Summary
Tools om te diagnosticeren galzuurintermediairen malabsorptie en meet galzuur transport in vivo beperkt zijn. Een innovatieve aanpak in levende dieren wordt beschreven dat de gecombineerde proton (1H) plus fluor (19 F) magnetic resonance imaging gebruikt; Deze nieuwe methodologie heeft translationeel potentieel om te screenen op galzuurintermediairen malabsorptie in de klinische praktijk.
Abstract
Samen met hun traditionele rol als wasmiddelen die vetopname te vergemakkelijken, opkomende literatuur geeft aan dat galzuren krachtige signaalmoleculen die meerdere organen aantasten; ze moduleren darmmotiliteit en de productie van hormonen, en veranderen de vasculaire tonus, glucose metabolisme, vetstofwisseling en energiegebruik. Veranderingen in fecale galzuren kan de darm microbiome veranderen en bevorderen colon pathologie zoals cholerrheic diarree en darmkanker. Key regulatoren van fecale galzuur samenstelling van de dunne darm apicale natrium-afhankelijke Bile Acid Transporter (ASBT) en fibroblast groeifactor-19 (FGF19). Verminderde expressie en functie van ASBT vermindert intestinale galzuur-opname. Bovendien suggereren in vitro gegevens dat een aantal door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen remmen ASBT functie. Deficiënte FGF19 vrijlating verhoogt de lever galzuursynthese en laat in de darmen tot een niveau dat ASBT overweldigen. Ofwel ASBT disfunctie of FGF19 tekort verhoogt feCAL galzuren en kan chronische diarree veroorzaken en colon neoplasie te promoten. Helaas, instrumenten voor het meten van galzuren malabsorptie en de acties van drugs op galzuur transport in vivo zijn beperkt. De complexe werkingen van galzuren begrijpen, zijn technieken vereist dat gelijktijdige controle van galzuren in de darm en metabole weefsels mogelijk. Daarom hebben we een innovatieve werkwijze voor galzuur transport in levende dieren te meten met behulp van een combinatie van proton (1H) en fluor (F 19) magnetische resonantie beeldvorming (MRI) vatten. Nieuwe tracers fluor (F 19) -gebaseerde levende dieren MRI werden gemaakt en getest, zowel in vitro als in vivo. Sterke punten van deze aanpak zijn het ontbreken van blootstelling aan ioniserende straling en translationeel potentieel voor klinisch onderzoek en praktijk.
Introduction
Naast hun klassieke rol als detergentia dat vet in de darm te vergemakkelijken, zijn galzuren ontwikkeld tot krachtige signaalmoleculen beïnvloeden meerdere organen naast die verband houden met de enterohepatische circulatie 1,2. Naast het controleren van hun eigen metabolisme, galzuren moduleren verschillende aspecten van gastrointestinale fysiologie (bijvoorbeeld darmmotiliteit en incretinehormoon productie, colon fysiologie en kanker gevoeligheid) en systemische effecten op de vasculaire tonus, glucose en lipidemetabolisme en energiegebruik. Hoewel sommige van deze effecten tot stand in de darm, weer om postprandiale veranderingen in systemische galzuur niveaus, zoals in obese patiënten of na gastric bypass operatie. De complexe metabolische werkingen van galzuren nieuwe technologie vereist dat gelijktijdige controle van galzuur niveaus in verschillende anatomische compartimenten toestaat, in het maagdarmkanaal en meta helderenbolic weefsels (lever, pancreas, skeletspier en vetweefsel). Het verkrijgen van een dergelijke temporele en ruimtelijke informatie vereist innovatieve techniek - in vivo beeldvorming met behulp van nieuwe galzuur tracers zoals hier beschreven is zo'n nieuwe benadering.
Galzuur samenstelling en distributie in anatomische compartimenten worden gereguleerd door factoren die hun lever synthese en ileale opname, met inbegrip van voeding, chirurgie, gebruik van antibiotica en de veranderingen in de darmflora te moduleren. Een belangrijke regulator van intestinale galzuur opname vanwege hun enterohepatische circulatie 3 (figuur 1) is de dunne apicale natrium-afhankelijke galzuur Transporter (ASBT; SLC10A2). Hoewel passieve absorptie optreedt gedurende de darmen, ASBT medieert opname van 95% van intestinale galzuren zodat normaal beperkt is morsen van galzuren in de ontlasting. ASBT-deficiënte (Slc10a2 - / -) muizen fecale galzuren en een verminderde gal aci toegenomend zwembad 4.
Figuur 1: enterohepatische circulatie van galzuren.
