Introduction
Gnagare modeller har använts för att studera många mänskliga sjukdomar manifestationer, inklusive pyelonefrit och urinvägsinfektioner (UTI). UTI är ett globalt hälsoproblem och kan påverka barn, män och kvinnor i alla åldrar. 1 , 2 , 3 Den initiala manifestationen av UTI: er innefattar cystit, och om infektionen stiger längs urinläkaren kan en njureinfektion (pyelonefrit) följa. Samtidigt närmar sig förekomsten av diabetes 400 miljoner människor världen över. 4 , 5 Det är viktigt att UTI-incidensen kan vara upp till 4 gånger högre hos patienter som är överviktiga eller har typ 2-diabetes mellitus, vilket medför ökad risk för återkommande UTI-infektion (RUTI), sepsis, renal fibros från pyelonefrit och blåsdysfunktion. 6 , 7 , 8 GnagareModeller är viktiga för att studera UTI: er, eftersom nuvarande antibiotikabehandlingar endast ger ett varaktigt, förebyggande svar endast i en delmängd av UTI-patienter. För att förbättra klinisk UTI-vård är de viktigaste stegen att förstå mekanismen för RUTI och dess patofysiologiska processer från akut infektion till inflammation i fibros, liksom effekterna av typ 2 diabetes mellitus.
Målet att förbättra djurmodeller är att utveckla tekniker som möjliggör en mer exakt utvärdering av sjukdomsprogression och terapeutiska ingrepp. Flera olika tillvägagångssätt har använts för att inducera pyelonefrit hos råttor och / eller möss för att studera patofysiologi av njurskador, effekten av antibiotikabehandling och andra aspekter av den naturliga utbildningen av UTI. Ett gemensamt tillvägagångssätt för att etablera retrograd UTI är transuretral kateterisering. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Denna metod introducerar bakterier via urinröret i urinblåsan hos bedövade djur. Medan denna teknik nära simulerar mänsklig pyelonefrit, kan den faktiska incidensen och storleken av pyelonefritinfektion vara mycket varierbar på grund av flera faktorer, inklusive brist på spontan ureterisk reflux eller urinrörelse under eller omedelbart efter inokulering. 11 Som ett resultat kan den experimentella variationen i att framkalla en stigande pyelonefritinfektion begränsa nyttan av denna modell för att studera njureinfektioner såväl som terapeutiska strategier.
I denna rapport beskrivs en kirurgisk pyelonephritis-råttmodell där E. coli injiceras direkt i råtternyten. Trots att denna råttmodell är invasiv, kan mängden av E. coli som levereras till njuren effektivt kontrolleras vilket möjliggör en robust njureinfektion och inflammation. 14 Inom detta förfarande beskriver vi ocksåHur dessa framkallade njurinfektioner kan övervakas longitudinellt med in vivo magnetisk resonansbildning (MR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier utfördes enligt godkända Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokoll vid Case Western Reserve University. Varaktigheten av det kirurgiska förfarandet som beskrivs nedan är ungefär 45-60 min. MRI-proceduren i sig är ca 15 min för varje tidpunkt.
1. Narkos
- Bedöva råtta i isoflurankammare satt till 2% isofluran blandat med syre för att underlätta djurhantering och fasthållning före administrering av injicerbar anestesi intraperitonealt.
- Efter 3-5 min exponering för isofluran, kontrollera att djuret är bedövat och uppvisar inget svar på tånklämningen.
- Ytterligare lugnande råtta med en intraperitoneal injektion av en blandning av xylazin och ketamin: 75 mg / kg ketamin / 10 mg / kg xylazin. När du utför intraperitoneala injektioner, dra tillbaka nålen för att säkerställa att delar av tarmen eller andra vitala organ inte har punkterats.
- jagInjicera 2 mg / kg bupivakain subkutant vid snittet för att ge aktuell smärtlindring.
2. Beredning av kirurgiskt område
- Sterilisera kirurgiska instrument och förnödenheter innan de används för kirurgi och lägger ut på kirurgiska dynan för sterilitet. De flesta instrument och tillbehör kan autoklaveras och återanvändas.
- Använd sterila handskar för alla kirurgiska ingrepp.
- Använd en rakhyvel för att raka pälsen bort från djurets högra sida. Räffla djuret från botten av ribbburet till toppen av bakbenet och ge ett stort hårfritt område för snittet.
