Introduction
Los modelos de roedores se han utilizado para estudiar numerosas manifestaciones de la enfermedad humana, incluyendo pielonefritis e infecciones del tracto urinario (ITU). Las IU son un problema de salud global y pueden afectar a niños, hombres y mujeres de todas las edades. 1 , 2 , 3 La manifestación inicial de las IU incluye cistitis, y si la infección asciende a lo largo del uréter, puede aparecer una infección renal (pielonefritis). Al mismo tiempo, la prevalencia de la diabetes se aproxima a 400 millones de personas en todo el mundo. 4 , 5 Es importante destacar que la incidencia de UTI puede ser hasta 4 veces mayor en pacientes obesos o con diabetes mellitus tipo 2, lo que aumenta el riesgo de infección recurrente por ITU (rUTI), sepsis, fibrosis renal por pielonefritis y disfunción vesical. 6 , 7 , 8 RoedorLos modelos son importantes en el estudio de las ITU, porque las actuales terapias con antibióticos producen una respuesta sostenida y preventiva sólo en un subconjunto de pacientes con IU. Para mejorar el cuidado clínico de la UTI, los pasos clave son entender el mecanismo de rUTI y sus procesos fisiopatológicos de la infección aguda a la inflamación a la fibrosis, así como el impacto de la diabetes mellitus tipo 2.
El objetivo de mejorar los modelos animales es desarrollar técnicas que permitan una evaluación más precisa de la progresión de la enfermedad y las intervenciones terapéuticas. Se han empleado varios enfoques diferentes para inducir pielonefritis en ratas y / o ratones para estudiar la fisiopatología del daño renal, el efecto del tratamiento antibiótico y otros aspectos del curso natural de las ITU. Un enfoque común para establecer UTI retrógrada es el cateterismo transuretral. 10 , 11 , 12 , 13 <Este método introduce bacterias a través de la uretra en la vejiga urinaria de animales anestesiados. Si bien esta técnica simula de cerca la pielonefritis humana, la incidencia real y la magnitud de la infección pielonefritis puede ser muy variable debido a múltiples factores, incluyendo la falta de reflujo ureteral espontáneo o urinario micción durante o inmediatamente después de la inoculación. 11 Como resultado, la variabilidad experimental en la inducción de una infección pielonefritis ascendente puede limitar la utilidad de este modelo para estudiar infecciones de los riñones, así como estrategias terapéuticas.
Este informe describe un modelo de rata de pielonefritis quirúrgica donde E. coli se inyecta directamente en el riñón de rata. A pesar de que este modelo de rata es invasivo, la cantidad de E. coli suministrada al riñón puede controlarse eficazmente permitiendo una infección renal robusta e inflamación. 14 Dentro de este procedimiento, también describimosCómo estas infecciones renales inducidas pueden ser monitoreadas longitudinalmente con Imágenes de Resonancia Magnética in vivo (MRI).
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Protocol
Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados del Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucionales (IACUC) en Case Western Reserve University. La duración del procedimiento quirúrgico descrito a continuación es de aproximadamente 45-60 min. El procedimiento de MRI en sí es de aproximadamente 15 minutos para cada punto de tiempo.
1. Anestesia
- Anestesiar la rata en una cámara de isoflurano fijada al 2% de isoflurano mezclado con oxígeno para facilitar el manejo y retención de los animales antes de administrar la anestesia inyectable intraperitonealmente.
- Después de 3-5 minutos de exposición al isoflurano, compruebe que el animal está anestesiado y no muestra ninguna respuesta al pellizcado.
- Además, sedar a la rata con una inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina y ketamina: 75 mg / kg de ketamina / 10 mg / kg de xilazina. Cuando realice inyecciones intraperitoneales, retire la aguja para asegurarse de que las porciones del intestino u otros órganos vitales no hayan sido perforadas.
- yoInyectar 2 mg / kg de bupivacaína por vía subcutánea en el sitio de la incisión para proporcionar alivio tópico del dolor.
2. Preparación del área quirúrgica
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y los suministros antes de que se usen para la cirugía y colocar en la almohadilla quirúrgica para la esterilidad. La mayoría de los instrumentos y suministros pueden autoclavarse y reutilizarse.
- Use guantes estériles para todos los procedimientos quirúrgicos.
- Use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar la piel del lado derecho del animal. Afeitar el animal desde el fondo de la caja torácica hasta la parte superior de la pata trasera, proporcionando un gran área sin pelo para la incisión.
- Coloque el animal sobre una almohadilla quirúrgica estéril para aislar el área desinfectada de las áreas circundantes.