Illustratie van enterohepatische circulatie waarbij galzuren worden in de lever gesynthetiseerd, uitgescheiden in de gal Boom, opgeslagen in de galblaas, vrij in de proximale dunne darm met maaltijden, en actief opgenomen via ASBT in de distale Ileum. Dat kleine hoeveelheden galzuren passief gehele darm geabsorbeerd worden ongeveer 95% van intestinale galzuren actief getransporteerd ASBT er nauwelijks (ongeveer 5%) verlies van de ontlasting die wordt gecompenseerd door een gelijke hoeveelheid nieuwe galzuur synthese de lever, waardoor het handhaven van een steady-state galzuren. De pijlen op de juiste identificatie van factoren die van invloed kunnen zijn autochtone en fluor gemerkte galzuur stabiliteit, met inbegrip van maagzuur, pancreas en intestinale slijmvlies enzymen, en, het meest importantly, hydrolytische enzymen vrijgegeven door Clostridium soorten die de distale dunne darm en dikke darm te koloniseren. (Gewijzigd met toestemming 16) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Galzuur malabsorptie kan worden onderverdeeld in drie typen, elk toeneemt fecale dihydroxy galzuren, waardoor intermitterende of chronische diarree veroorzaken. Type 1 gevolg is van grove ileale pathologie (bv, resectie, de ziekte van Crohn) 5. Type 3 resultaten van cholecystectomie, vagotomie, coeliakie, bacteriële overgroei en pancreas insufficiëntie. Daarentegen mensen met primaire (type 2) galzuur malabsorptie vormen een enorme diagnostische uitdaging omdat ze geen dergelijke voorafgaande voorwaarden niet aannemelijk pathologie in het ileum niet. Derhalve wordt primair galzuur malabsorptie vaak verkeerd gediagnosticeerd als diarree-predominant prikkelbare darmsyndroom (IBS-D), misschien wel de meest voorkomende reden voor gastro-enterologie gerelateerde poliklinische bezoeken. Er wordt geschat dat een derde van de patiënten met IBS-D primair galzuur malabsorptie; in de VS, kan dit een paar miljoen mensen 5 vertegenwoordigen. Recente inzichten geven aan dat de primaire BAM is afgeleid van een verminderde feedback remming van de lever galzuursynthese door intestinale fibroblast groeifactor-19 (FGF19), niet van verminderde expressie of functie van ASBT.
In primaire galzuren malabsorptie, lage plasmaspiegels van FGF19 niet af te sluiten hepatische galzuursynthese - de resulterende toename van intestinale galzuren verzadigd galzuur transporters, waaronder ASBT en augmented morsen van galzuren in de ontlasting veroorzaakt diarree 6 (Figuur 2). Deficiënte muizen in Fgf15 (muizen FGF19) hebben een uitgebreide galzuren en een verhoogde fecale galzuren 7.
Figuur 2: Mechanismen van Intestinal Bile Acid Malabsorptie.
Normaal, zoals getoond in panel A, ongeveer 95% van intestinale galzuren worden geabsorbeerd door actief transport in het distale ileum via ASBT. Wanneer ASBT expressie of activiteit wordt verminderd (paneel B), verminderde darm galzuur opname resulteert in verspilling van galzuren in de dikke darm. Met een verminderde FGF19 signalering (paneel C), het gebrek aan feedback remming van de lever galzuursynthese resulteert in verhoogde concentraties van intestinale galzuren dat ASBT transportcapaciteit met het morsen van galzuren in de dikke darm te overweldigen. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Op lange termijn, chronische verhoging in fecal gal acids kan colon neoplasie te promoten. Colon neoplasie komt voort uit progressieve mucosale dysplasie geassocieerd met somatische genmutaties, maar omgevingsfactoren die fecale galzuren kan versnellen en versterken dit proces te verhogen. Bij knaagdieren, verhoogde fecale galzuren hetzij als gevolg van exogene toediening of ASBT deficiëntie bevorderen colon dysplasie en tumorvorming 8-10.
Met name provocerende bevindingen wijzen erop dat veel gebruikte drugs door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd krachtig remmen galzuur transport door ASBT in vitro 11. Als deze drugs, verminderen de dunne darm galzuur transport in vivo en het verhogen van fecale galzuur niveaus, zou de mogelijke impact op colon pathologie betrekking. Zelfs een kleine toename colon pathologie die aan het gebruik van een dergelijk geneesmiddel kan een belangrijk gezondheidsprobleem impact. Een toolkit die de plausibiliteit van deze in vitro bevindingen en epidemiologische ob kunnen beoordelenservations zou aanvullend onderzoek, met inbegrip van post-marketing onderzoek naar de veiligheid te bevorderen.
Ondanks de noodzaak praktische assays identificeren mensen met galzuren malabsorptie ontbreken. Directe meting van fecale galzuren werd jaren geleden afgewezen als omslachtig, onpraktisch en onbetrouwbaar 5. Alternatieve benaderingen omvatten het meten van het behoud van een radioactief selenium gemerkt cholinezuur derivaten (75 SeHCAT) en plasmaniveaus van 7α-hydroxy-4-cholesten-3-on (C4), of een therapeutisch proces galzuur bindmiddelen. 75 SeHCAT testing beperkte beschikbaarheid in Europa en is niet FDA-goedgekeurd of beschikbaar is voor gebruik in de VS zelfs bescheiden blootstelling aan straling (0,26 mSv / 75 SeHCAT test) van diagnostische tests geeft aanleiding tot bezorgdheid, en bacteriële overgroei en gevorderde leverziekte kan 75 SeHCAT resultaten verwarren. C4 testen potentieel aantrekkelijk aangezien alleen plasma nodig is, maar het heeft lage positieve voorspellende valUE en testen is niet algemeen beschikbaar. Meten serumniveaus van FGF19 heeft dezelfde beperkingen. Veel clinici toevlucht nemen tot een therapeutisch proces van galzuursequestranten, maar deze benadering kan geen definitieve diagnose galzuur malabsorptie 5.
