Summary
Vi beskriver en standard antistof farvningsprotokollen til anvendelse i mikroskopi for at bestemme membranen ekspression og lokalisering af gangliosider i hvilende og aktiverede humane naive CD4 + T-celler. Også beskrevet er real-time PCR eksperimenter med <40.000 celler, som ikke kræver yderligere lave input RNA kits.
Abstract
De heri beskrevne for aktivering af naive CD4 + -T-celler metoder i suspension og deres tilslutning i dækglas til konfokal mikroskopi analyse tillader rumlige lokalisering og visualisering af gangliosider er involveret i CD4 + T-celleaktivering, at komplement ekspressionsprofil eksperimenter såsom flowcytometri, western blotting eller real-time PCR. Kvantificeringen af gangliosid ekspression gennem flowcytometri og deres cellulære lokalisering gennem mikroskopi kan opnås ved anvendelse af anti-gangliosid-antistoffer med høj affinitet og specificitet. Ikke desto mindre en passende håndtering af celler i suspension involverer behandling af dyrkningsplader at fremme den nødvendige vedhæftning kræves til fluorescens eller konfokal erhvervelse mikroskopi. I dette arbejde beskriver vi en protokol til bestemmelse af GD3 og GD2 gangliosid udtryk og colokalisering med TCR under naive CD4 + T-celle-aktivering. Også, real-time PCR-forsøg under anvendelse af <40.000 celler er beskrevet til bestemmelse af GD3 og GM2 / GD2 synthase gener, hvilket viser, at genet analyse eksperimenter kan udføres med et lavt antal celler og uden behov for yderligere lavinput RNA kits.
Introduction
CD4 + T-celler dirigerer immunresponsen gennem deres effektorfunktioner efter aktivering af antigen-præsenterende celler 1. Undersøgelsen af de cellulære mekanismer, der er moduleret under aktivering tillader indsigt i en grundlæggende proces med immunfunktion. Imidlertid kan studiet af naive CD4 + T-celler være kompliceret, fordi de repræsenterer en meget lille population af celler i blodet periferi 2.
Gennem fluorescens mikroskopi flere rapporter har undersøgt lokaliseringen af forskellige molekyler, der er involveret i CD4 + T-celleaktivering, hovedsagelig proteiner associeret til plasmamembranen 3. Gangliosiderne er sialinsyre indeholdende glycosphingolipider og selv om de er blevet grundigt undersøgt i nerveceller, hvor de er rigelige, andre celler såsom immunceller også udtrykker gangliosider med biologisk relevante funktioner 4,5. Vi har tidligere rapporteret that under aktivering af humane naive CD4 + -T-celler der er en opregulering af α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3-syntase) og GM2 / GD2 syntase, der inducerer betydelig overflade neoexpression af GD2 og opregulering af GD3-gangliosid 6. Yderligere undersøgelse af GD3, GD2 og andre gangliosider i immunceller er nødvendigt at supplere en protein-baserede delvis visning af immunforsvar.
Almindeligvis er studiet af gangliosid ekspression baseret på teknikker som tyndtlagskromatografi (TLC) 7, men denne teknik tillader ikke den rumlige lokalisering af gangliosider på plasmamembranen eller i subcellulære afsnit, begrænser den biologiske analyse.
I dette arbejde, beskriver vi en protokol for antistof-medieret identifikation og lokalisering af GD3 og GD2 gangliosiderne i humane naive CD4 + T-celler og PBMC'er efter anti-CD3 / anti-CD28-aktivering. Med denne protokol det jegs også muligt at analysere genet og molekylære udtryk for gangliosider i et lavt antal celler i suspension, med køb af høj kvalitet billeder 6, i betragtning af den lille størrelse af lymfocytter (9 um).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifert blod fra raske mandlige donorer blev opnået med informeret samtykke og godkendelse af bioetik Komité Centro de Investigación en Dinamica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
1. Isolering og aktivering af human naive CD4 + -T-celler
- Collect 2 ml perifert blod stammer fra sunde humane donorer af informerede samtykke og fortyndes med 2 ml sterilt PBS-EDTA (1x phosphatpufret saltvand (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Tilsæt fortyndede blod langsomt ovenpå 3 ml saccharoseopløsning med 1,077 densitet som tidligere beskrevet 8.