- Frote la piel con un desinfectante como povidona yodada o betadina. Comience el lavado en el centro del sitio quirúrgico y muévase al exterior en una manera circular. Repita al menos tres veces con un nuevo trapo de yodo povidona o betadina. Fregar el sitio quirúrgico con algodón con alcohol 70% hasta que la piel está clara, ya que el yodo puede ser tóxico si se absorbe.
3. Procedimiento quirúrgico
- Mantener este procedimiento bajo condiciones asépticas.
- Coloque el animal anestesiado en un lecho calentador caliente en posición de decúbito lateral izquierdo con el flanco derecho hacia arriba.
NOTA: Se debe tener cuidado de mantener la temperatura corporal del animal a 35-37 ° C para prevenir la hipotermia. Esta cama de calentamiento también debe esterilizarse según sea necesario para mantener condiciones asépticas. - Sentirse por la caja torácica y realizar una pequeña incisión retroperitoneal dorsal derecha de 2-3 cm con una cuchilla de bisturí estéril de tamaño 10 que comienza en la parte inferior de la caja torácica.
- Coloque gasa estéril longitudinalmente a lo largo de ambos lados de la incisión.
- Diseccionar el tejido subcutáneo, la grasa y los músculos para visualizar y acceder a la cavidad abdominal. Utilice las tijeras Mayo de hoja curvada para permitir una penetración más profundaRación en la herida y cortar tejidos gruesos.
- Una vez que el hígado es claramente visible y accesible, use fórceps romos para retraer el hígado hacia arriba.
- Usando otro par de fórceps romos en la otra mano, exponga el riñón derecho para que se sienta justo fuera de la cavidad abdominal.
- Utilice el dedo indicador y el pulgar de la mano izquierda para mantener el riñón en posición. Con la mano derecha, inyectar lenta y firmemente 0,1 ml de solución de E. coli UTI89 (concentración entre 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) desde una jeringa estéril hasta la pelvis renal (que aparece como una burbuja blanca) 15 .
NOTA: Preparar el título bacteriano como se describe en la referencia 15 . - Coloque una tira de hemostasis absorbible sobre la aguja para evitar la salida del inóculo al peritoneo. Lentamente jale la aguja de la pelvis renal.
NOTA: Debe tenerse cuidado de no perforar o infectar los tejidos circundantes resultando en infecciones fuera deOns y / o complicaciones. - Use una jeringa más grande para enjuagar completamente el riñón con solución salina normal antes de volver a colocarla en la cavidad abdominal.
4. Suturas
Nota: La sutura que será enterrada en los tejidos debe ser 4-0 suturas trenzadas no absorbibles. Se pueden usar suturas absorbibles o monofilamento para superficies corporales.
- Coloque las suturas de manera uniforme y tan cerca del borde del tejido como sea posible para evitar la obstrucción del flujo sanguíneo; Típicamente no más de 0,3 cm del borde es necesario.
- Agarre la piel y retírela ligeramente usando un par de fórceps dentados finos, y gire el soporte de la aguja en una posición pronada en preparación para perforar la piel.
- Conduzca la aguja a través del espesor total de la piel supinando la muñeca para girar la aguja y pasarla a través de la piel.
- Repita este proceso para el borde de la piel más cercano al individuo que realiza el procedimiento.
- ApretarLas suturas lo suficiente como para oponerse a los bordes de los tejidos. Cualquier restricción obstruirá el suministro de sangre, cicatrización lenta de la herida y puede resultar en dehiscencia.
- Sujete la sutura con nudos cuadrados, como si fuera una simple puntada interrumpida, excepto que sólo se cortó la hebra corta, dejando alrededor de una cola de 3-4 mm.
- Después de haber atado la primera puntada, prepárese para colocar una segunda puntada a unos 3 mm de distancia de la primera, y continúe con la sutura en marcha.
- Una vez que se ha alcanzado el final de la incisión, no tire completamente de la última puntada. En su lugar, utilice el lazo que se mantiene con el soporte de la aguja aquí como el cordón corto con el fin de amarrar el extremo distal del cierre de la sutura.
- Usando los lazos del instrumento, atar la sutura usando nudos cuadrados. Esto da lugar a 3 hilos que sobresalen del nudo completo en el extremo distal.
5. Recuperación de animales
- Inyectar 2,1 mg / kg de Yohimbina intraperitonealmente después de la cirugía para revertir la anestesia. UNSe espera que los nimales se recuperen completamente del procedimiento quirúrgico después de 3-5 h.
- Mantenga el animal en una almohadilla de calentamiento (para evitar la hipotermia) y ropa de cama blanda absorbente después de la cirugía.
