で脂肪レベルを決定するの浮力に基づく方法 Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54744

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Kelsey E. Hazegh¹, Tânia Reis¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, and Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

ここでは、三齢（L3） キイロショウジョウバエの幼虫期における生物の脂肪レベルを測定するための方法を提示します。この方法は、変更された脂肪店との幼虫を区別するために、脂肪組織の比較的低密度を利用します。浮力ベースの分析、迅速な再現性、および経済的なスクリーニングのための貴重なツールです。

Introduction

キイロショウジョウバエは遺伝学および他の基本的な生物学的な質問の研究で一世紀以上にわたって使用されてきました。過去数十年では、 ショウジョウバエは 、多くのヒト疾患の研究における強力なツールであることが明らかになりました。ヒトの疾患に関連する遺伝子の80％に同定フライオルソログ¹持っている^- - 70のように^4を 、 ショウジョウバエは、複雑な疾患を研究する中で簡略化し、まだ翻訳可能なシステムを提供します。特に代謝は、このような研究から恩恵を受けています。だけでなく、よくハエとヒトの間で保存代謝の遺伝学がありますが、関連する器官および細胞型はまた^、2,5非常によく似ています。例えばフライストアの両方トリアシルグリセリド（TAG）およびグリコーゲン、哺乳動物の肝臓および白色脂肪組織⁶で行われたものと類似の機能の、脂肪体。人間の肥満のモデルとしてショウジョウバエを使用すると、大幅に脂質の我々の理解を改善しました代謝と肥満⁷の遺伝学。開発の幼虫期は、それが供給およびpupariation時に使用するエネルギーの貯蔵に専用されているような記憶や利用に栄養素の分離を研究するために特に有用です。

現在、 ショウジョウバエにおける脂肪蓄積レベルを決定する多くの異なる定量的な方法があります。最も広く使用されている方法は、結合された比色アッセイ^（CCA）8,9です。 CCAは、ヒト血清中のTAGのレベルを決定するために開発され、トリグリセリド骨格から遊離グリセロールを最終的に着色された生成物を生成する酸化還元結合反応を生じ、いくつかの反応を受けることを前提に動作しました。光の特定の波長の吸光度は、その後、グリセロール存在の初期量を決定するために測定されます。しかし、グリセリンは、タグに加えて、モノ - およびジアシルグリセリドから遊離させることができるので、複数の正確な測定値ではないかもしれませんtored体脂肪^9。さらに、破砕大人のハエの目の顔料は、いくつかの吸光度の読み取りを妨げ、結果^9,10を複雑^にすることができます。したがって、CCAが同行し、デンシトメトリー^10,11によって定量することができるほとんどの脂質ファミリーの分離を可能に薄層クロマトグラフィー（TLC）、によって検証されなければなりません。しかし、ステロールのようないくつかの脂質クラスを分析することができず、別の方法^12を定量化する必要があります。質量分析（MS）は、主要な細胞脂質^12,13のすべてのクラスを定量するための正確な方法です。しかし、MSによって分析するために必要な脂質抽出手順は、両方の時間がかかり（ほとんど終日ほぼ服用）と高価です。ここでは、迅速かつ安価にキイロショウジョウバエのL3幼虫に生物の脂肪レベルを決定するための別の方法を提示します。

以下に示す方法は、脂肪組織と除脂肪組織の密度差を利用します。哺乳動物のファトンの組織は、1.06グラム/ミリリットル¹⁵の密度の約0.9グラム/ミリリットル¹⁴一方、骨格筋の密度を有します。この違いは、脂肪の高い店舗を持つ動物はそれらを固定濃度の溶液中でよりよく浮くことができます脂肪の低い店舗、を有する動物よりも低い密度を有することを意味します。安価で非侵襲性の両方でありながらこのプロパティは、多数の動物の非常に迅速なスクリーニングを可能にします。浮力に基づく分析は、脂肪レベルの公知の調整を変えるの表現型を確認するだけでなく、肥満^16,17の新たな遺伝的および神経学的調節因子を同定するための両方に使用されています。