Bemærk: Differential migration under centrifugering skyldes forskelle i densitet vil forårsage erythrocytter sedimentere fuldstændigt og et lag af mindre tætte mononukleære celler vil danne ovenfor. 2 ml perifert blod vil gøre ca. 0,5 x 10 6 naive CD4 + -T-celler efter purificatipå trin. - Centrifuger 30 min ved 250 xg ved 21 ° C (brug rotor i rundbundede rør med fast vinkel på 30 mm) med ingen pause til at generere gradient af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). Efter centrifugering kan PBMC'erne tydeligt ses som en hvid ring. Indsamle PBMC'erne med en pipette og overføres til sterile rør til vask.
- Efter tre vaske med PBS-EDTA-opløsning ved 250 xg i 10 minutter fortsætte til oprensning af naive CD4 + T-celler. Sorteringsmetoder eller flere typer af rensning kits er tilgængelige til dette formål. Fortrinsvis bruge> 1 x 10 7 PBMC'er til rensning.
- Oprens naive CD4 + -T-celler ved negativ selektion med magnetiske perler. Udfør negativ selektion med anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, og CD235a (glycophorin A) antistoffer. Vurdere den procentdel af renhed ved at bestemme CD4 + CD45RA + celler gennem flav cytometri.
Bemærk: Eventuelt fortsætte til inkubering af PBMC'er natten over ved 37 ° C og 5% CO2 med en densitet på 1 x 10 6 celler / ml i 10 ml suppleret medium for at fremme monocytadhærens og fortsætte med naive CD4 + T-celle oprensning. Den effektiv inddrivelse af naive CD4 + T-celler fra perifert blod høj grad afhænger af renseanlægget.
- Oprens naive CD4 + -T-celler ved negativ selektion med magnetiske perler. Udfør negativ selektion med anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, og CD235a (glycophorin A) antistoffer. Vurdere den procentdel af renhed ved at bestemme CD4 + CD45RA + celler gennem flav cytometri.
- Forbered 24 brønde cellekulturplader ved tilsætning 250 pi per brønd af PBS med 5 ug / ml anti-CD3-monoklonalt antistof og inkuberes i mindst 2 timer ved 37 ° C.
Bemærk: kan bruges Plader med 96 brønde, når der anvendes et mindre antal fra naive CD4 + -T-celler (fx 2 x10 4 -1 x 10 5). - Fjern anti CD3-antistof fortynding fra 24 brønd eller 96-brønds plader og vaske pladerne to gange under anvendelse af sterilt 1x PBS.
- Fortynd de naive CD4 + -T-celler med> 95% af renhed (CD4 +CD45RA +) til en tæthed på 1 x 10 6 celler / ml i avancerede RPMI 1640-medium suppleret med 3% føtalt bovint serum (eller RPMI suppleret med 10% serum), 2 mM glutamin og antibiotika (1 U / ml penicillin, 1 ug / ml streptomycin).
Bemærk: Hvis gangliosid lokalisering kræves PBMC'er, følge den samme protokol til fortynding og stimulering som beskrevet nedenfor. - Der tilsættes 500 pi af cellen fortynding til anti CD3-coatede brønde og til ikke-coatede brønde (kontrol celler) i 24 brønds plade. Alternativt tilsættes 100 pi af cellen overføres til brøndene i 96-brønds pladen.
- Fuldføre stimulationsforholdene af naive CD4 + T-celler i anti CD3 coatede brønde ved tilsætning af 1 ug / ml anti CD28-antistof.
- Hold hvilende CD4 + T-celler som kontrol i de ikke-coatede brønde uden tilsætning af anti CD28 antistoffer. Inkubér hvilende og aktiverede CD4 + T-celle i 0 til 72 timer under standardbetingelser på 37 °C og 5% CO2.
- For at verificere en passende aktivering evaluere ved flowcytometri ekspressionen af CD69 tidlig aktivering markør (16 timer efter aktivering) eller CD25 sen aktivering markør (48 timer efter aktivering) i hvilende og aktiverede naive CD4 + T-celler inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2 i fravær eller nærvær af anti CD3 / CD28-antistoffer 9,10.