- Placera djuret på en steril kirurgisk kudde för att isolera det desinficerade området från omgivande områden.
- Skrubbe huden med ett desinfektionsmedel som povidonjod eller betadin. Börja skrubbningen i mitten av den kirurgiska sidan och flytta utifrån på ett cirkulärt sätt. Upprepa minst tre gånger med en ny torkning av povidonjod eller betadin. Skruva den kirurgiska platsen med 70% alkoholpipor tills huden är klar, eftersom jod kan vara giftigt om det absorberas.
3. kirurgisk procedur
- Underhålla detta förfarande under aseptiska förhållanden.
- Placera det bedövade djuret på en varm uppvärmningsbädd i vänster lateral decubitusposition med höger flank uppåt.
OBS: Försiktighet måste vidtas för att hålla djurets kärnkroppstemperatur vid 35-37 ° C för att förhindra hypotermi. Denna uppvärmningsbädd bör också steriliseras vid behov för att upprätthålla aseptiska förhållanden. - Känn för ribbburet och gör en liten 2-3 cm höger dorsal retroperitoneal snitt med en steril storlek 10 skalpellblad som börjar längst ner i ribbburet.
- Placera steril gasbind i längdriktningen längs varje sida av snittet.
- Dissektera den subkutana vävnaden, fettet och musklerna för att visualisera och komma åt bukhålan. Använd krökbladad Mayo sax för att tillåta djupare penetreringRation till sår och skära tjocka vävnader.
- När levern är tydligt synlig och tillgänglig, använd trubbiga tångar för att dra upp levern uppåt.
- Använd ett annat par stumpar i den andra handen, exponera den högra njuren så att den sitter strax utanför bukhålan.
- Använd pekfingret och tummen på vänster hand för att hålla njuren i position. Med den högra handen injiceras långsamt och stadigt 0,1 ml UTI89 E. coli lösning (koncentration mellan 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) från en steril spruta till njurskyddet (som framträder som en vit bubbla) 15 .
OBS: Förbered bakterietiter som beskrivs i referens 15 . - Placera en remsa av absorberbar hemostat över nålen för att förhindra utflöde av ymp i bukhinnan. Dra långsamt nålen ur njurbäckenet.
OBS: Försiktighet bör vidtas för att inte genomborra eller infektera omgivande vävnader vilket resulterar i off-target infectiOns och / eller komplikationer. - Använd en större spruta för att noggrant skölja njurarna med normal saltlösning innan du placerar den tillbaka i bukhålan.
4. Suturer
Obs! Sutur som ska begravas i vävnader bör vara 4-0 icke-absorberbara flätade suturer. Absorberbara eller monofilament suturer kan användas för kroppsytor.
- Placera suturerna jämnt och så nära vävnadskanten som möjligt för att förhindra blockering av blodflödet. Typiskt inte mer än 0,3 cm från kanten är nödvändig.
- Ta tag i huden och ta det något med hjälp av ett par fintandade tångar och vrid nålhållaren i ett utspänt läge för att genomborra huden.
- Kör nålen genom hela tjockleken av huden genom att supine handleden för att rotera nålen och skicka den genom huden.
- Upprepa denna process för hudkanten närmast den som utför proceduren.
- SpännaSuturerna är tillräckliga för att motverka vävnadskanterna. Varje strängare kommer att hindra blodtillförseln, långsam sårläkning och kan leda till avbrott.
- Slå av suturen med kvadratknutar, som om det var en enkel avbruten söm, förutom att endast den korta strängen är skuren och lämnar en 3-4 mm svans.
- När den första sömmen är bundet av, förbered dig för att placera en andra sömnad ca 3 mm från den första och fortsätt löpande suturen.
- När slutet av snittet nås, dra inte den sista sömmen helt igenom. Använd i stället slingan som hålls med nålhållaren här som den korta strängen för att binda bort den distala änden av suturluckan.
- Slå av suturen med fyrkantiga knutar med hjälp av instrumentband. Detta resulterar i 3 strängar som sticker upp från den färdiga knuten vid den distala änden.
5. Återvinning av djur
- Injicera 2,1 mg / kg yohimbin intraperitonealt efter operation för att omvända anestesi. enNimaler förväntas fullständigt återhämta sig från det kirurgiska förfarandet efter 3-5 timmar.
- Håll djuret på en värmepanna (för att undvika hypotermi) och absorberande mjuka sängar efter operationen.