Daarom werd een nieuwe benadering ontworpen om MRI galzuur transport en distributie in vivo meten met behulp innovatief multi-gefluoreerde galzuren (MFBA-MRI). MFBA met drie atomen van fluor (19 F), een stabiele isotoop van 100% natuurlijke abundantie, zijn eveneens getransporteerd naar natief galzuren 12, en kan worden gebruikt voor het visualiseren galzuur transport met een combinatie van proton (1H) en fluorine ( 19 F) MRI, een gevoelige, veilige methode zonder ioniserende straling blootstelling 13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol voldoet aan de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Maryland School of Medicine (IACUC Protocol # 0415011, goedgekeurd 18 juni 2015) goedgekeurd.
1. Gavaging Muizen met 19 F-gelabelde galzuren
- Maagsonde muizen met 150 mg / kg lichaamsgewicht 19F gemerkte galzuren. Vul een 1 ml spuit met de vereiste volume met 19F gemerkte galzuur voorraadoplossing [cholinezuur-trifluor-acetyl lysine (CA-lys-TFA, in 1: 1 polyethyleenglycol 400: Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing) of cholylsarcosine- trifluor-N-methyl-aceetamide (CA-sar-TFMA, in 60% polyethyleenglycol 400 en 40% Dulbecco's fosfaat gebufferde saline] en voeg een 20-gauge 1,5 inch gebogen lamp getipt maag sondenaald Controleer de sondenaald. lang genoeg is om het niveau van xyphoid kraakbeen muis bereiken wanneer ingebracht in de slokdarm naar de naaf van de naald
- stevig grasp het dier door de losse huid aan de achterkant van de nek tussen de duim en wijsvinger en gebruik de overblijvende vingers op de huid grijpen op de onderrug en staart.
- Houd de muis rechtop en laat de maagsonde naald langs de zijkant en het dak van de mond in de slokdarm tot in het maag. Als weerstand wordt ondervonden in de keelholte, de positie van de naald tot het dier 'slikt' het - niet duwen tegen de weerstand.
- Als anesthesie is vereist voor maagsonde, plaatst u de muis in een glazen stolp met 5 ml isofluraan en sluiten. Wanneer de muis valt op zijn kant, wacht 7 sec, verwijdert u de muis en het uitvoeren van sondevoeding. Om personeel te beschermen tegen verdoving dampen, gebruik maken van de stolp alleen in een zuurkast.
- Observeer het dier te herstellen van isofluraan in een paar minuten.
OPMERKING: Aangezien isofluraan wordt gemetaboliseerd door de lever, een fluor signaal afkomstig uit intacte geneesmiddel of zijn metabolieten uitgescheiden in de galwegen en galblaas kan fluo verwarrenrine signalen van 19F-gemerkte galzuren 15. Een alternatief is om ketamine plus xylazine (zie paragraaf 3.1 voor doses) gebruiken.
2. Het oogsten van de galblaas, de lever en het bloed voor Bile Acid metingen met behulp van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie
- Om maximale vulling galblaas, snelle muizen bereiken tenminste 6 uur vóór het verzamelen van organen. Bereid ketamine en xylazine in fosfaat gebufferde zoutoplossing (100 pl ketamine, xylazine 62,5 ul, 840 ul PBS).
- Onder toepassing van een 1 ml steriele spuit injecteert een muis subcutaan 1 uur vóór orgaan oogsten met 15 ul / g lichaamsgewicht ketamine / xylazine oplossing (150 mg ketamine en xylazine 18 mg per kg lichaamsgewicht).
- Een uur na het toedienen van ketamine / xylazine bevestigen adequate anesthesie door teen knijpen en plaats de verdoofde muis rugligging.
- Gebruik 5 of 6 inch schaar om een middellijn buikhuid incisie vanaf het schaambeen leveren aan de xyphoid en fine schaar (4 inch) tot de peritoneale bekleding gesneden en bloot buikorganen - niet het membraan doorboren.
- Pak de xyphoid proces met een 5 inch klem en til terug over de borst tot aan de bovenste buikholte bloot te leggen. Gebruik een tang en een stomp voorwerp te ontleden en te bewegen de lever opzij, waardoor de galblaas.
OPMERKING: de lever niet verscheuren en raak de galblaas als de voormalige zal ernstige bloeden veroorzaken en de laatste kan galblaas contractie en legen te stimuleren. - Plaats een 4-inch klem over de galbuis (figuur 3, gestippelde pijlen). Snijd het ligament bevestigen de superieure pool van de galblaas het membraan en beweeg de galblaas aan de rechterkant van de buik.
Figuur 3: Anatomische en Proton MRI Views van de Muis galblaas.
