Summary
Los estudios de la morfogénesis neuronal utilizando Drosophila arborización dendrítica larval (DA) se benefician de las neuronas en la visualización in situ de las proteínas neuronales y epidérmicas por inmunofluorescencia. Se describe un procedimiento que mejora el análisis de inmunofluorescencia de DA neuronas y las células epidérmicas que rodean mediante la eliminación de tejido muscular de la pared del cuerpo de la larva.
Abstract
Arborización dendrítica (DA), las neuronas de larvas de Drosophila son un modelo popular para la investigación de los mecanismos de morfogénesis neuronal. Da neuronas desarrollan en comunicación con las células epidérmicas que inervan y por tanto su análisis de beneficios de la visualización in situ de las dos proteínas expresadas neuronalmente y epidérmicamente por inmunofluorescencia. Los métodos tradicionales de preparación de filetes de larvas para experimentos de inmunofluorescencia dejan intacto el tejido muscular que cubre la mayor parte de la pared del cuerpo, que presenta varios desafíos para la formación de imágenes proteínas neuronales y epidérmicas. Aquí se describe un método para eliminar el tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo permite que las imágenes de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido, y facilita el uso de super-resolución microscopía para estudiar da el desarrollo de la neurona.
Introduction
Arborización dendrítica (da), las neuronas de larvas de Drosophila proporcionan un modelo valioso para el estudio del desarrollo neuronal debido a su susceptibilidad a la manipulación genética y la facilidad con la que pueden obtenerse imágenes. Estas neuronas sensoriales han sido instrumentales en la identificación de numerosas vías que controlan la morfogénesis de dendritas 1-3.
Cuatro clases de neuronas DA (clase I - IV) inervar la epidermis de las larvas. Estas neuronas se encuentran entre la membrana basal y la epidermis, con sus dendritas formando matrices en gran medida de dos dimensiones 4,5. De las cuatro clases, clase IV da neuronas tienen las glorietas más altamente ramificada y, al igual que las neuronas sensoriales de otros animales, la elaboración de estas pérgolas requiere factores intrínsecos, así como las señales de los tejidos vecinos, particularmente en la epidermis, para su desarrollo 6-9 .
Los estudios para determinar las modalidades de dicha neuronal y hecho de extra-neuronalORS controlar beneficio morfogénesis dendrita de la capacidad de detectar la expresión de proteínas in situ por inmunofluorescencia. La cutícula exterior de la larva es impenetrable a los anticuerpos, pero este impedimento es fácilmente superada por la preparación de filetes de larvas a través de métodos de disección bien establecidos 10,11. Sin embargo, el tejido muscular de la pared del cuerpo que se encuentra justo interior a la membrana basal presenta varios retos hacia la visualización de las neuronas DA y las células epidérmicas. En primer lugar, el tejido muscular, lo que la mayoría de las líneas de la pared del cuerpo, oscurece considerablemente señales fluorescentes que emanan de tejido neuronal o epidérmica. Esto reduce sustancialmente la relación señal a ruido en la muestra. En segundo lugar, muchas proteínas relevantes pueden expresarse en el tejido muscular, así como en las neuronas o epidermis. Esta señal de fluorescencia derivada de músculo es probable que aún más la detección oscura de una señal de fluorescencia de la neurona o epidermis. Por último, los avances en las tecnologías de microscopía sinw imágenes permiso de muestras a una resolución de sub-difracción y puede ser especialmente útil en el discernimiento de la localización de las proteínas que se expresan en las neuronas y células de la epidermis que rodea 12,13. Sin embargo, las imágenes a través de super-resolución de microscopía se beneficia de una fuerte relación señal a ruido y la proximidad de la muestra al cubreobjetos. Además de reducir la relación señal a ruido, la pared del cuerpo distancias musculares larvas da a las neuronas de la cubreobjetos, limitando de este modo la resolución de imagen mejorado que se puede conseguir con métodos de microscopía super-resolución. Además de retos para el análisis de inmunofluorescencia, el tejido muscular presenta una barrera para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales en la pared corporal de larvas. Por tanto, su eliminación se beneficia manipulación neurofisiológica de las neuronas sensoriales 14.
Aquí se describe un método para la extracción manual de Drosophila tejido muscular larval. Se demuestra que nuestro protocolo permits de formación de imágenes de inmunofluorescencia de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido para la visualización de clase IV neuronas DA, y permite el uso de super-resolución microscopía para discriminar mejor las relaciones espaciales de proteínas y estructuras celulares en Da neuronas y la epidermis.
