Summary
מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.
Abstract
נוירונים arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (דה) הם מודל פופולרי על חקירת מנגנוני המורפוגנזה העצבית. נוירונים דה להתפתח תקשורת עם תאי אפידרמיס הם מעצבבים ובכך יתרונות הניתוח שלהם להדמיה באתרו של שני החלבונים הביעו neuronally ו epidermally ידי immunofluorescence. שיטות מסורתיות של הכנת פילת זחל לניסויי immunofluorescence להשאיר על כנו את רקמת השריר שמכסה את רוב קיר הגוף, הצגת מספר אתגרי הדמית חלבונים עצביים ו אפידרמיס. כאן אנו מתארים שיטה להסרת רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר יחס אות לרעש, ומקל על שימוש במיקרוסקופ ברזולוצית סופר ללמוד דה פיתוח נוירון.
Introduction
נוירונים arborization הדנדריטים זחל תסיסנית (da) לספק מודל ערך ללימוד פיתוח עצבי בשל amenability שלהם מניפולציה גנטית ואת הקלות שבה הם יכולים להיות צלמו. עצב סנסורי אלה כבר סייע בזיהוי מסלולים רבים השולטים דנדריט morphogenesis 1-3.
ארבע כיתות של דה נוירונים (אני בכיתה - IV) המעצבבים האפידרמיס הזחל. נוירונים אלה שיוותרו בין קרום במרתף ואת האפידרמיס, עם הדנדריטים שלהם ויוצרים מערכים דו מימדי בעיקר 4,5. של ארבע כיתות, נוירונים דה IV סוג יש סוכות מסועפת מאוד ביותר, כמו עצב סנסורי של בעלי חיים אחרים, פירוט של סוכות אלה מחייב גורמים פנימיים כמו גם רמזים מרקמות שכנות, במיוחד האפידרמיס, להתפתחותם 6-9 .
מחקרים כדי לקבוע כיצד כגון עצבי עובדה נוספת עצביתORS לשלוט תועלת המורפוגנזה דנדריט מהיכולת לזהות ביטוי חלבון באתרו על ידי immunofluorescence. לציפורן החיצוני של הזחל הוא בלתי חדיר נוגדנים, אבל מניעה זו היא להתגבר בקלות על ידי הכנת פילת זחל באמצעות שיטות לנתיחה ומבוססות 10,11. עם זאת, רקמת השריר בגוף הקיר שנמצאה רק פנים אל הקרום במרתף מציגה מספר אתגרים כלפי להדמיה של נוירונים דה ותאי אפידרמיס. ראשית, רקמת השריר, אשר הקווים ביותר של קיר הגוף, מטשטשים אותות ניאון מאוד שמקורם ברקמה עצבית או אפידרמיס. זה מפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש במדגם. שנית, חלבונים רלוונטיים רבים עשויים לבוא לידי ביטוי ברקמת השריר כמו גם בתאי העצב או האפידרמיס. אותות קרינת נגזרות שריר זה עשוי זיהוי מעורפל נוסף של אות קרינה מן הנוירון או האפידרמיס. לבסוף, ההתקדמות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה לאהדמית יתר w של דגימות ברזולוצית המשנה דיפרקציה וכן עשויה להיות מועילה במיוחד הבחנת הלוקליזציה של חלבונים אשר מתבטאים בנוירונים והסביבה תא אפידרמיס 12,13. עם זאת, הדמיה באמצעות הטבות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מ איתות חזקה יחס רעש בסמיכות של המדגם כדי coverslip. בנוסף הפחתת יחס האות לרעש, מרחקי שריר קיר גוף הזחל דה נוירונים מן coverslip, וכך להגביל את רזולוציית תמונה המשופרת שניתן להשיג עם שיטות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה. מלבד אתגרים לניתוח immunofluorescence, רקמת שריר מציגה מחסום הקלטת אלקטרו מן עצב סנסורי בקיר גוף הזחל. הסרתו ולכן הטבות מניפולציה הנוירופיזיולוגיים של עצב סנסורי 14.