Het linker paneel toont de blootgestelde mouse galblaas links van middellijn abdominale incisie. De klem grijpt de xyphoid proces. De-gal gevulde vasten galblaas wordt aangegeven door de grote pijl en geklemd galbuis door de gestippelde pijlen. [Inzet: uitgesneden intact galblaas met de gemeenschappelijke galweg geklemd. De liniaal is gemarkeerd in millimeter (mm).] Een hoge-resolutie proton density-gewogen MRI-beeld van het vasten muizen galblaas (pijl) De rechter paneel toont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Vóór het uitsnijden van de galblaas te voeren cardiale punctie, oogst bloed en exsanguinate het dier om euthanasie te controleren.
LET OP: Het oogsten van de galblaas eerste kan de lever veroorzaken cardiovasculaire collaps en ontoereikende bloedmonster te verkrijgen (≥ 200 pi) verscheuren. - Maak de onderzijde van het membraan en linkeridentificeren het kloppen oppervlak van het hart. Op het punt van de maximale cardiale pulsatie doorboren het membraan en hart met een 23-gauge naald bevestigd aan een 1 ml spuit.
- Langzaam trekken de spuit tijdens het opzuigen. Wanneer het bloed begint aan de spuit te vullen, stop te trekken en te behouden zuigkracht te verzamelen 0,2-0,6 ml bloed. Voorzichtig draaien van de naald of deze intrekking enigszins kan herstellen stroming als het ophoudt.
- Breng het bloed naar een 1,5-ml gehepariniseerde buis en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 15 min. Precipiteren het plasma met vier delen acetonitril en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min. Analyseer de bovenstaande door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (LC / MS / MS) 11-1312-1412-1412-1412-14. Indien nodig, bewaar de plasma bij -80 ° C voor de analyse.
- Met behulp van stompe dissectie, bevrijden de galblaas uit de lever. Doorsnijden van de galwegen onder de klem, te verwijderen en wegen van de galblaas, en plaats deze in een 1,5-ml microcentrifuge buis. Oogst de lever.
- Homogeniseren ongeveer 100 mg van de lever en de hele galblaas op ijs in een size-21 glas tissue homogenisator. Extract met 75% acetonitril en 25% water (800 pl voor de lever, 300 pi voor galblaas) en gecentrifugeerd bij 12.000 xg gedurende 10 min. Verdun extracten als nodig is en te kwantificeren galzuur inhoud met behulp van LC / MS / MS 11-13.
3. Levende Animal Proton (1H) en Fluor (19 F) Magnetic Resonance Imaging
- Om maximale galblaas vullen, snel muizen te bereiken gedurende minstens 6 uur voor beeldvorming. Gebruik ketamine en xylazine, verdoven muizen om beweging in de MRI scanner voorkomen. Bereid een voorraadoplossing van ketamine plus xylazine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (130 pl ketamine, xylazine 42,5 ul, 827 ul PBS). Eén uur voor MRI, gebruikt een 1 ml steriele spuit met een muis subcutaan geïnjecteerd met 5 ul / g lichaamsgewicht van deze oplossing (65 mg ketamine en 4,25 mg xylazine per kg lichaamsgewicht). Om te voorkomen droog onder narcose veterinaire zalf ogen van het dier.
- Na inductie met ketamine / xylazine zoals hierboven, clip een 1,5 cm 2, op de linkeroever onderste helft van de muis buik met behulp van # 40 of fijner elektrische scheerkoppen. Na bont verwijdering, prep het gebied met 8-12% verdund jodium chirurgische scrub oplossing en spoel af met 70% alcohol - Herhaal beide stappen. Steek een 24-gauge met 0,75-inch naald / katheter subcutaan en tunnel in de buikholte. Controleer de katheter niet in de blindedarm of andere abdominale organen door terugtrekken van de zuiger - er mag geen bloed of fecaal materiaal in de katheter.
- Verwijder de naald en laat de intraperitoneale katheter. Plaats de muis op een temperatuur-gecontroleerde thermische pad in de MRI-scanner dier kamer.
- Bereid een 1 ml steriele spuit met ketamine en xylazine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (1000 pl ketamine, xylazine 300 gl, 6700 pl PBS) en vul de gewenste lengte van 72 inch steriele buis. Sluit de intraperitoneale katheter naar de voorgevulde steriele buis en uit te breiden uit de buurt van de MRI-scanner. Handhaven anesthesie injecteren 50 ul van deze oplossing elke 20 min wanneer de muis vitale tekenen stabiel.
OPMERKING: Voordat imaging, zorg ervoor dat er geen metalen in de buurt van de MRI-scanner. - Gebruik een 19 V / 1 H dual-tuned lineaire volume MRI spoel aan radiofrequente signalen op 300,283 MHz voor 1H en 282,524 MHz voor 19 F kernen zenden en ontvangen.
- Voer systeemkalibratie 11, 13 en dier lokalisatie met drie-slice (axiaal, mid-sagittale en coronale) scout beelden met behulp van een snelle lage hoek geschoten sequentie (Flash). Om het experiment te starten, klikt u op het 'stoplicht' knop in het venster Scan Controle op de software-console.