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Protocol
Nota: El procedimiento para la eliminación de músculo (Figura 1) es una modificación de los métodos descritos anteriormente para la preparación de filetes de larvas. Los pasos que preceden y siguen a la eliminación del músculo se describen brevemente y se remite al lector a los trabajos previos 10, 11 para una descripción más detallada.
1. Dissect Larva en solución salina fría
- Preparar una dilución de trabajo de solución salina fría HL3.1 15 o Ca 2 + libre frío HL3.1 solución salina 11 (Tabla 1). Coloque la larva en una placa de elastómero de silicona con suficiente solución salina fría para cubrir el fondo del plato.
Nota: Véase la discusión con respecto a la elección de la solución salina.
| solución salina HL3.1 1x (pH 7,2) |
| HEPES 5 mM |
| NaCl 70 mM |
| 1,5 mM de CaCl2 (omitir para Ca2 + solución salina exento) |
| 4 mM MgCl2 |
| 10 mM NaHCO 3 |
| trehalosa 5 mM |
| sacarosa 115 mM |
| Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C |
| imita la composición de insectos hemolinfa: Nota |
Tabla 1. Composición de frío Saline.
- Coloque la larva con el lado ventral hacia arriba. La superficie ventral de la larva se puede identificar por las cintas dentical abdominales y el lado dorsal por los tubos traqueales larvas primarias que funcionan de anterior a posterior. Estirar la larva en la dirección antero-posterior y el pin de la cabeza y la cola a unaelastómero de silicona disección plato usando pasadores de insectos. Con unas tijeras de disección finas para cortar a lo largo de la línea media ventral, comenzando en un extremo y progresando hacia el otro.
NOTA: Esta orientación conserva el clúster dorsal comúnmente estudiada de las neuronas DA. - Después de la larva se corta abierta, fijar las cuatro esquinas del plato a la disección como si la apertura de un libro. El uso de fórceps para agarrar y extraer los órganos internos, incluyendo el sistema nervioso central, intestino, y la tráquea. Ajuste pasadores de insectos de manera que el filete es tensa pero no estirada al máximo.
NOTA: Los músculos están ancladas a la pared del cuerpo en los límites segmentarias. Aunque los músculos cubren la mayor parte de la pared del cuerpo, que están ausentes en una zona estrecha cerca de la línea media dorsal.
La eliminación 2. Músculo
- Busque la línea media dorsal de la larva, donde el tejido muscular está ausente. Coloque un solo diente fórceps de tal manera que se puede insertar debajo del tejido muscular en la orientación más plana posible.
- A partir dela línea media dorsal, cerca del límite anterior del segmento, deslice cuidadosamente el diente fórceps entre el músculo y la epidermis, teniendo cuidado para minimizar el contacto entre la pinza y la epidermis.
- Tire de la pinza hacia arriba para romper la unión del músculo para la pared del cuerpo en un punto de anclaje. Repita este proceso para el hemi-segmento (s) restante de interés.
NOTA: Este protocolo optimiza la preservación de la parte posterior de cada campo de dendritas de las neuronas DA. Para preservar la parte anterior del campo de dendritas, lo mejor es insertar la clavija de fórceps en el extremo posterior de cada segmento. - Reajustar pasadores de insectos tales que el filete de larvas se estira al máximo en todas las direcciones.
- Fijar el filete mientras que todavía se fija en el plato de disección usando, recién preparada formaldehído frío 4% en PBS durante 25 min.
- Enjuagar 5 veces en PBS.
- El uso de fórceps para extraer con cuidado el tejido muscular de los restantes puntos de anclaje, teniendo cuidado para minimizar contact con la epidermis.
- Desanclar y quitar el filete del plato de la disección a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Llevar a cabo todas lavado, bloqueo, y los pasos de tinción de inmunofluorescencia posteriores, como se describió anteriormente 11.
3. Monte el filete de larvas
- Saca primero la cabeza y la cola con unas tijeras de disección finas con el fin de hacer la muestra lo más plana posible. Montar el filete en un cubreobjetos en medio de montaje antifade con la superficie interior del filete frente al cubreobjetos.
- Colocar un portaobjetos de microscopio en el cubreobjetos y presionar suavemente para dispersar el medio de montaje. Da la vuelta al portaobjetos de microscopio una y sellar el cubreobjetos sobre el portaobjetos usando esmalte de uñas. Las diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos un mes.