2. adhærens af hvilende og aktiverede naive CD4 + -T-celler
- Sterilisere 12 mm runde dækglas i autoklave og UV lys eksponering i mindst 15 min.
- Placer dækglas i sterile 24 brønds cellekulturplader.
Note: For kulturer med mindre end 1 x 10 5 celler foretrækkes det at anvende slide kamre med tilpassede små brønde for at forhindre spredning af celler i dækglasset. - Coat dækglas (eller slide kammer) med 200 pi af poly-L-lysin (MW 150-300 kDa) 0,1% (w / v) opløsning og inkuberes i 5 minutter ved room temperatur (RT), fjerne og tørre i mindst 1 time ved stuetemperatur.
- Blandes omhyggeligt og indsamle de hvilende og aktiverede naive CD4 + T-celler fra 24-brønds plader. Tæl celler og justeres eventuelt med frisk suppleret medium til at overføre 1 x 10 5 celler til poly-L-lysin coatede dækglas. Inkubér cellerne i mindst 6 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Indsamling og Fiksering af hvilende og aktiverede Naïve CD4 + T-celler
- Fjern forsigtigt medium fra dyrkede hvilende og aktiverede naive CD4 + T-celler.
- Der tilsættes 500 pi RT sterilt PBS langsomt.
Bemærk: Omhyggelig tilføjelse og fjernelse af løsninger fra brønde forhindrer frigørelse af celler fra dækglasset. - Kassér PBS og tilføje en anden 500 pi PBS til grundigt at fjerne kulturmedier.
- Fikseres cellerne ved tilsætning af 500 pi filtreret 4% paraformaldehyd (filtration fjerner mikropartikler, som kan interferere med mikroskopi analyse) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (foretrukket) eller natten over ved 4 ° C.
Forsigtig: Paraformaldehyd er et giftigt og flygtig forbindelse. Det er kendt for at være kræftfremkaldende hos mennesker. Brug forsigtigt med en passende sikkerhed protokol. - Fjern fiksativ og vask mindst to gange med PBS ved stuetemperatur.
- Fortsæt til det næste trin eller opretholde pladebrøndene med 500 pi PBS ved 4 ° C i adskillige dage indtil farvning.
Bemærk: Sterilitet under denne proces hjælper med at undgå mikroorganisme vækst.
4. Farvning, Montering og visualisering af konfokalmikroskopi
- Fjern PBS fra brøndene. Der tilsættes 500 pi kold blokerende buffer (1x PBS, 0,5% standardkvalitet bovint serumalbumin, 1% føtalt bovint serum, pH 7,4). Der inkuberes i 20 minutter på is.
- Fjern blokering buffer omhyggeligt og tilsæt de primære antistoffer (anti gangliosider GD3 klon R24, GD2 klon 14G2a),PE-konjugeret anti CD25 og APC-konjugeret anti-TCR og isotyper kontroller fortyndet i blokeringsbuffer til 2,5 ug / ml.
- Inkuber 2 timer på is eller natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Langsom orbital omrøring foretrækkes. - Fjern antistoffet omhyggeligt og tilsæt langsomt 500 pi PBS. Gentag to gange.
- Tilføj de sekundære antistoffer (FITC konjugeret anti IgG3 for R24 anti GD3, Alexa Fluor 488-konjugeret eller Alexa Fluor 647-konjugeret anti IgG2a for 14G2a anti GD2) fortyndet i blokeringsbuffer til 0,1 ug / ml.
- Der inkuberes i 1 time på is i mørke uden omrystning.
- Vask tre gange i PBS, som beskrevet i 4.4). Hold brøndene med nok PBS for at undgå dehydrering af prøver.
- Tilføj Hoechst 333.258 plet fortyndet i PBS til 0,1 ug / ml.
- Inkuber 15 minutter ved stuetemperatur, og fjern. Vask tre gange i PBS.
- Placer dias på et stykke køkkenrulle og tilsættes 20 ul monteringsløsning (50% glycerol i PBS) eller kommerciel monteringsløsnings for at undgå fading og slukke fra prøver.