- Verwerven multislice 1H MR-beelden met behulp van een snelle overname met ontspanning te verbeterenment (zeldzaam) volgorde in het kruis het oog van het monster of het lichaam van het dier met herhalingstijd 2200 ms, echo tijd 8,9 msec, RARE factor 8, gezichtsveld 4 x 4 cm 2, slice dikte 1,0 mm, matrix grootte 266 x 266, in-plane resolutie van 150 x 150 pm 2, en het aantal gemiddelden 6. Om het experiment te starten, klikt u op het 'stoplicht' knop in het venster Scan Controle op de software-console.
- Acquire 19 F beelden met behulp van een Flash-sequentie in hetzelfde gebied van het 1H MRI met herhaling tijd 220 ms, flip hoek = 30 °, echo tijd 3,078 ms, matrix formaat 32 x 32, in-plane resolutie van 1,25 x 1,25 mm 2, slice dikte 4,0 mm, en het aantal gemiddelden 768. Om het experiment te starten, klikt u op de 'GOP' (G o- O n- P ipeline) knop in het venster Spectrometer control Tool op de software-console.
- Na MRI, euthanaseren de muis met intraperitoneale injectieen van 15 ul / g lichaamsgewicht ketamine / xylazine oplossing (150 mg ketamine / xylazine 18 mg per kg lichaamsgewicht) gevolgd door hartpunctie voor leegbloeden.
- Om een muis uit narcose te herstellen, verwijdert u de intraperitoneale katheter maar het dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn borstligging handhaven herwint.
- Meten 19F gemerkte galzuur concentraties van 11-13 orgaan oogst, onderhouden anesthesie met ketamine plus xylazine zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van MFBA voor in vivo MRI 'zien' galzuur transport in real time heeft een groot potentieel voor zowel onderzoek en klinisch gebruik. Bovendien is de hier beschreven resectie van de galblaas en biochemische analyse van de inhoud met behulp van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie werkwijzen manier bevestigt imaging resultaten. Echter, de geldigheid van deze methoden vereist een nauwkeurige dosering, timing van de assays, en lokalisatie van de galblaas voor imaging of operatieve verwijdering. Voor dit laatste is het zeer belangrijk dat buikorganen de muis verstoord worden zo weinig mogelijk; zelfs zachte manipulatie van de galblaas kan samentrekking en lediging stimuleren. Vandaar dat de volledige inhoud vangen, is het essentieel om de klem in de galbuis zo spoedig mogelijk.
Met behulp van de chirurgische aanpak voorgesteld hier, de galblaasmoet gemakkelijk worden geïdentificeerd achter de rechter voorste kwab van de lever in het rechtsboven kwadrant van de buik (figuur 3). Het verplaatsen van de lever opzij, zonder het aanraken van de galblaas loopt de galwegen voor klemmen. Zodra deze klem op zijn plaats is, mag er geen moeite verder te gaan met de andere stappen in het protocol beschreven om de galblaas intact te verwijderen.
De gegevens in tabel 1 blijkt zeer selectieve concentratie MFBA in de galblaas 13,14. Orgaan (lever en galblaas) MFBA concentraties werden berekend onder aanname van een dichtheid van 1 g / ml 13,14. Binnen 7 uur na orale toediening, gemiddelde accumulatie van MFBA in de galblaas was verscheidene grootteordes (1000-voudig) hoger dan die waargenomen in zowel de lever of bloed 13,14; millimolair niveaus werden waargenomen in de galblaas versus micromolaire niveaus in lever en het bloed (tabel 1 </ Strong>). Gemiddeld MFBA concentraties varieerden 0,4-1,4 uM in het bloed, 14,5-78,8 mM in de lever, en 18,4-27,0 mM in de galblaas. Deze bevindingen zijn consistent met MFBA wordt dezelfde fysiologische galzuren behandeld; na orale toediening, worden MFBA actief getransporteerd ASBT in de enterohepatische kringloop waarbij zij de lever voor actief transport tot hepatocyten door de natrium / taurocholaat co-transporterende polypeptide (NTCP) plaatsvindt, en uitgescheiden in de galboom voor concentratie in de galblaas (Figuur 1).
Figuur 4 toont tijdsafhankelijke accumulatie van de 19 F-signaal in de galblaas na maagsonde met MFBA. Een gedetailleerdere tijdsverloop middels analytische methoden (LC / MS / MS) gaf aan dat piek galblaas concentraties MFBA waargenomen in het traject van 4-7 uur na orale toediening 12 Dit resultaat is consistent met de fysiologische kinetiekvan enterohepatische circulatie van galzuren. Het linkerpaneel in figuur 4, een MRI beeld verkregen twee en een half tot vier uur na orale gavage met MFBA onthult 19F signaal afkomstig van het beeld naar de galbuis (gestippelde pijl) en een robuuster signaal afkomstig van zijn de galblaas (pijl); van 7-8,5 uur, wordt de galbuis signaal niet meer gedetecteerd en de galblaas 19F signaal vergroot tot dezelfde intensiteit als die welke uit het aangrenzende MFBA fantoom (Figuur 4, rechter paneel, pijl).