הנה שיטה להסרה ידנית של רקמת שריר זחל תסיסנית מתוארת. אנו מראים כי p הפרוטוקול שלנוהדמיה immunofluorescence ermits של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר את יחס אות לרעש להדמיה של נוירונים דה IV בכיתה, ומאפשר את השימוש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה להפלות יחסים מרחבית טובה יותר של חלבונים ומבנים הסלולר דה נוירונים האפידרמיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ההליך להסרת שריר (איור 1) הוא שינוי של שיטות שתוארו קודם לכן להכנת פילת זחל. השלבים שקודמים אחרי הסרת שריר מתוארים בקצרה ואת הקורא נקרא בעבודה קודמת 10, 11 לתיאורים מפורטים יותר.
1. לנתח זחל מלוח קר
- הכין דילול עובד של מלוחים HL3.1 הקרים 15 או Ca הקר 2 + ללא HL3.1 מלוח 11 (טבלה 1). מניחים את הזחל בצלחת אלסטומר סיליקון עם מי מלח קר מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של המנה.
הערה: ראה דיון לגבי הבחירה מלוחה.
| 1x HL3.1 מלוח (pH 7.2) |
| 5 HEPES מ"מ |
| 70 מ"מ NaCl |
| 1.5 מ"מ CaCl 2 (להשמיט עבור Ca 2+ מלוחים -חינם) |
| 4 מ"מ MgCl 2 |
| 10 מ"מ NaHCO 3 |
| 5 trehalose מ"מ |
| 115 סוכרוז mM |
| סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C |
| הערה: מחק רכב חרקי hemolymph |
רכב טבלת 1. קרה מלוחה.
- מקם את הזחל עם למעלה בצד הגחון. המשטח הגחון של הזחל יכול להיות מזוהה על ידי חגורות dentical הבטן בצד הגבי על ידי צינורות לקנה הנשימה הזחל העיקרי פועל מן הקדמי אל האחורי. מתחו את הזחל בכיוון הקדמי, האחורי ולהצמיד את הראש והזנב עלאלסטומר סיליקון לנתח צלחת באמצעות סיכות חרקים. השתמש במספריים לנתח בסדר לחתוך לאורך קו האמצע הגחון, החל בקצה אחד מתקדם לעבר הקצה השני.
הערה: כיוון זה משמר את האשכול הגבה למד הנפוצה של דה נוירונים. - לאחר הזחל הוא חתך פתוח, להצמיד מארבע כנפות כדי בצלחת לנתח כאילו לפתוח ספר. שימוש במלקחיים כדי לתפוס ולהסיר איברים פנימיים כולל מערכת העצבים המרכזית, המעיים, ואת קנה הנשימה. התאם סיכות חרקים כך הפילה מתוחה אבל לא נמתח מקסימאלי.
הערה: שרירים מעוגנים אל קיר הגוף בגבולות מגזריים. למרות שרירים המכסים את רוב קיר הגוף, הם נעדרים אזור צר ליד קו האמצע הגבה.
הסרת שרירים 2.
- אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת שריר תיאור. יישור שיניים מלקחיים אחת כזאת שזה יכול להיות מוכנס מתחת רקמת שריר בכיוון השטוח ביותר האפשרי.
- מתחיל בקו אמצע הגב, ליד הגבול הקדמי של המגזר, החלק בזהירות את שן המלקחיים בין השרירים האפידרמיס, מקפיד לצמצם מגע בין המלקחיים האפידרמיס.
- משוך את המלקחיים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור של השריר אל קיר הגוף בשלב עוגן אחד. חזור על תהליך זה עבור חמי קטע הנותרים (ים) של עניין.
הערה: פרוטוקול זה מייעל שימור האחורי של כל שדה דנדריט נוירון דה. כדי לשמר את החלק הקדמי של השדה דנדריט, עדיף להכניס את שן מלקחיים בקצה האחורי של כל פלח. - להתאים מחדש סיכות חרקים כך פילת הזחל נמתחה מקסימלי לכל הכיוונים.