- afhente forsigtigt dækglasset med fine pincet og placere den på den monteringsløsning. Sikre, at den side af dækglasset, hvor cellerne er bundet, er i kontakt med opløsningen. Forsegl dækglas med neglelak og analysere ved hjælp af fluorescens eller konfokal mikroskopi.
5. Isolering af RNA
- Forbered anti CD3-antistof (5 ug / ml) overtrukket 96-brønds plader. Inkuber 4 x 10 4 naive CD4 + T-celler / brønd i 100 pi suppleret dyrkningsmedium med anti CD28-antistof (1 pg / ml) for at fuldføre stimulus. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 0 til 72 timer.
- Efter forskellige post-aktiveringstider placere cellerne i et mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 500 pi PBS og centrifugeres ved 250 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml Trizol reagens.
- Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur og holde prøven ved -8076; C i mindst 24 timer. Fortsæt med RNA isolation når det er nødvendigt.
Bemærk: forlader prøven ved -80 ° C i mindst 24 timer forbedrer RNA udbytte. Også brug af hånd handsker er vigtigt at undgå RNA-nedbrydning af RNaser. - Optø prøven ved inkubation ved 37 ° C i 2 min i et vandbad.
- Tilføj 200 pi chloroform og rystes kraftigt med hånden i 30 sek (for at undgå aggressiv blanding af RNA ved vortexbehandling). Inkuber 5 min ved stuetemperatur.
- Centrifuger 15 min ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Inddrive den vandige fase overføres til et nyt mikrocentrifugerør.
- Tilføj 500 pi isopropanol og vend røret tre gange.
- Inkuber 10 min ved stuetemperatur og centrifugeres i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Kassér supernatanten ved inversion.
- Der tilsættes 1 ml iskold 75% ethanol og centrifugeres 10 min ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Helt kassér supernatanten og tør RNA pellet ved at forlade hætten af røret åben.
Ikkee: På dette tidspunkt pelleten er ikke klart synlig. Fortsæt alligevel. - Pellet resuspenderes i 20 pi vand af molekylærbiologisk kvalitet. Beregn koncentrationen og renheden af nukleinsyrer ved at måle 260 nm og 280 nm absorbansen ved hjælp NanoDrop.
- Gå forsigtigt til syntese af cDNA ved anvendelse af enhver konventionel revers transkriptase-kit og ved at følge producentgaranti protokol.
Bemærk: Ca. 0,5-2 ug RNA opnået fra 4 x 10 4 naive CD4 + T-celler. cDNA kan syntetiseres fra 100 ng af RNA og anvendt i real-time PCR-reaktioner uden behov for lav RNA input kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den i dette manuskript protokol gør en god kvalitet af dyrket og klæbet hvilende og aktiverede humane naive CD4 + T-celler (figur 1). De aktiverede CD4 + -T-celler viser den karakteristiske proliferativ profil (figur 1B) i sammenligning med den hvilende tilstand (figur 1A). CD25 sene aktivering markør er nyttigt at evaluere den effektive aktivering ved 72 timer observeret ved konfokal mikroskopi (figur 1C). Den CD69 markør er i øjeblikket bruges som tidlig aktivering markør ved flowcytometri eller mikroskopi. Vedhæftning af hvilende og aktiverede naive CD4 + T-celler til et dækglas coatet med poly-L-lysin er nyttige til at undersøge ekspressionen og lokalisering af GD3 og TCR viste af en dobbelt mærkning med anti GD3 og anti TCR-antistoffer (figur 2). Som vi tidligere rapporteret, er aktiveringen ledsaget af remodelIng af GD3 og GD2 gangliosider i cellerne flade 6. Derudover er genekspression kvantificering af GD3 og GM2 / GD2 synthaser udføres fra 4 x 10 4 celler (figur 2 og 3). Den neo-ekspression af GD2 gangliosid og TCR colokalisering er tilstrækkeligt observeret ved konfokal mikroskopi, hvilket viser en mulig rolle af GD2 i TCR klyngedannelse under aktivering (figur 3). Figur 4 viser lokaliseringen af GD3 og GD2 gangliosid farves samtidigt i aktiverede CD4 + T-celler. Derudover blev aktiverede PBMCer farvet med anti GD3 og anti GD2-antistoffer viser, at denne protokol kan bruges i andre immuncellepopulationer fundet i PMBC'erne, især GD2, der blev fundet at blive udtrykt i alle de aktiverede PMBC'erne (figur 5).