We gebruikten muizen met deficiënte expressie van ASBT het vermogen van MFBA-MRI om verlaagde intestinale opname van galzuren detecteren testen. Zoals getoond in figuur 5A, een ongeveer 22-voudige verlaging van de concentratie van MFBA in galblaas van ASBT-deficiënte muizen werd gemeten met LC / MS 13,14; op basis van deze bevindingen werd verwacht thbij de MFBA 19 F MRI-signaal in deze dieren zouden lager zijn dan de detectielimiet. Zoals getoond in Figuur 5B, terwijl een stevige 19 F signaal afkomstig uit de galblaas in een wildtype muis werd gedetecteerd, werd er geen overeenkomstige 19 F signaal in de ASBT-deficiënte muis 13,14. Deze bevindingen bevestigen dat MFBA gelijke wijze behandeld als fysiologische galzuren en MFBA-MRI kan worden gebruikt om gestoorde intestinale opname van galzuren detecteren.
Figuur 4: Vertegenwoordiger MFBA-MRI-beelden.
Resultaten van experimenten in levende muizen tonen reconstructie veneers 19F en 1H-afbeeldingen tonen dat 19 F signalen afkomstig van de muis galblaas (grote pijlen). Referentie fantomen die bekende concentraties van 19F-gemerkte galzuren werdengeplaatst in de MRI scanner naast de muis (linker pijl). In het linker paneel, de gestippelde pijl geeft 19 F-gelabelde galzuur signaal afkomstig van de galwegen. Opgenomen boven elk paneel is de tijd na maagsonde met 19 F-gelabelde galzuur dat MRI werd begonnen aan de tijd dat imago overname werd afgerond (1,5 uur). Zoals verwacht, galblaas vullen met de 19 F-gelabelde galzuur neemt toe met de tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verzwakte MFBA-MRI Signaal van gallbladders van ASBT-deficiënte muizen.
(A) Staafdiagram toont dat de concentratie van MFBA gemeten met LC / MS / MS ongeveer 22-voudig lager in ASBT-deficiënte muizen vergelijkd controlemuizen. (B) Afwezig MFBA-MRI-signaal van de galblaas van een ASBT-deficiënte muizen. Pijlpunten geven aan 19-F gemerkt galzuur fantomen (links panelen) en 19 F MRI-signaal van fantomen (rechts panelen). Pijl in hogere juiste paneel geeft 19 F-gelabelde galzuur signaal afkomstig van de galblaas; er is geen overeenkomstige 19 F-gelabelde galzuur signaal in de ASBT-deficiënte muizen (onderste rechter paneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Galblaas Gewicht (mg) | MFBA Concentratie | |||
| Galblaas (MM) | Lever (uM) | Plasma (uM) | ||
| CA-lys-TFA | 25.2 ± 3.2 | 27,0 ± 2,4 | 78,8 ± 35,1 | 0,4 ± 0,2 |
| CA-sar-TFMA | 29.2 ± 2.4 | 18,4 ± 1,6 | 14,5 ± 0,6 | 1,4 ± 0,1 |
Tabel 1: Representatieve waarden voor galblaas, lever en de plasmaconcentraties van F-19 gemerkte galzuren.
Gemiddelde ± standaardfout (SE) waarden worden getoond voor galblaas gewicht en de concentraties van de aangegeven MFBA in de galblaas, lever en plasma 12,13. De weergegeven waarden zijn gemeten 5-7 uur na gavaging muizen met 150 mg / kg lichaamsgewicht van de aangegeven MFBA. Let op de millimolaire concentraties MFBA in de galblaas opzichte micromolaire concentraties in de lever en plasma. N = 3 mice per waarde voor CA-lys-TFA en 5 muizen per waarde voor CA-sar-TFMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De synthese van CA-lys-TFA en CA-sar-TFMA en de in vitro analyse van hun vervoer met stabiel getransfecteerde Madin-Darby niercellen van honden expressie ASBT en humane embryonale niercellen tot expressie de natrium / taurocholaat co-transporterende polypeptide (NTCP) elders gedetailleerd 13,14. Hier ligt de nadruk op de orale toediening van MFBA via een maagsonde aan dieren, gevolgd door de oogst van de galblaas, lever en bloed voor de analyse van MFBA inhoud leven en, met name, de beeldvorming MFBA in de galblaas door levende dieren MRI. Kritische stappen omvatten het vermijden fluorbasis anesthetica die kan leiden concurrerende 19 F signalen vermijden galblaas manipulatie voor het klemmen van de galbuis wat kan leiden tot galblaas contractie en ledigen voordat het orgaan wordt uitgesneden, en het vermijden van de plaatsing van metalen bij de MRI-scanner.