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Representative Results
Se demuestra la utilidad del procedimiento de extracción muscular para mejorar la relación señal a ruido en los experimentos de inmunofluorescencia para co-visualizar las proteínas de unión tabicado Coracle (Cora) y discos de gran (DLG), junto con la clase IV neuronas DA, marcadas con el marcador de membrana CD4 tdTomato.
Cora se ha utilizado anteriormente para identificar áreas de muestreo donde da las dendritas de las neuronas están rodeados por células de la epidermis y es uno de los muchos factores identificados epidérmicas que se han estudiado en asociación con la morfogénesis y la función de las dendritas neurona da 4,6-9,16. La inmunotinción con anti-DsRed para detectar las neuronas (rojo) y el anticuerpo anti-Cora (verde) se llevó a cabo en los filetes de larvas con el músculo eliminado (músculo-off) y con el músculo intacto (músculo-on). Para cada condición, el campo de dendritas posterior de la clase IV da neurona Se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio láser confocal de barrido. Las imágenes se obtuvieron utilizando Identificaciónentical parámetros de imagen para ambas condiciones. Estamos, además, la imagen formada muscular en los filetes utilizando aumento de la potencia del láser para compensar la interferencia de los tejidos musculares.
En las muestras de músculo-off, Cora se pudo detectar con claridad en los límites de las células epidérmicas, en tractos intermitentes a lo largo de las dendritas de las neuronas da clase IV, y delineando el soma neuronal da clase IV (Figura 2C). Por el contrario, su localización a estos dominios se oscureció en gran medida en el músculo-en muestras, incluso cuando se incrementó la potencia del láser (Figura 2A-2B). En el músculo-en muestras, Cora se visualizó principalmente en el músculo, la tráquea y en la unión neuromuscular (UNM), que se separan de la pared del cuerpo como resultado del procedimiento de extracción del músculo. La señal de fluorescencia que emana de estos tejidos oscurecido la mayor parte de la Cora que localiza a epidérmicas límites celulares y dendritas extensiones, excepto en la estrecha franja del cuerpo wall, cerca de la línea media dorsal, donde el músculo está ausente. Cora que describe la clase IV da neurona soma no se visualizó en el músculo-en muestras (Figura 2A-2B). La visualización de las proteínas expresadas epidérmica que también tienen expresión muscular elevada, como Dlg, es particularmente problemático. En las muestras de músculo en, la distribución de Dlg en la epidermis estaba casi completamente oscurecida por fluorescencia desde el músculo y NMJ (Figura 2D). Después de la separación del músculo, Dlg se detecta fácilmente en los límites de las células epidérmicas, en tractos intermitentes a lo largo de las dendritas de las neuronas DA, y delineando el soma neuronal da clase IV (Figura 2E). Por lo tanto, la eliminación del músculo permite la visualización de las proteínas expresadas nivel epidérmico y neuronal oscurecidas en contrario de los músculos y tejidos asociados.
Además, se observó que la intensidad de fluorescencia de la clase IV marcador da neurona parecía reducirse en el músculo-en filetesen comparación con los filetes musculares-off cuando los parámetros de imagen se mantuvieron constantes entre las dos preparaciones de muestra (Figura 2A, 2C). Con el aumento de la potencia del láser, la intensidad de fluorescencia aparente de la clase IV da marcador neurona se podría corresponder a las muestras de músculo-off, pero el ruido de fondo se incrementó (Figura 2B, 2C). Por lo tanto, la eliminación del músculo mejora la relación señal a ruido en las muestras.
Por último, hemos probado si las mejoras obtenidas mediante la eliminación de tejido muscular se podrían aplicar a las imágenes de la clase IV neuronas DA en la resolución sub-difracción. Para ello, 3D estructurado microscopía de iluminación se realizó (SIM) de formación de imágenes, que alcanza aproximadamente 120 nm resolución lateral 13. Al igual que con la imagen confocal, se compararon los filetes de músculo y el músculo de inmuno-off por Cora y clase IV da neuronas, primero bajo condiciones idénticas de imagen y luego después de la optimización de la potencia del láser, exposicionesUre tiempo, y el procesamiento de imágenes de muestras de músculo de mano. De manera similar a la microscopía confocal, se observó una señal sustancialmente reducida a ruido en el músculo-en comparación con los filetes musculares-off (Figura 3A-3C). Además, reconstrucción de la imagen más nítida apareció en muestras de músculo-off. En comparación con los músculos de las muestras, se observó un menor número de artefactos aparentes y Cora extensiones de dendritas se resolvieron más fácilmente (Figura 3B, 3C). Membranas de las dendritas podrían medirse en aproximadamente 114 nm de ancho en los filetes de músculo aislado, sino que parecían ser 272 nm de ancho en el músculo-en filetes (Figura 3D, 3E). Por lo tanto, nuestro protocolo permite la aplicación de la microscopía de super-resolución para la visualización de la clase IV neuronas DA.