Figur 1: Visualisering af naive CD4 + T-celler efter adhærens og effektiv anti CD3 / anti-CD28-aktivering (A) Resting CD4 + -T-celler ved 72 timer efter aktivering fastgjort på poly-L-lysin behandlet dækglas overholdes af lysfelt. mikroskopi. (B) aktiverede CD4 + -T-celler efter 72 timer fæstnet på poly-L-lysin behandlet dækglas. (C) CD25 markør ekspression (rød) og Hoechst 333258 farvede kerner (blå) af anti CD3 / anti CD28 aktiverede CD4 + -T-celler ved 72 timer efter aktivering. Scale bar = 50 um. Billeder blev opnået ved konfokal mikroskopi med en 60X S / 1,3 olie målsætning med 2X digital zoom. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: GD3-gangliosid og TCR pletten og mikroskopi lokalisering i hvilende og aktiverede naive CD4 + -T-celler ved 72 timer efter aktivering Resting CD4 + -T-celler med (A) kerner farvet med Hoechst 333.258, (B) GD3 gangliosid lokalisering, (. C) Merge af kerner og GD3 gangliosidet. Aktiverede CD4 + -T-celler med (D) kerner farvet med Hoechst 333.258, (E) GD3 gangliosid lokalisering og (F) Merge af kerner og GD3 gangliosidet. (G) og (H) viser TCR og GD3-gangliosid i hvilende naive CD4 + T-celler. (J og K) svarer til TCR og GD3-gangliosid-farvning i aktiverede CD4 + -T-celler. Konfokale billeder af TCR (rød) og GD3-gangliosid (grøn) lokalisering i hvilende naive CD4 + T-celler (i) oganti CD3 / CD28 Aktiveret naive CD4 + T-celler 72 timer efter aktivering (L). Den GD3, TCR og kerner pletten blev vurderet ved konfokalmikroskopi fra en stak med en 60X S / 1,3 olie målsætning med 2X digital zoom. (M) Grafen viser genekspression for GD3 syntase bestemt ved real-time PCR udtrykt som gange ændring fra 4 x 10 4 hvilende (hvile) og aktiverede (ACT) naive CD4 + -T-celler ved 72 timer efter aktivering. Dataene er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige donorer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: GD2 gangliosid og TCR pletten og mikroskopi lokalisering i hvilende og aktiverede naive CD4 + -T-celler ved 72 timer efter aktivering. + -T-celler med (A) kerner farvet med Hoechst 333.258, (B) GD2 gangliosid lokalisering, (C) Merge af kerner og GD2 gangliosid. Aktiverede CD4 + -T-celler med (D) kerner farvet med Hoechst 333.258, (E) GD2 gangliosid lokalisering og (F) Merge af kerner og GD2 gangliosid. (G og H) show TCR og GD2 gangliosid i hvilende naive CD4 + T-celler. (J og K) svarer til TCR og GD2 gangliosid-farvning i aktiverede CD4 + -T-celler. Konfokale billeder af TCR (rød) og GD2 gangliosid (grøn) lokalisering i hvilende naive CD4 + T-celler (I) og anti CD3 / CD28 Aktiveret naive CD4 + T-celler 72 timer efter aktivering (L). The GD2, TCR og kerner pletten blev vurderet ved konfokal mikroskopi fra en stabel med en60X S / 1,3 olie målsætning med 2X digital zoom. (M) Grafen viser genekspression for GM2 / GD2 syntase bestemt ved real-time PCR udtrykt som gange ændring fra 4 x 10 4 hvilende (hvile) og aktiverede (ACT) naive CD4 + -T-celler ved 72 timer efter aktivering. Dataene er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige donorer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Dobbelt pletten med anti-GD3 og anti-GD2-antistoffer til GD3 og GD2 gangliosider lokalisering (A) GD3 gangliosid identificeret med R24 anti GD3-antistof i aktiverede CD4 + -T-celler viser intracellulær og membran lokalisering. (B) GD2 gangliosid identificeret med 14G2en anti GD2-antistof i aktiverede CD4 + -T-celler viser kun lokalisering plasmamembranen. (C) lysfeltmikroskopi fra aktiverede CD4 + -T-celler. Den GD3 og GD2 pletten blev vurderet ved konfokalmikroskopi fra en stak med en 60X S / 1,3 olie målsætning med 2X digital zoom. