 bovin serum albümini, normal keçi serumu veya normal eşek serumu | |||
| 1X PBS | |||
| % 70 etanol | dH2O% 70 200 derece etanol | oda sıcaklığı | |
| montaj tampon | % 0.5 N-propil galat | Karanlıkta 4 ° C | N-propil galat zararlıdır. DAPI bir mutajen olduğunu. |
| % 80 gliserol | |||
| İsteğe bağlı: 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) | |||
| 1X PBS | |||
| % 0.1 PBST | 1x PBS içinde% 0.1 Tween 20 | oda sıcaklığı | |
| % 0.01 PBST | % 0.1 PBST 01:10 seyreltme | oda sıcaklığı |
Bu Protokolün kullanılan Tablo 1. Çözümler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hemosit dolaşımsal konsantrasyonu
Hemocyte numaraları larva gelişimi 35 boyunca artar. Bu yöntem hemocyte numaraları ve konsantrasyon farklılıkları algılar olduğunu göstermek için, ne olursa olsun biyolojik nedeni, biz gecikmeli ve gecikmesiz larvaların hemocyte konsantrasyonlarını ölçtük. Ptth üreten nöronların (ptth> gaddar) genetik ablasyonu prothoracicotropic hormon (ptth) Zarar larva gelişimi 36 bir gecikme üretir. 25 ° C yetiştirilen en az 8 bağımsız bir larva için Protokol 1 'de tarif edildiği gibi, her genotip için hemocyte konsantrasyonları ölçüldü. 2 saat Yumurta toplama sonrası 120 saatte, gecikmiş bir larva için ortalama hemocyte konsantrasyonu (ptth> sert) kontrol larva (ptth) ortalama hemocyte konsantrasyonundan daha azdır. Sadece 9 gün sonra o denetimleri gecikmeli larva yaklaşımı başına ortalama hemocyte konsantrasyonu (yok
Otomatik bir hücre sayacı alınan görüntüleri, temiz, arzu hemolimf örnek ve tutarlı ölçümü (Şekil 1C) yol açabilir artıkları içeren bir örnek göstermektedir. Minimum ve maksimum hücre boyutları sırasıyla 2 um ve 22 um ayarlanmıştır. Dairesellik% 75-80 yuvarlaklığı ayarlandı. Bu parametreler, kılavuz olarak kullanılmıştır ve tecrübi olarak optimize edilmelidir.
Hemocyte İmünohistokimya Sirkülasyon
Protokol 2 de tarif edildiği gibi, yeşil floresan protein (GFP) dolaşımda hemocytes plasmatocyte özgü antikorların (P1a ve P1B István Andó) 31 içeren bir karışım ile toplandı, sabit ve kuluçkalanmıştır(Şekil 2). Görüntü standart bir floresan mikroskop alındı ve değiştirilmemiş ve kısıtlı tekrarlı Dekonvolüsyonun sonra gösterilir. Bu durumda, Dekonvolüsyonun ölçüde görüntü kalitesini artırmak vermedi.
Vivo Kristal Hücre melanization içinde
Protokol 3 (Şekil 3A) de tarif edildiği gibi larva önce ısı kaynaklı bir kristal hücresi melanizm PCR tüplerine altına yerleştirildi. Kırmızı oklar larva çok alttan ve eşit olmayan bir ısıtılabilir olabilir tüpleri göstermektedir. Bireysel larva genelinde düzensiz ısı dağılımı larva içinde kristal hücrelerinin melanization değişkenliği artırabilir.
Standart bir stereomikroskopta üzerine görüntülendi bir yabani tip larva ısı maruz kaldıktan sonra sesil kümeler halinde melanized kristal hücreler tipik desen (gösterirŞekil 3B). Lenf bezi Melanized kristal hücreleri bazen görülür.
Larva Lenf Bezi İmmunohistokimya
Standart bir floresan mikroskobu tarafından çekilmiş bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntü dorsal kabı (Şekil 4A) çevreleyen birinci ve ikinci lenf bezi loblar gösteren protokol 4'te tarif edildiği gibi üçüncü instar larva lenf bezleri, kesilmiş, sabitlenmiş ve monte edilmiştir.
medüller bölgesi ve arka sinyal merkezi genetik olarak geliştirilmiş, mavi floresan proteinin (EBFP2) ve GFP ile işaretlenmiş olan bir lenf bezi, sırasıyla Çentik hücre içi alanına karşı bir antikor (C17.9C6, Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası) halinde ile boyanmıştır Protokolde tanımlanan 4. Z-yığını görüntüler, standart bir floresan mikroskop alınmıştır. Tek bir maksimum int ensity projeksiyon görüntü değişmeden ve kısıtlı iteratif deconvolution (Şekil 4B) sonra görünür. Bu durumda, dekonvolüsyon ölçüde görüntü kalitesini ve detay geliştirilmiş.