Zoals hier en elders 13,14 gedetailleerde, MFBA-MRI heeft een groot potentieel to succes analyseren galzuur transport in vivo zowel onder normale en abnormale fysiologische omstandigheden. Belangrijkste troeven van MFBA-MRI zijn dat het gaat om niet-ioniserende straling (noch MFBA gelabeld met de natuur voorkomende, niet-radioactieve fluor noch MRI zenden ioniserende straling) worden en MFBA oraal toegediend zonder dat venapunctie (in tegenstelling tot muizen, zullen de meeste mensen niet parenterale toediening vereisen van anesthetica of kalmerende middelen om beweging artefact in de MRI-scanner te voorkomen). Substitutie van een hydrolyseerbare galzuur met een synthetisch galzuur tegen hydrolyse door de darmflora 13,14, kunnen problemen met betrekking tot de in vivo stabiliteit van MFBA in de darm te overwinnen. Het eerste prototype van MFBA betrokken toevoegen van drie fluoratomen per molecuul cholinezuur, een natuurlijk voorkomend humaan galzuur dat de darm wordt gehydrolyseerd door Clostridium hydrolasen 13,14. Een nieuwe tri-gefluoreerde galzuur, CA-sar-TFMA basis van een sarcosinebackbone die bestand is tegen hydrolyse door bacteriële enzymen omzeild deze beperking verlenging van de halfwaardetijd van MFBA 13,14.
Tenslotte wordt een mogelijk concurrerende methode, de toepassing van N-methyl- [11C] cholylsarcosine PET / CT, beperkt door blootstelling aan straling van zowel radioactief gemerkt galzuur en CT en de noodzaak te bereiden, verzenden en opslaan van de radioactieve galzuur 17.
Ten aanzien van wijzigingen en het oplossen van problemen voor deze nieuwe methodologie, kan men dat het niet om een MRI-signaal afkomstig van de galblaas kan detecteren overwegen als gevolg van een probleem met de 19 F-gelabelde galzuur of de biologische beschikbaarheid ervan, de timing van het beeld overname, of onvoldoende vulling van de galblaas. Zoals hierboven besproken testen we de structurele integriteit van deze middelen door ze in vitro worden getransporteerd cellijnen die de geschikte galzuur transporters. We staan op zijn minst 1,5 uurr voor het verwerven, maar in sommige gevallen is dit duur kan verlenging nodig. We vinden dat vasten muizen pre-MRI te waarborgen galblaas maximale vulling is belangrijk.
De grenzen van de detectie voor 19 F-MRI signalen nodig dier beeldvorming voor 90-120 min voor adequate signaal acquisitie; Dit is waarschijnlijk te lang voor een praktische klinische proef - patiënten zou moeten blijven liggen in de MRI scanner voor deze duur. Ook huidige klinische MRI berust hoofdzakelijk op proton (1H) beeldvorming; de toepassing van fluor (F 19) beeldvorming investering in hardware (19F spoel) en software ten minste $ 250.000 per MRI-scanner investering vereisen. Tot andere fluor MRI-toepassingen ontwikkeld met MFBA-MRI patiënten galzuur malabsorptie evalueren waarschijnlijk niet kosteneffectief.
MFBA-MRI biedt een veelbelovend alternatief voor het meten 75 SeHCAT retentie, plasma 7α-hydroxy-4 -cholesten-3-on (C4), en plasma FGF19, of het uitvoeren van een therapeutische studie met galzuur binders. In de VS, 75 SeHCAT testen, die blootstelling aan straling betreft, is niet FDA-goedgekeurd. C4 en FGF19 testen heeft een lage positief voorspellende waarde en het testen is momenteel alleen beschikbaar via gespecialiseerde laboratoria. Bovendien, zowel C4 en FGF19 niveaus weerspiegelen de lever synthese van galzuren. Derhalve tegenstelling MFBA-MRI, deze bepalingen niet detecteren veranderde expressie of mutatie van ileale galzuur transporters of andere mechanismen galzuur malabsorptie die onafhankelijk van verhoogde galzuur synthese. Therapeutische proeven van gal zuurbinder kan nuttig zijn, maar hebben onzekere voorspellende waarde en kan niet zorgen voor een definitieve diagnose van galzuren malabsorptie 5. Tot slot, hoewel directe meting van fecale galzuren is schijnbaar redelijk werd dit jaar geleden afgewezen als te omslachtig, onpraktisch en onbetrouwbaar voor routinematig klinisch gebruik 5.