Figura 1. Descripción general del procedimiento de extracción del músculo. Una larva se diseca y se cubrió con una siliconaelastómero de disección plato. Para eliminar el tejido muscular, se inserta una punta fórceps entre la capa muscular y epidérmica de células, a partir de la línea media dorsal cerca de un límite de segmento (2.2). Los fórceps se tira hacia arriba para romper la unión entre el músculo y el cuerpo de pared (2.3). Esto se repite para segmentos de interés y luego la larva se fija en formaldehído (2.5). Después de la fijación, los fórceps se utilizan para separar el tejido muscular restante de la pared del cuerpo (2.7 a 2.8) La cutícula larval y epidermis se muestran en naranja, de clase IV neuronas DA en verde, y los músculos en rojo. Inserciones en (2.2) y (2.7) representan vistas en sección transversal de un único segmento de hemi-larvas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La eliminación del músculoMejora la Imagen confocal de neuronas DA y la epidermis de inmunofluorescencia de Cora. (Verde; CA) o Dlg (verde, DE) se detectó con el tejido muscular (A, B, C) y sin que el tejido muscular (C, E). Clase IV da neuronas se marcaron con 477 conductor el GAL4 'para expresar UAS-CD4: tdTomato y se detectaron con un anticuerpo anti-dsRed (rojo). Las muestras de músculo-en y músculo-off etiquetados para Cora fueron imágenes primero con un microscopio confocal en condiciones idénticas (A, C) y luego con el aumento de la potencia del láser para compensar la interferencia muscular (B). Las muestras de músculo y músculo-en-off etiquetados para Dlg fueron imágenes en condiciones optimizadas de forma individual. Todas las imágenes son confocal Z-proyecciones. La media (verde) e inferior (rojo) paneles muestran los canales individuales; los paneles superiores son los canales fusionadas. El límite del tejido muscular (líneas de trazos), la clase IVsoma neuronal da (flechas cian), Cora y Dlg dendrita extensiones (flechas blancas), los límites de células epidérmicas (flechas), magenta NMJ (flechas amarillas), y la tráquea (flechas de color naranja) se indican. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La eliminación del músculo Permite super-resolución de Imagen de DA neuronas y las células epidérmicas. Detección de inmunofluorescencia de Cora (verde) en la clase IV neuronas DA con el músculo intacto (A, B) y después de la extirpación del músculo (C). Clase IV neuronas DA se marcaron como en la Figura 2 Las muestras de músculo de mano y musculares-off se obtuvieron imágenes con un microscopio de iluminación estructurada primero en condiciones idénticas (A, C).; la muestra de músculo-enen (A) A continuación se volvió a crear la imagen con tiempos de aumento de la potencia del láser y de exposición para compensar la interferencia muscular (B). Todas las imágenes son Z-proyecciones. Los paneles media (verde) e inferior (rojo) de CA muestran canales individuales. El panel superior de la AC es una combinación. límites de la célula epidérmica (flechas magenta), zonas de dendritas Cora (flechas blancas), y un artefacto de reconstrucción de imágenes (punta de flecha amarilla) se indican. Inserciones en los paneles inferiores de B y C corresponden a D y E, respectivamente. La anchura aparente de la membrana dendrita se muestra en el músculo-en (D) y (E) Las muestras de músculo-off. Las barras de escala = 3 m (AC) y 0,5 micras (D, E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí un protocolo se describe para la extracción manual de tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo descrito previamente modifica la técnica de disección de las larvas 10,11. Después de la larva se diseca en una placa de elastómero de silicona, la línea media dorsal se encuentra. Una sola pinzas de punta, en su orientación más plana posible, se inserta cuidadosamente entre el tejido muscular y la epidermis, cerca de la línea media dorsal. El fórceps se tira suavemente hacia arriba a los tejidos musculares separada de un punto de anclaje en cada segmento de larvas de interés. El filete de larvas se fija entonces en formol fría después de lo cual el fórceps se utilizan de nuevo para alejarse del músculo a partir de los puntos de anclaje restantes.