Şekil Hemosit Konsantrasyon. A) standart Drosophila ortamının bir kısmı Sirkülasyon 1. çıkarıldı (sağda) 2 hr yumurta toplama dönemi. B) gelişimsel gecikmeli larva başına ortalama hemocyte konsantrasyonu)> gaddar (ptth daha düşük olduğu sırasında yumurtlama teşvik etmek 120 saat yumurtlama (AEL) sonra kontrol larvaları (ptth) başına ortalama hemocyte konsantrasyonu. gecikmeli larva başına ortalama hemocyte konsantrasyonu AEL kontrol seviyesi 9 gün yaklaştı. Hata çubukları sol (olmadan) ve (sağda) enkaz ile ± sem C) Hemolimf örnekleri temsil etmektedir. Ölçek çubukları 0.1 mm temsil etmektedir.= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54544/54544fig1large.jpg" target = "_ blank" href> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hemocyte İmmünohistokimya. Hemocytes genetik ifade GFP Sirkülasyon Şekil 2. toplanmış ve bir lamel tespit edildi. Bir plasmatocyte özgü antikor leke plazmatositler (kırmızı) için kullanılmıştır. DAPI boyama mavi gösterilir. Değiştirilmemiş görüntü bir floresan mikroskobu (sol) ile çekilen. deconvolution (sağ) sonra aynı görüntü. Ölçek çubuklar 50 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
In Vivo Şekil 3. A) Larva ısıtmadan önce PCR tüplerine tek tek yerleştirildi. . Kırmızı oklar tüplerin alt B) ısıttıktan sonra tipik bir kristal hücre melanizm desen, bazen ok lenf bezi (ortaya altında değildir larvaları gösterir; dorsal yüzü, ön) Sol olduğunu göstermiştir. Ölçek çubuğu 1 mm temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Larva Lenf Bezi İmmünohistokimya. A) dorsal gemi (dv), birincil lob (1 °) ve ikincil loblar (2 °) gösteren bir Üçüncü dönem larva lenf bezinin bir DIC görüntüsü. Ölçek çubuğu 100 mikron. B) bir temsilci Üçüncü dönem larva lenf bezi f temsilrom genetik arka sinyal merkezinde medüller bölgede ve GFP EBFP2 ifade eden bir larva. Lenf bezi Çentik hücre içi etki alanı (kırmızı) karşı bir antikor ile boyandı. Değiştirilmemiş görüntü bir floresan mikroskop (üstte) ile çekilen. Dekonvolüsyonun (altta) sonra aynı görüntü. Ölçek çubuklar 20 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetik ya da çevresel değişiklik üzerine, burada açıklanan dört yöntem gibi sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hematopoez sırasında farklı süreçleri analiz etmek ayrı ayrı ya da birlikte kullanılabilir Drosophila hematopoez dinamik bir süreçtir.; hayvan başına hemocytes sayısı 35 artar ve lenf bezinin yapısı ve gen ifadesi gelişimi sırasında 32 değiştirir. Bu analizler gerçekleştirmeden önce, bu nedenle, o zaman sabit bir miktar için yumurtalarını bırakmak için ve istenen larva gelişim aşamasını onaylamak için kadın izin vererek yumurta koleksiyonları kısıtlamak için kritik öneme sahiptir. kısa yumurta koleksiyonları (az 6 saat) ya da kadın sağlıksız ya da kıt olduğu durumlar için için, yumurtlama gıda yarıklar oluşturularak teşvik edilebilir. Bu, bir etanol-temizlenmiş spatula ile gıda kısmının çıkarılması ile gerçekleştirilebilir. fazla sıvı gıda birikir, kullanım dokusu kadar emmek için mendilsıvı. (Şekil 1A bakınız.)
Yalnız, burada açıklanan yöntemleri sınırlamaları vardır. Örneğin, dolaşımdaki hemocyte konsantrasyonunun ölçülmesi hemocyte hayatta kalma veya proliferasyon değişiklikleri yakalar ama hemocyte soy dağıtımı veya genetik veya çevresel değişime sonucu olabilecek soy bozulması konusunda hiçbir bilgi sağlar. Tersine, dolaşımdaki hemocytes immünhistokimya hemolimf belirli hemocyte soy ancak, mutlak, göreli olmayan sayılar değişiklikleri ortaya koymaktadır. In vivo olarak, hücre kristal melanizm kristal hücre dağılımı değişkendir ve sesil hemocytes 8,10 dinamik olarak ölçmek için zordur. Aksine, birden fazla kişi körü körüne kristal hücre melanization puan gerekir. Son olarak, gözlemler mutlaka diğer bölümlerinde de geçerli olmayabilir tek hemocyte bölmesinde yaptı.