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. GD3 og GD2 gangliosid lokalisering i aktiverede PBMC'er (A) GD2 gangliosid blev påvist med 14G2a anti GD2 antistof i anti CD3 / anti CD28 72 timer efter aktiverede PBMC'er overlay med lysfeltmikroskopi, (B) GD2 gangliosid ekspression og (C ) GD2 gangliosid og kerner fusionere. (D) GD3 gangliosIdé farvet med R24 anti GD3 antistof overlay med lysfelt, (E) GD3 gangliosid udtryk og (F) GD3 gangliosid og kerner fusionere. Den GD3, GD2 og kerner pletten blev vurderet ved konfokalmikroskopi fra en stak med en 60X S / 1,3 olie målsætning med 2X digital zoom. Scale bar = 45 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol kan anvendes til at lokalisere gangliosider eller proteiner i cellesuspensioner af CD4 + T-celler eller andre immunceller (f.eks PMBC'erne, figur 5) startende fra et lille antal celler. På grund af den lille størrelse af T-celler og ikke-klæbende egenskaber, erhvervelse af fluorescens mikroskopiske billeder resulterer i dårlig information eller lav kvalitet, hvis cellerne ikke korrekt overholdt.
Denne protokol kombineret med en god kvalitet konfokal mikroskopi-analyse er en afgørende fordel i forhold til anvendelsen af teknikker såsom tyndtlagskromatografi til påvisning af gangliosider fordi den afslører den rumlige lokalisering og dynamik gangliosider under behandlingen (f.eks T-celle-aktivering), hvilket fører til erhvervelse af biologisk relevant data 11,12,13. Dette protokol tillader også evaluering af gangliosid ekspression ud fra et lille antal af CD4 + T-celler (2 x 10 4) Der er nyttig til optimering af antallet af replikater eller forskellige assays 6.
Den omhyggelige behandling under vaske og antistoffarvning efter vedhæftning er afgørende at fastholde celleantal og integritet. På grund af den svage binding af CD4 + T-celler til dækglasset, er det også meget vigtigt nøje at tilføje og fjerne løsninger; ellers en reduktion i celleantal og forøget fluorescerende rester vil blive stødt. Når vurderes gennem konfokal mikroskopi, det immunfarvning af gangliosiderne giver yderligere oplysninger, såsom rumlig lokalisering eller co-lokalisering med andre molekyler i plasmamembranen eller intracellulære rum. Subcellulære lokalisering kræver anvendelse af subcellulær markører 14, 15. Desuden skal anvendes til farvning ved bestemmelse gangliosid ekspression begrænset til celleoverfladen friske og ikke fast CD4 + T-celler. Selv fiksering af CD4 + T ceLLS hjælper med at bevare prøven i mindst 5 dage, det indebærer risiko for permeabilisering og intracellulær farvning.
Men på grund af den strukturelle lighed mellem gangliosider, er det altid tilrådeligt at tage hensyn til specificiteten af antistoffer anvendte. Flere af de kommercielt tilgængelige anti-gangliosid-monoklonale antistoffer kan anvendes, og for nogle af dem specificiteten er blevet probet ved ELISA, TLC, osv 16,17,18.
Tidligere værker viser, at det er muligt at få oplysninger om lokalisering og udtryk for GD3 og GD2 gangliosiderne fra 2 x 10 4 celler / pr betingelse 6. Også denne protokol beskriver evnen til at udføre gen profilering eksperimenter fra 4 x 10 4 celler, tillader optimering af lyddæmpende eksperimenter såsom dem, der bygger på lentiviral partikler 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