- Ge rehydrering med orala eller parenterala vätskor tills det kan återgå till normal matning (inom 24 timmar). Injicera cirka 0,6 ml normal saltlösning peritonealt omedelbart efter operationen för att begränsa dehydreringseffekterna.
- Ge analgesi enligt beskrivningen i IACUC-godkänt djurhållnings- och användningsprotokoll. Injicera 5 mg / kg carprofen subkutant för smärtlindring.
- Övervaka insnitt regelbundet för svullnad, exsudat, smärta eller dehiscens.
6. Validering via magnetisk resonansbildning
- Utför i n vivo MR-experiment på MRRI-skannrar med högfältet småfält.
- Inducera anestesi med 3% isofluran i syre och placera djuret med rätt njure vid isocenter i MR-scannern och lämpligÅt radiofrekvensspolen. Ge djur med 1-2% isoflurananestesi kontinuerligt under bildbehandling genom en nosekon.
OBS! För de in vivo MR-bilder som visas i Figur 1 användes en råttstorleksvolymspole (innerdiameter = 72 mm). - Använd ett djurövervaknings- och kontrollsystem för att bibehålla varje djurs respirationshastighet (40-60 andetag / min) och kärnkroppstemperatur (35 ± 1 ° C).
- Använd ett multi-skiva, multi-echo spin echo MRI-förvärv för att få högupplösta, axiella T2-viktiga bilder av både de infekterade och kontrollna njurarna. Typiska MRI-förvärvsparametrar är repetitionstid = 5 000 msek, ekotid = 40 msek, skivtjocklek = 2,0 mm, rymdupplösning i planet = 200 μm, 3 signalmedelvärden och en förvärvstid på 8 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medicinsk bildteknik erbjuder möjligheten att inte-invasivt bedöma UTI och terapeutisk effekt. Därför var MRI användas för att validera induktion av akut infektion efter injektion av 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli och för att visualisera förändringar i njurarna före och efter operationen. Figur la-b visar en progressivt ökande region av njursinfektion (gula pilar). MRI-bilder som erhållits för varje djur vid dag 1 och 4 efter infektionshjälp karakteriserar tillväxten av den akuta pyelonefritinfektion.
Figur 1: Axial T1-vägd MR-bilder från en E. coli- inducerad gnagaremodell av pyelonefrit vid ( a ) Dag 1 och ( b ) Dag 4 efter infektion (gula pilar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stigande akut pyelonefrit hos gnagare (dvs. möss och råttor) kan produceras genom transuretral kateterisering. 16 , 17 , 18 Denna transuretrala infektionsmetod är fördelaktig genom att den är icke-invasiv och efterliknar den mänskliga patofysiologin av stigande infektion. 17 , 18 , 19 , 20 Denna metod kan emellertid också leda till oregelbundna infektionshastigheter och varierande E. coli dosering till njuren på grund av fysiologiska begränsningar såsom voiding och anatomisk variation. 11 Fierer et al. (1971) rapporterade 6 av 40 (15%) rått njure som visar bevis på pyelonefrit efter infusion av E. coli i blåsan. 15 Vidare upprepades infusioner av E. coli krävs flera gånger i veckan för att ReliProducerar förmånligt pyelonefrit. 15 , 19
I denna rapport beskriver vi en alternativ gnagare pyelonefritmodell som kirurgiskt introducerar E. coli direkt i njurbäckenet. Den främsta fördelen med den kirurgiska modellen av pyelonefritisk teknik innefattar administrering av en konsekvent dos av E. coli- koncentration mellan 1 x 10 8-1 x 10 9 samt injektion av bakterierna på samma anatomiska plats (höger njurbäck) för varje djur. 15 Denna direkta injektion undviker kravet på återflöde som ger en mer tillförlitlig infektion samt en mer exakt bestämning av injicerad dos. Sammantaget ger denna kirurgiska pyelonefritmodell ett alternativ till studier som kräver konsekvent reproducerbar infektion med minimal inverkan av uretrisk reflux.