- Proporcionar rehidratación con líquidos orales o parenterales hasta que pueda volver a la alimentación normal (dentro de las 24 horas). Inyectar aproximadamente 0,6 ml de solución salina normal peritonealmente inmediatamente después de la cirugía para limitar los efectos de la deshidratación.
- Proporcionar analgesia como se describe en el IACUC aprobado Animal Care and Use Protocol. Inyectar 5 mg / kg de carprofeno por vía subcutánea para el tratamiento del dolor.
- Monitorear las incisiones con regularidad por hinchazón, exudado, dolor o dehiscencia.
6. Validación mediante Imágenes de Resonancia Magnética
- Realización de experimentos de resonancia magnética en vivo en escáneres de RMN de animales pequeños de alto campo.
- Inducir la anestesia con isoflurano al 3% en oxígeno y colocar al animal con el riñón derecho en el isocentro en el escáner de RM y apropiarseBobina de radiofrecuencia. Proporcionar a los animales con 1-2% de anestesia de isoflurano continuamente durante el procedimiento de imagen a través de una nosecone.
NOTA: Para las imágenes de IRM in vivo mostradas en la Figura 1 , se utilizó una bobina de volumen de tamaño de rata (diámetro interior = 72 mm). - Use un sistema de monitoreo y control de animales para mantener la tasa de respiración de cada animal (40-60 respiraciones / min) y la temperatura corporal central (35 ± 1 ° C).
- Utilice una adquisición de resonancia magnética de eco de spin multi-rebanada y multi-eco para obtener imágenes axiales de alta resolución en T2 de los riñones infectados y de control. Los parámetros típicos de adquisición de MRI son el tiempo de repetición = 5.000 ms, el tiempo de eco = 40 ms, el grosor de corte = 2.0 mm, la resolución espacial en el plano = 200 μm, 3 medias de señal y un tiempo de adquisición de 8 min.
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Representative Results
Las técnicas de imagen médica ofrecen la oportunidad de evaluar de forma no invasiva la IU y la eficacia terapéutica. Por lo tanto, la resonancia magnética se utilizó para validar la inducción de infección aguda después de la inyección de 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli , y para visualizar los cambios en el riñón antes y después de la cirugía. La Figura 1a-b muestra una región progresivamente creciente de la infección renal (flechas amarillas). Las imágenes de RM obtenidas para cada animal en los días 1 y 4 después de la infección ayudan a caracterizar el crecimiento de la infección por pielonefritis aguda.
Figura 1: Imágenes RMR axiales ponderadas en T1 de un modelo de roe- dor de pielonefritis inducido por E. coli en ( a ) Día 1 y ( b ) Día 4 después de la infección (flechas amarillas).
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Discussion
La pielonefritis aguda ascendente en roedores (es decir, ratones y ratas) puede ser producida por cateterización transuretral. 16 , 17 , 18 Este método de infección transuretral es ventajoso porque no es invasivo y imita la fisiopatología humana de la infección ascendente. 17 , 18 , 19 , 20 Sin embargo, este método también puede sufrir de tasas de infección irregulares y dosis variables de E. coli en el riñón debido a limitaciones fisiológicas tales como micción y variación anatómica. 11 Fierer et al. (1971) informaron que 6 de 40 (15%) de riñones de rata mostraban evidencia de pielonefritis después de la infusión de E. coli en la vejiga. 15 Además, repetidas infusiones de E. coli se requerían varias veces a la semana para reliPueden producir pielonefritis. 15 , 19
En este informe, describimos un modelo alternativo de pielonefritis de roedores que introduce quirúrgicamente E. coli directamente en la pelvis renal. El principal beneficio del modelo quirúrgico de la pielonefritis incluye la administración de una dosis consistente de E. coli entre 1 x 10 8 - 1 x 10 9 , así como la inyección de las bacterias en el mismo sitio anatómico (pelvis renal derecha) para cada una animal. 15 Esta inyección directa evita el requisito para el reflujo proporcionando una infección más fiable, así como una determinación más precisa de la dosis inyectada. En general, este modelo de pielonefritis quirúrgica proporciona una opción alternativa para los estudios que requieren una infección consistente y reproducible con un impacto mínimo de reflujo uretral.