- תקן את הפילה בזמן שהוא עדיין מוצמד אל הצלחת לנתח באמצעות פורמלדהיד 4% קרים, מוכן טרי PBS במשך 25 דקות.
- לשטוף 5 פעמים PBS.
- שימוש במלקחיים כדי להתרחק רקמות שריר בזהירות מנקודות העוגן הנותרים, מקפיד למזער contact עם האפידרמיס.
- ביטול הצמדה ולהסיר את פילה מצלחת לנתח לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בצע את כל הכביסה הבאה, חסימה, והצעדים המכתימים immunofluorescence, כפי שתואר לעיל 11.
3. רכב את פילת הזחל
- ראשית להסיר את הראש והזנב באמצעות מספריים לנתח גלם על מנת להפוך את המדגם שטוח ככל האפשר. הר פילה על coverslip ב antifade mountant עם המשטח הפנימי של פילה מול coverslip.
- מקום שקופית מיקרוסקופ על coverslip ולחץ בעדינות כדי לפזר את ההרכבה בינונית. תהפכו את השקופית מיקרוסקופ שוב לאטום את coverslip בשקופית באמצעות לק. ניתן לאחסן שקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו להדגים את התועלת של הליך ההסרה שריר לשיפור יחס אות לרעש בניסויים immunofluorescence לשתף לדמיין חלבונים צומת septate Coracle (קורה) ו דיסקים-גדול (DLG) יחד עם נוירונים דה IV בכיתה שכותרתו עם סמן קרום CD4- tdTomato.
קורה כבר השתמשו בעבר כדי לזהות שטחים שבהם דה דנדריטים נוירון מוקפים על ידי תאי אפידרמיס והוא אחד הגורמים אפידרמיס רבים זיהו כי נחקרו בשיתוף עם morphogenesis ותפקוד של דה נוירון דנדריטים 4,6-9,16. Immunostaining עם אנטי-DsRed לזהות הנוירונים (אדום) ו נוגדן אנטי קורה (ירוק) בוצעו על פילת זחל עם סיר שריר (שריר-off) ועם שרירים ללא פגע (שריר-על). עבור כל תנאי, בתחום דנדריט האחורי של הנוירון דה IV בכיתה היה צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר. תמונות התקבלו באמצעות idפרמטרי הדמית entical עבור שני המצבים. אנחנו גם צילמו שריר-על פילה באמצעות כוח לייזר גדל כדי לפצות על הפרעות מרקמת השריר.
בדגימות שריר פעמי, קורה ניתן היה לזהות בבירור גבולות התא אפידרמיס, בעלונים לסירוגין לאורך דנדריטים נוירון דה IV בכיתה, ומתאר סומה נוירון דה IV בכיתה (איור 2 ג). לעומת זאת, לוקליזציה שלה לתחומים אלה הוסתר בעיקר בשריר-על דגימות, גם כאשר כוח לייזר הוגדל (איור 2A-2B). בשריר-על דגימות, קורה היה דמיין בעיקר בשריר, קנה נשימה, בצומת neuromuscular (NMJ), אשר הופרדה קיר הגוף כתוצאה של הליך הסרת שריר. אות הקרינה הנובעת מרקמות אלה הסתירה רוב קורים שמתאים ל אפידרמיס גבולות תא כדי דנדריט שטחים, למעט ברצועה הצרה של הגוף wall ליד קו אמצע הגב, שבו שריר תיאור. קורה המתווה סומה נוירון דה המעמד הרביעי לא היה דמיינו בשריר-על דגימות (איור 2A-2B). ויזואליזציה של חלבונים הביעו epidermally שיש גם ביטוי שריר גבוה, כגון DLG, הנה חמורה במיוחד. בדגימות-על שריר, חלוקת DLG באפידרמיס כמעט מוסתרת לחלוטין על ידי קרינה מן השריר NMJ (איור 2 ד). לאחר הסרת השריר, DLG מזוהה בקלות על גבולות תא אפידרמיס, ב שטחים לסירוגין לאורך דנדריטים נוירון דה, ומתאר סומה נוירון דה IV בכיתה (איור 2E). לכן, הסרת שריר מאפשרת הדמיה של epidermally ו neuronally הביעו חלבונים אחרים מוסתרים על ידי שרירים ורקמות קשורות.