Birlikte kullanılan bu deneyler, gen ayırt uygulanabilirgen ifadesini veya farklılaşmasını düzenleyen olanlardan çoğalması ya da hayatta kalma düzenleyen tik değişiklikler. Örneğin, bir genetik değişim hemocyte konsantrasyonu artar, ancak hemosit soyların nispi oranları, aynı kalacak şekilde hemocytes proliferasyonunu arttırır. Alternatif olarak, genetik değişim, genel hemocyte konsantrasyonu üzerinde hiçbir etkisi ile belirli soy içine hemocyte farklılaşma değişiklikleri teşvik edebilir. Kristal hücre popülasyonu, in vivo melanizm yöntemi kullanılarak genetik ekranlar ve genetik etkileşim çalışmaları kolaylaştırmak hızlı ve kolay sorgulanabilir. Bu yöntem, prophenoloxidase 1 (PPO1 olarak da adlandırılan, siyah hücreleri, Be) kullanan genetik çalışmalar, mutant alleli veya kristal hücreye özel antikorları kullanan immünohistokimya tahlilleri ile teyit bilgisi olarak kullanılabilir. larva lenf bezi hematopoetik hücresel süreçleri ile ilgili benzer soruları için kullanılabilir. Sayısızsinyal yolları oluşturulması ve lenf bezi ve ana bölgelerini korumak katılmaktadırlar. Her bölge larva hematopoez ayrı gen ifadesi ve işlevi vardır. Ayrıca, lenf bezi kullanan lenf bezi bölgeleri veya lenf bezi hemocytes içinde özerk ve özerk olmayan işlevleri ortaya çıkarabilir.
Drosophila hematopoezisi çalışmak için ilgili yöntemleri yalnızca son zamanlarda 26,27 kapsamlı metin tabanlı kaynaklarda derlenmiştir. alanına vazgeçilmez olsa da, bu kaynakların kapsamı sınırlıdır. Hemocyte konsantrasyonunun ölçülmesi için yöntemler, örneğin, dahil edilmemiştir. Yazılı yöntemler, özellikle de açıklayan diseksiyon teknikleri, hızlı usta için zor olabilir. Ek katkıları yöntemleri ile yardımcı olmak için görsel kaynaklar sağlayarak, yapılmış, ama yine de sayısı ve kapsamı 28,29 sınırlı kalmıştır. Ayrıca kapsamlı değildir, kaynakların avai eklemek iken yöntemleri, burada açıklananDrosophila hematopoez çalışmaya yardımcı olmak için lable.
Biz değişiklik ve mevcut protokollere alternatifler sunuyoruz. Örneğin, artan hız, kolaylık ve nesnellik de dahil olmak üzere otomatik bir hücre sayacı yerine manuel hemasitometre ile hemocyte konsantrasyonunun ölçülmesi için çeşitli avantajları vardır. Bizim tecrübelerimize göre, kristal hücre görünüm için larva ısıtmak için bir su banyosu kullanılarak larvaların onlar kaldırdı edildiği şişeler içinde ısıtılır, özellikle yaygın değişken sonuçlar sonuçlandı. Bireysel PCR tüpleri Isıtma larva az değişken ve daha tekrarlanabilir sonuçlar vermiştir. Lenf bezi diseksiyonu yöntemi daha önce yazılı bir protokole 26 özetlenen olsa, burada açıklanan mevcut görsel referanslar 28 bir alternatif sağlar. konfokal mikroskop erişim sınırlıdır Son olarak, eğer biz standart floresan görüntülerin Dekonvolüsyonun konfokal görüntüler için uygun bir yerine olabileceğini düşündürmektedir. Deconvolutialgoritmalara kaldırmak veya hafif geleneksel floresan mikroskobu ile yakalanan out-of-focus yeniden atama, çözünürlük iyileştirme ve konfokal mikroskopi ile out-of-odak ışık ortadan kaldırılması prensibine benzer kontrast ve 2-boyutlu ve 3- uygulanabilir ya boyutlu (Z-yığın) görüntüler. Bazı uygulamalar için, burada gösterildiği gibi, Dekonvolüsyonun dramatik geleneksel floresan mikroskop ile çekilen görüntüleri artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip veya mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18 mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
References
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M.
- Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
- Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
- Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
- Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
- Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
- Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
- Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
- Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
- Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
- Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
- Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
- Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
- Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
- Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
- Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
- Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
- Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M.
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
- Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).