ent "> Extra problemen moeten worden overwonnen zodat deze innovatieve benadering kan worden vertaald metingen in vivo galzuur transport in de kliniek (bijvoorbeeld voor de diagnose van galzuur malabsorptie als oorzaak van chronische diarree). Een grote uitdaging is het maximaliseren signaalintensiteit door het aantal 19 C-atomen per galzuur molecuul verhogen zonder verstoring van het vermogen van MFBA gedragen als natuurlijke galzuren, dat wil zeggen een galzuur molecuul dat te omvangrijk vanwege toegevoegd 19 F atomen niet vervoerd door een ASBT of galzuur transporters in de lever. het vermogen van nieuwe MFBA in vitro te transporteren kunnen worden getest cellijnen belangrijke menselijke galzuur transporters 13,14 en dienen voorspellend in vivo vervoer. met de toegenomen gevoeligheid MFBA-MRI heeft potentieel voor verbeterde beeldvorming van het gehele galwegen (bijvoorbeeld galbuis en bijkantoren), in dit verband het vermogen to het gemeenschappelijke galweg in sommige muizen lijkt veelbelovend (afbeelding 4, linker paneel).Hoewel de huidige grenzen van galzuur detectie door MFBA-MRI te visualiseren staan alleen in de galblaas, uitgaande van de gevoeligheid van de techniek kan worden verbeterd verwachten we MFBA-MRI kan worden gebruikt voor het meten galzuur transport en distributie in vivo waardoor uitgebreide ruimtelijke anatomisch informatie in real time; een activerende technologie die moleculaire beeldvorming zou bevorderen. MFBA-MRI zou daardoor ook een nieuwe technologie om de effecten van gen-polymorfismen en geneesmiddelen die galzuur transporter kunnen verminderen beoordelen. MFBA-MRI heeft translationeel potentieel om te helpen artsen te screenen op galzuurintermediairen malabsorptie en daarmee ziektes als gevolg van verhoogde fecale galzuren (bijvoorbeeld diarree die bootst het prikkelbare darm syndroom) te identificeren en te beheren. Ten slotte moet deze techniek wordt klinisch beschikbaar is, heeft een grote promise vooruitgang in de geneeskunde nauwkeurigheid versnellen door de mogelijkheid om veranderde intestinale galzuur opname identificeren personen met colon neoplasie of andere aandoeningen die kunnen worden beïnvloed door veranderingen in fecale galzuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases (subsidie nummers R21 DK093406 en T32 DK067872 te JP.R.) en een VA Merit Award (licentienummer 1BX002129 te JP.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Duall size-21 all glass tissue grinder | Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ | 885351-0022 | |
| Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5) | |
| Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil | Bruker Biospin MRI GmbH, Germany | Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5) | |
| Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
| Gavage Needle | Braintree Scientific, INC. | N-010 | 20 G-1.5" curved 2.25 mm ball |
| 2 Stainless Steel Hemostats | VWR | 10755-018 | 4 and 5 inch, straight |
| Ketamine | MWI Veterinary Supply | 501090 | Ketamin zetamine 100 mg/ml |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 20 mg/ml | |
| Intraperitoneal Catheter | Abbott | AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42 | 24-G x 0.75" |
References
- Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. Targeting bile-acid signalling for metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 7, 678-693 (2008).
- Vallim, T. Q., Edwards, P. A. Bile acids have the gall to function as hormones. Cell Metab. 10, 162-164 (2009).
- Dawson, P. A., Karpen, S. J. Thematic Review Series: Intestinal Lipid Metabolism: New Developments and Current Insights Intestinal transport and metabolism of bile acids. Journal of Lipid Research. 56, 1085-1099 (2015).
- Dawson, P. A., et al. Targeted deletion of the ileal bile acid transporter eliminates enterohepatic cycling of bile acids in mice. J Biol Chem. 278, 33920-33927 (2003).
- Pattni, S., Walters, J. R. Recent advances in the understanding of bile acid malabsorption. Br Med Bull. 92, 79-93 (2009).
- Walters, J. R., et al. A new mechanism for bile acid diarrhea: defective feedback inhibition of bile acid biosynthesis. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1189-1194 (2009).
- Hofmann, A. F., Mangelsdorf, D. J., Kliewer, S. A. Chronic diarrhea due to excessive bile acid synthesis and not defective ileal transport: a new syndrome of defective fibroblast growth factor 19 release. Clin Gastroenterol Hepatol. 7, 1151-1154 (2009).
- Flynn, C., et al. Deoxycholic acid promotes the growth of colonic aberrant crypt foci. Mol Carcinog. 46, 60-70 (2007).
- Glinghammar, B., Rafter, J. Carcinogenesis in the colon: interaction between luminal factors and genetic factors. Eur J Cancer Prev. 8, S87-S94 (1999).
- Bernstein, C., et al. Carcinogenicity of deoxycholate, a secondary bile acid. Arch Toxicol. 85, 863-871 (2011).
- Zheng, X., Ekins, S., Raufman, J. P., Polli, J. E. Computational models for drug inhibition of the human apical sodium-dependent bile acid transporter. Mol Pharm. 6, 1591-1603 (2009).
- Vivian, D., et al. Design and characterization of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile Acid transporter activity. Pharm Res. 30, 1240-1251 (2013).
- Vivian, D., et al. Design and evaluation of a novel trifluorinated imaging agent for assessment of bile acid transport using fluorine magnetic resonance imaging. J Pharm Sci. 103, 3782-3792 (2014).
- Vivian, D., et al. In vivo performance of a novel fluorinated magnetic resonance imaging agent for functional analysis of bile acid transport. Mol Pharm. 11, 1575-1582 (2014).
- Raufman, J. P., et al. In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Detect Biliary Excretion of 19F-Labeled Drug in Mice. Drug Metab Dispos. 39, 736-739 (2011).
- Ridlon, J. M., Kang, D. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47, 241-259 (2006).
- Frisch, K., et al. N-methyl-11C]cholylsarcosine, a novel bile acid tracer for PET/CT of hepatic excretory function: radiosynthesis and proof-of-concept studies in pigs. J Nucl Med. 53, 772-778 (2012).