Si bien es tentador para llevar a cabo la totalidad de la eliminación muscular procedimiento posterior a la fijación, nos encontramos con que el músculo estirado, una vez fijado, sigue siendo aplastada y estrecha aposición a la epidermis, incluso después de la separación desde un punto de anclaje, lo que hacedifícil de manipular sin dañar el tejido subyacente. tejido muscular Además, en nuestra experiencia, fija es frágil y se rompe con facilidad, evitando su eliminación completa de la pared del cuerpo. Por el contrario, cuando el músculo se separa de un punto de anclaje antes de la fijación, se contraerá hacia el punto de anclaje durante la fijación restante, dejando trozos de tejido que pueden ser más fácilmente agarrado por pinzas y se separa de la pared del cuerpo de las larvas.
Con el fin de preservar mejor muestras, la atención considerable debe tener cuidado para minimizar el contacto entre las pinzas y la epidermis durante el procedimiento de extracción del músculo. Como resultado, el protocolo puede añadir varios minutos a técnicas de disección descritas previamente 10,11. Para evitar la degradación del tejido, el número de larvas que se diseccionó antes de la fijación debe ser limitada de tal manera que el tiempo transcurrido es no más de 25 minutos. Además, recomendamos probar varios pares de pinzas - fórceps del mismo mesdel puede variar considerablemente en forma y nitidez - y el ajuste de la medida en que los filetes se estiran antes de la retirada muscular con el fin de mejorar la conservación de tejidos y la velocidad de la disección.
Por último, se recomienda experimentar con el uso de Ca 2+ solución salina versus solución salina HL3.1 exento HL3.1 estándar durante la disección de las larvas. En ausencia de calcio, las contracciones musculares de larvas se reducen considerablemente. Por lo tanto, los filetes de larvas pueden ser más fáciles de manipular cuando disecados en Ca 2 + libre de solución salina HL3.1. Sin embargo, nos encontramos con que la contracción del músculo crea un espacio entre el músculo y la epidermis y esto puede facilitar la inserción del fórceps entre estos tejidos y reducir al mínimo el riesgo de daño a la epidermis. Como resultado, HL3.1 estándar puede ser preferible para la preservación de la integridad de la epidermis y DA neuronas. Obtenemos buenos resultados con solución salina y la elección se deja al usuario.
Mientras que nuestros aumentos de protocolola duración y la complejidad de las técnicas de disección anteriormente descritos 10,11, ofrece varias mejoras que son útiles para obtener imágenes de las neuronas sensoriales de las larvas y las células epidérmicas. En primer lugar, permite que las imágenes de las proteínas expresadas neuronalmente y epidérmicamente que están ocultas de otro modo por el tejido muscular. En segundo lugar, mejora la señal de fluorescencia a ruido. Por último, se permite el uso de super-resolución de la microscopía para la discriminación superiores de las relaciones espaciales de proteínas en las neuronas DA y la epidermis. La calidad de imagen mejorada que se observa después de la extirpación del músculo es probablemente el resultado de la reducción de la absorción de fotones y de dispersión, así como la reducción de la distancia entre la muestra y el cubreobjetos. Aunque no se ha demostrado aquí, la eliminación del músculo probable que también mejora el acceso del anticuerpo a la epidermis y DA neuronas, la mejora de la calidad de inmunofluorescencia. La mayor accesibilidad de anticuerpos puede ser particularmente útil para los protocolos de inmunofluorescencia realizados en el Absence de un tejido agente de permeabilización 4.
Las mejoras obtenidas por el uso de este protocolo son susceptibles de beneficiarse de los estudios neuronales y epidérmicas factores que regulan la morfogénesis de las dendritas de las neuronas sensoriales. Además, la retirada del músculo ha facilitado previamente el estudio electrofisiológico de neuronas sensoriales en la pared del cuerpo de la larva y una versión modificada de este protocolo puede ser útil para futuros estudios que emplean la manipulación neurofisiológica de las neuronas sensoriales de larvas. Por último, una versión modificada de este protocolo puede ser útil para otras aplicaciones, tales como el aislamiento de las neuronas individuales da para perfiles de expresión génica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Gary Laevsky útil para los debates sobre la microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones R01GM061107 y R01GM067758 a ERG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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