בנוסף, זה היה נראה כי עוצמת הקרינה של סמן נוירון דה IV בכיתה הופיעה מופחת בשריר-על פילהלעומת פילה פעמי שריר כאשר פרמטרי הדמיה התקיימו מתמיד בין שתי ההכנות המדגמות (איור 2 א, 2 ג). עם כוח לייזר גדל, עוצמת הקרינה לכאורה של הסמן נוירון דה IV בכיתה ניתן להתאים את דגימות-off שריר אבל רעשי רקע הוגדל (תרשים 2B, 2C). לכן, הסרת השריר ומשפרת את יחס אות לרעש בדגימות שלנו.
לבסוף, בדקנו אם השיפורים שנרכשו על ידי הסרת רקמת שריר יכולים להיות מיושמים על הדמיה של נוירונים דה IV בכיתה ברזולוצית משנה עקיפה. לשם כך, מיקרוסקופיה תאורה מובנהית 3D (SIM) ההדמיה בוצעה, אשר משיגה כ 120 רזולוציה לרוחב ננומטר 13. כמו הדמיה confocal, השווינו שריר-על ופילה שריר-off immunostained עבור קורה ומעמד IV נוירונים דה, הראשון בתנאים הדמיה זהים ואז אחרי אופטימיזציה כוח לייזר, ירידיזמן יור, ועיבוד תמונה עבור דגימות שריר-על. בדומה מיקרוסקופיה confocal, אות מופחתת באופן משמעותי יחס רעש ב-על שריר נצפתה לעומת פילת שריר-off (איור 3 א-3C). בנוסף, שחזור תמונה הופיע חדות בדגימות השריר-off. לעומת שריר-על דגימות, חפצים לכאורה פחות נצפו ולמסות דנדריט קורה נפתרו בקלות רבה יותר (איור 3 ב, 3 ג). ממברנות דנדריט יכול להימדד על כ 114 ננומטר רוחב פילה פעמי שריר אבל שנראה 272 ננומטר רחב בשריר-על פילה (איור 3D, 3E). לפיכך, הפרוטוקול שלנו מאפשר היישום של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר עד ראיה של נוירונים דה IV בכיתה.
באיור 1. סקירה כללית של הליך הסרת שרירים. זחל הוא גזור וצמיד על סיליקוןאלסטומר לנתח צלחת. כדי להסיר רקמת שריר, שיני מלקחיים אחד מוכנסות בין שכבת תאי שרירי אפידרמיס, החל קו האמצע הגיב ליד גבול קטע (2.2). המלקחיים הם משך כלפי מעלה כדי לשבור את הקובץ המצורף בין הקיר שריר בגוף (2.3). זה חוזר על עצמו עבור מגזרי עניין ולאחר מכן הזחל הוא קבוע בפורמלין (2.5). לאחר קיבוע, מלקחיים משמשים להפריד את רקמת השריר הנותרים מן הקיר הגוף (2.7 - 2.8) לציפורן הזחל האפידרמיס מתוארים בכתום, המעמד הרביעי נוירונים דה בירוק, והשרירים באדום. ריבועים ב (2.2) ו- (2.7) לייצג השקפות חתך של חמי קטע זחל יחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הסרת איור 2. שריריםמשפר Confocal הדמיה של דה נוירונים ואת אפידרמיס Immunofluorescence של קורה. (ירוק; AC) או DLG (ירוק; DE) זוהה עם רקמת שריר (A, B, D) וללא ברקמת השריר (C, E). IV המחלקה נוירונים דה תויגו באמצעות הנהג 477 'GAL4 להביע כטב"מ-CD4: tdTomato ואובחנו עם נוגדן אנטי dsRed (אדום). שריר-על דגימות שריר פעמי שכותרתו קורה הם צילמו הראשון עם מיקרוסקופ confocal בתנאים זהים (A, C) ולאחר