La optimización del éxito de esta técnica quirúrgica incluye:1) lograr una anestesia profunda para limitar el movimiento respiratorio y permitir un tiempo de trabajo suficiente; 2) afeitar el área de la incisión quirúrgica para prevenir la contaminación de áreas no preparadas; 3) esterilización para evitar la introducción de contaminación; 4) inyección cuidadosa de una dosis conocida de E. coli en la pelvis renal de rata; 5) enjuague salino a fondo del riñón después de la inyección; 6) aproximación cercana de los bordes de la herida a través de suturas; Y 7) monitoreo de complicaciones intraoperatorias y postoperatorias tales como hipotermia y efectos secundarios sistémicos. Aunque se usó una almohadilla calefactora para mejorar la comodidad animal, este protocolo puede optimizarse adicionalmente usando un sensor de temperatura rectal para mantener la temperatura corporal central. Un paso clave para lograr una cirugía de supervivencia exitosa es la anestesia adecuada y la supervisión de la respiración del animal. De lo contrario, se prolongarán los tiempos quirúrgicos para estabilizar el nivel de anestesia del animal y limitar las lesiones no deseadas debidas a un excesomovimiento. La esterilidad comprometida de la región de trabajo y / o la infección no deseada del peritoneo con bacterias de E. coli también son complicaciones comunes asociadas con el modelo quirúrgico. Por lo tanto, la preparación adecuada para autoclave de herramientas quirúrgicas, para esterilizar todo el espacio de trabajo, y los esfuerzos de procedimiento para limitar las infecciones adicionales de E. coli ayudan a minimizar la mortalidad animal, así como resultados de la infección errónea.
A pesar de los beneficios de la inyección directa de E. coli en el riñón, este modelo quirúrgico de pielonefritis también tiene múltiples limitaciones en comparación con el método de administración transuretral. El mayor inconveniente de usar el enfoque de inyección quirúrgica directa es la invasividad inherente de la técnica. Sin embargo, la mortalidad es considerablemente baja con la aplicación de una técnica estéril adecuada y el uso de un manejo adecuado del dolor, el control de la temperatura a través de almohadillas de calefacción, y ropa de cama blanda absorbente post-cirugía aGarantizar una rápida recuperación. Además, las herramientas quirúrgicas en autoclave para la esterilización son un método extremadamente fiable y rentable para la esterilización. El compromiso de tiempo quirúrgico general suele ser inferior a 1 h. Además, la administración de anestesia, así como la administración local y sistémica de medicamentos para el dolor calibrados con respecto al peso corporal, garantiza la administración precisa de la dosis y la seguridad del sujeto. Otra limitación potencial en el modelo quirúrgico es que las técnicas quirúrgicas son más difíciles en ratones debido a los tamaños anatómicos más pequeños. En contraste con el método transuretral que se puede implementar en ratas y ratones, el requisito de usar modelos de rata para el modelo quirúrgico aumenta el costo total del estudio y puede poner restricciones en el estudio de diversas alteraciones genéticas que pueden estar más fácilmente disponibles Y rentable en modelos de ratón. Como se mencionó anteriormente, otra limitación significativa del método quirúrgico es que no representa pielonefritis humana comoEstrechamente como el método transuretral.
En este sentido, usamos técnicas de IRM para rastrear las infecciones renales. Como se muestra en la Figura 1 , el escaneo por RM proporciona la capacidad de monitorear de manera no invasiva las infecciones renales a lo largo del tiempo. Un enfoque alternativo para el seguimiento de las infecciones por E. coli es mediante el etiquetado fluorescente de las bacterias. 11 , 18 Sin embargo, la formación de imágenes fluorescentes es menos eficaz en este modelo de rata (en oposición a los modelos de ratón) debido a la absorción de luz por el tejido, lo que resulta en una sensibilidad de detección enormemente reducida. Por lo tanto, la RM proporciona un medio más sensible para rastrear las infecciones por E. coli en sus etapas más tempranas y para proporcionar información regional sobre el grado de la infección en tres dimensiones.
Los mecanismos de UTI / pielonefritis aguda patofisiología, y la progresión a la fibrosis renal son poco conocidos. Los agentes infecciosos, losY las reacciones inflamatorias desempeñan un papel integral, pero la importancia de cada una de ellas es desconocida. La mejoría en la administración selectiva de bacterias al riñón mediante este procedimiento de inyección directa tiene el potencial de aumentar la reproducibilidad de la pielonefritis aguda en modelos de roedores y, quizás, de evaluar con mayor precisión las intervenciones terapéuticas en estadio temprano para el tratamiento de la ITU. Este método se desarrolló inicialmente como un enfoque para optimizar el suministro de bacterias al riñón, pero también tiene aplicación para el suministro de otros reactivos y patógenos. Este método puede ofrecer beneficios similares a los estudios de cistitis, pielonefritis, IU y enfermedad renal diabética.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
- Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
- Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
- Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
- Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
- Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
- Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
- Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
- Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
- Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
- Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
- Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
- Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
- Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
- Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
- Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
- Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
- Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
- Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
- Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).