Optimera framgången för denna kirurgiska teknik inkluderar:1) uppnå en djupbedövning för att begränsa andningsrörelsen och tillåta tillräcklig arbetstid 2) raka området för kirurgisk snitt för att förhindra kontaminering från icke-prepped områden; 3) sterilisering för att förhindra införande av förorening 4) noggrann injektion av en känd dos av E. coli i råtta njursbältet; 5) noggrann saltlösning sköljning av njuren efter injektionen 6) nära approximation av sårkanter via suturer; Och 7) övervakning av intraoperativa och postoperativa komplikationer såsom hypotermi och systemiska biverkningar. Fastän en värmepanna användes för att förbättra djurkomforten, kan detta protokoll optimeras vidare med användning av en rektaltemperatursensor för att upprätthålla kärnkroppstemperaturen. Ett viktigt steg för att uppnå en framgångsrik överlevnadskirurgi är korrekt anestesi och övervakning av djurets andning. Underlåtenhet att göra det resulterar i förlängda kirurgiska tider för att stabilisera djurets narkosnivå och begränsa oönskade skador på grund av överdrivenrörelse. Kompromisserad sterilitet i arbetsområdet och / eller oavsiktlig infektion i peritoneum med E. coli- bakterier är också vanliga komplikationer i samband med den kirurgiska modellen. Därför hjälper adekvat förberedelse till autoklaver kirurgiska verktyg, att sterilisera hela arbetsytan och procedurella ansträngningar för att begränsa ytterligare E. coli- infektioner allt för att minimera djurdödligheten såväl som felaktiga infektionsresultat.
Trots fördelarna med den direkta injektionen av E. coli i njuren har denna kirurgiska modell av pyelonefrit också flera begränsningar i jämförelse med transuretralleveransmetoden. Den största nackdelen med att använda den direkta kirurgiska injektionsmetoden är den inneboende invasiviteten hos tekniken. Dödligheten är dock avsevärt låg med genomförandet av en ordentlig steril teknik och användning av adekvat smärtlindring, temperaturkontroll via värmekuddar och mjukt absorberande sängkläder efter operationen tillSäkerställa snabb återhämtning. Dessutom är autoklaverande kirurgiska verktyg för sterilisering en extremt tillförlitlig och kostnadseffektiv metod för sterilisering. Den totala kirurgiska tiden är normalt mindre än 1 h. Dessutom ger administrationen av anestesi, såväl som lokal och systemisk leverans av smärtstillande medel som kalibrerats till kroppsvikt, säkerställande av korrekt dosering och ämnessäkerhet. En annan potentiell begränsning i den kirurgiska modellen är att kirurgiska tekniker är svårare hos möss på grund av de mindre anatomiska storlekarna. I motsats till den transuretrala metoden som kan implementeras hos både råttor och möss ökar kravet på att använda råttmodeller för den kirurgiska modellen den totala kostnaden för studien och kan begränsa studien av olika genetiska förändringar som kan vara mer lättillgängliga Och kostnadseffektiva i musmodeller. Som nämnts ovan är en annan väsentlig begränsning av den kirurgiska metoden att den inte representerar mänsklig pyelonefrit somNära som transuretral metod.
Här använde vi MR-tekniker för att spåra njurinfektionerna. Såsom visas i figur 1 ger MR-skanning möjligheten att icke-invasivt övervaka njursinfektionerna över tiden. Ett alternativt sätt att spåra E. coli- infektioner är genom fluorescerande märkning av bakterierna. 11 , 18 Emellertid är fluorescerande avbildning mindre effektiv i denna råttmodell (i motsats till musmodeller) på grund av ljusabsorption genom vävnaden vilket resulterar i kraftigt reducerad detekteringskänslighet. MRI ger därför ett mer känsligt sätt att spåra E. coli- infektioner i de tidigaste stadierna och att ge regional information om infektionens omfattning i tre dimensioner.
Mekanismerna för UTI / akut pyelonephritispatofysiologi och progressionen mot njurfibros är dåligt förstådda. Smittämnena, de underLiggande immunologiskt värdrespons och inflammatoriska reaktioner spelar en integrerad roll, men betydelsen av var och en är okänd. Förbättringen av målinriktad leverans av bakterier till njuren med hjälp av denna direkta injektionsprocedur har potential att öka reproducerbarheten hos akut pyelonefrit hos gnagaremodeller, och kanske mer noggrant utvärdera terapeutiska ingrepp i tidigt stadium för behandling av UTI. Denna metod initierades ursprungligen som ett tillvägagångssätt för att optimera leveransen av bakterier till njuren, men har även applicering för leverans av andra reagens och patogener. Denna metod kan på liknande sätt erbjuda fördelar med studier av cystit, pyelonefrit, UTI och diabetes njursjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