מכן עם כוח לייזר גדל כדי לפצות על הפרעות שריר (B). שריר-על דגימות שריר פעמיות שכותרתו עבור DLG הם צלמו בתנאים מותאמים באופן אינדיבידואלי. כל התמונות הן-תחזיות Z confocal. באמצע (ירוק) והתחתון (אדום) לוחות להראות ערוצים בודדים; הלוחות העליונים הם הערוצים התמזגו. הגבול של רקמת השריר (קווים מקווקווים), המעמד הרביעיסומה נוירון דה (חיצי ציאן), קורה DLG דנדריט שטחים (חצים לבנים), גבולות תא אפידרמיס (חיצי מג'נטה), NMJ (חיצים צהובים), ואת קנה נשימה (חצים כתומים) מסומנים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הסרת שרירים מאפשר סופר-רזולוציה של הדמיה של דה נוירונים ותאי עוריות. זיהוי Immunofluorescence של קורה (ירוק) בנוירונים דה IV בכיתה עם שרירים ללא פגע (A, B) ואחרי הסרת השריר (C). IV המחלקה נוירונים דה תויגו כמו באיור 2 שריר-על ושרירים פעם דגימות הם צלמו עם מיקרוסקופ תאורה מובנית הראשון בתנאים זהים (A, C).; מדגם השריר-עלב (א) היה מחדש צילמו אז עם זמני חשיפה וכוח לייזר גדל כדי לפצות על הפרעות שריר (B). כל התמונות הן-תחזיות Z. באמצע (ירוק) ותחתון (אדום) לוחות של AC להראות ערוצים בודדים. הפאנל העליון של AC הוא מיזוג. עוריות גבולות תא (חיצי מג'נטה), קטעי דנדריט קורה (חצים לבנים), ואת חפץ שחזור תמונה (חץ צהוב) מסומנים. ריבועי הפנלים בתחתית B ו- C מתאימים D ו- E, בהתאמה. רוחב לכאורה של קרום דנדריט מוצג שריר-על (D) ושריר פעמי דגימות (E). ברי סולם = 3 מיקרומטר (AC) ו -0.5 מיקרומטר (D, E). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה פרוטוקול מתואר על הסרה ידנית של רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה משנה תאר טכניקות לנתיחת זחל בעבר 10,11. לאחר הזחל גזור בצלחת אלסטומר סיליקון, קו אמצע הגב ממוקם. ראש חץ מלקחיים יחיד, באורינטציה האפשרית השטוח שלה, מוכנס בזהירות בין רקמת השריר ואת האפידרמיס, ליד קו האמצע הגבה. המלקחיים בעדינות נמשכים כלפי מעלה כדי רקמת שריר נפרדת מן נקודת עוגן אחד בכל מגזר זחל של עניין. פילה הזחל הוא קבוע אז בפורמלין קר שלאחריו מלקחיים המשמשים שוב למשוך את השריר מנקודות העוגן הנותרים.
למרות שזה מפתה לבצע את המכלול שלאחר קיבוע הליך הסרת שריר, אנו מוצאים כי שריר נמתח שתיקונה נשאר שטוחי apposed דוק האפידרמיס גם לאחר ניתוק נקודה עוגנת, טיוחזה קשה לתפעל מבלי לפגוע ברקמה הבסיסית. בנוסף, הניסיון שלנו, רקמת שריר קבועה היא שבירה ודמעות בקלות, למנוע הסרה המלאה שלה מקיר הגוף. לעומת זאת, כאשר השריר הוא מנותק מן נקודת עוגן אחד לפני הקיבוע, זה יצטמצם לעבר נקודת העוגן הנותרת במהלך קיבעון, עזב ספחי רקמה ניתן תפס בקלות רב יותר על ידי מלקחיים ומשך מקיר גוף הזחל.
כדי טוב ביותר לשמר דגימות, בזהירות רבה יש לנקוט כדי למזער מגע בין המלקחיים האפידרמיס במהלך הליך הסרת שריר. כתוצאה מכך, הפרוטוקול שלנו יכול להוסיף כמה דקות טכניקות לנתיחה שתוארו לעיל 10,11. כדי למנוע שפלת רקמות, מספר זחלים כי הם גזורים לפני הקיבוע צריך להיות מוגבל כך זמן שחלף הוא לא יותר מ -25 דקות. בנוסף, מומלץ לבדוק זוגות רבים של מלקחיים - מלקחיים מאותו מודל עשויים להשתנות במידה ניכרת בכושר וחד - והתאמת המידה שבה פילה נמתחת לפני הסרת שריר על מנת לשפר את שימור רקמה ומהירות לנתיחה.
לבסוף, אנו ממליצים לנסות את השימוש Ca 2+ HL3.1 מלוח -חינם לעומת מלוחים HL3.1 תקן במהלך דיסקציה זחל. בהעדר סידן, התכווצויות שרירי זחל מופחתות מאוד. לפיכך, פילה הזחל יכול להיות קל יותר לתמרן כאשר גזור Ca 2+ מלוחים HL3.1 -חינם. עם זאת, אנו מוצאים כי התכווצות שרירים יוצר מרחב בין שרירים האפידרמיס וזה יכול להקל על החדרת מלקחיים בין רקמות אלה תוך מזעור הסיכון של פגיעה באפידרמיס. כתוצאה מכך, HL3.1 סטנדרטי עשוי להיות עדיף על שמירה על השלמות של האפידרמיס דה נוירונים. אנו משיגים תוצאות טובות עם או מלוח והבחירה היא ביניהם לבין המשתמש.
בעוד עליות הפרוטוקול שלנוהמשך והמורכבות של טכניקות לנתיחה שתוארו לעיל 10,11, שהיא מציעה מספר שיפורים שימושיים הדמיה עצבה סנסורי זחל ותאי אפידרמיס. ראשית, הוא מאפשר הדמיה של חלבונים neuronally ו epidermally הביעו כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת השריר. שנית, הוא משפר את אותות הקרינה יחס רעש. לבסוף, הוא מאפשר שימוש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה לאפליה מעולה של יחסי מרחביים חלבון דה נוירונים האפידרמיס. איכות ההדמיה המשופרת שאנו רואים לאחר הסרת שריר היא ככל הנראה התוצאה של קליטת פוטון מופחתת ומתפזר כמו גם מרחק מופחת בין המדגם לבין coverslip. אמנם לא הפגין כאן, הסרת שריר סבירה גם משפרת גישת נוגדנים האפידרמיס דה נוירונים, שיפור איכות immunofluorescence. נגישות נוגדן רבתי עשויות להיות שימושיות במיוחד עבור פרוטוקולי immunofluorescence שבוצעו absence של רקמות permeabilizing סוכן 4.
השיפורים שנרכשו על ידי שימוש בפרוטוקול זה, צפויים ליהנות מחקרים של הגורמים העצביים ועל אפידרמיס מווסתים המורפוגנזה דנדריט ב עצב סנסורי. יתר על כן, הסרת שריר יש להקל בעבר במחקר אלקטרו של עצב סנסורי בקיר גוף זחל גרסה שונה של פרוטוקול זה עשויה להיות שימושי עבור מחקרים עתידיים המעסיקים מניפולציה הנוירופיזיולוגיים של עצב סנסורי זחל. לבסוף, גרסה שונה של פרוטוקול זה עשויה להיות שימושי לקראת יישומים אחרים כגון הבידוד של נוירונים דה היחידים לביצוע פרופיל ביטוי גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים גארי לאייבסקי לדיונים מועילים על מיקרוסקופיה. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים R01GM061107 ו R01GM067758 כדי ERG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