Protocol

1.関心のある遺伝子型を持つハエから卵を集めます

注：理想的な十字が150処女ハエと、少なくとも75人の男性で構成されています。ストックコレクションは、少なくとも200ハエで構成する必要があります。

1. ブドウのプレートを準備します。
   1. 4リットルのフラスコに1.5 Lの蒸留水に37.5グラム寒天を追加します。
   2. 121ºC（250ºF）で50分間オートクレーブ水/寒天ミックス。
   3. 水/寒天ミックスはオートクレーブ処理であるが、500ミリリットルグレープジュースに50グラムのスクロースを追加し、ショ糖が溶解するまで加熱撹拌プレート上の撹拌棒でかき混ぜます。
   4. 熱をオフにして、70ºC以下にブドウジュース/ショ糖混合物を冷却するために攪拌し続けます。アルコール温度計で内部温度をテストします。
   5. グレープジュース/ショ糖混合物を温め、溶解するために攪拌する（ 例えば 、Tegosept）3グラムショウジョウバエの抗真菌剤を追加します。
   6. 水/寒天混合物は、オートクレーブの外にあるとき、フラスコを時折旋回することにより、タッチに冷却することができます。
   7. 小さなペトリ皿（35×10ミリメートルスタイル）の蓋にブドウの混合物の10ミリリットル - 8を追加するために、血清学的ピペットを使用してください。混合物は、凸形状を形成するために、蓋の壁の高さよりも高い冠を許可します。
   8. ブドウのプレートを室温で2時間冷却した後、4ºCで密閉容器に保存することができます。
2. 酵母ペーストを準備します。
   1. 50ミリリットルコニカルチューブに4グラムのライブアクティブ乾燥酵母に6ミリリットルのリン酸緩衝溶液（PBS）を追加し、滑らかになるまでヘラで混ぜます。
   2. 4ºCで保存酵母ペースト。
3. ブドウのプレートの真ん中に酵母ペーストの小さなほんの少し加え（約1/8小さじ）を追加します。スパチュラで任意の粗いエッジを下にスムーズ。
4. 彼らは周囲の温度に達するまでインキュベーターでブドウプレートを置きます。
5. 採卵室と場所ブドウプレートワットへの関心のハエを転送上部に内側に面したi番目の酵母ペースト。採卵室にテープブドウプレートは、プレートが脱落せないようにします。ブドウのプレートの底面に重要な遺伝子型と日付情報を書き込むようにしてください。
6. ハエがブドウ板に卵を産むことができるように採卵室を覆します。
7. 採卵室の上に箱やカバーを置き、25ºCでインキュベータに置いてください。
8. 6時間 - ハエは4産卵することができます。
9. 採卵室からブドウのプレートを取り、食品の彼らのボトルに戻ってハエを転送することにより、コレクションを終了します。ブドウのプレートから余分な酵母ペーストを拭き取るためにへらを使用します。 24時間〜25ºCでの加湿インキュベーター中でより大きなペトリ皿に保管してブドウのプレート。

実験食品2.転送幼虫

1. 実験的な食べ物を準備します。
   注：この食品のレシピはブルーミントンストックセンターのレシピ¹⁸に基づいています。重要な変更（ - 25ºCでの採卵後の時間120 112との間）のステージを徘徊のタイミングによって評価されるように、食品の栄養価を最適化するために、酵母の量の増加が含まれます。我々は我々の実験幼虫の健康と発展のためにこのレシピの理想を発見しているが、任意の食品のレシピは正と負のコントロールで許容可能な与えられたキャリブレーションである、の例は、ステップ3.10に記載されています。
   1. 1600ミリリットルに蒸留水を測定します。
   2. 134グラムのコーンミール、10.6グラムショウジョウバエ寒天タイプII、および1リットルのビーカー内の水の一部（〜500ミリリットル）を混ぜます。電動式ハンドミキサーで2分間ブレンド。
   3. 別の1リットルのビーカーに70グラムのライブ活性乾燥酵母、18.4グラムの大豆粉、84.8グラムの麦芽エキス、及び水の一部（〜500ミリリットル）を混ぜます。電動式ハンドミキサーで2分間ブレンド。
   4. 各ビーカーを旋回し、4 Lフラスコに注ぎます。ビーカーを洗い流し、フラスコに追加するには、残りの水を使用してください。
   5. 旋回により混合し、140ミリリットル光コーンシロップを測定し、フラスコに追加します。</李>
   6. 液体設定で121ºC（250ºF）で50分間オートクレーブ。
   7. オートクレーブ処理した後、4リットルのビーカーの中に食べ物を注ぎ、冷却させます。電動式ハンドミキサーでブレンドすることにより、冷却プロセスを助けます。
   8. フラスコに触れるのに十分冷却した後、8.8ミリリットルのプロピオン酸および16.8ミリリットルショウジョウバエの抗真菌剤/エタノール溶液を追加します。よく混ぜます。 （ ショウジョウバエ 1 Lに200プルーフのエタノールを380グラムショウジョウバエの抗真菌剤を添加し、溶解するまで溶液を70ºCを超えないように確認しながら、暖かいプレート上で撹拌することにより抗真菌剤溶液ください。）
   9. 食品は、約1インチの深さになるまでバイアルに食べ物を注ぎ、2 RTで冷却することを可能にする - 3時間。 25ºCでインキュベータにバイアルおよびストアを差し込みます。一週間以内に使用します。
2. 何回かそれを獲得するために、食品のバイアルの最上層にへらをプランジ。これは、穴を掘ると養うために幼虫を支援します。
3. 22 - 採卵後24時間は持ちます終了し、ほぼ同じ大きさの50最初の齢（L1）の幼虫を収集するために、小さな絵筆を使用しています。実験食に幼虫を置きます。ワイプや絵筆には残りの幼虫が他の遺伝子型に進む前に存在しないことを確認し、実験室に絵筆を清掃してください。
4. 25ºCでインキュベータに幼虫のバイアルを置き、開発することができます。

3.幼虫の脂肪レベルを決定します

1. 溶液を調製します。
   1. 1 Lの10×PBS在庫を準備します。
      1. 攪拌棒を含む2リットルのビーカーに800ミリリットルの水に80グラムのNaCl、2グラムのKCl、14.4グラム_の Na ₂ HPO _4、および2.4グラムのKH ₂ PO _4を追加_します。全ての塩が組み込まれるまで加熱なしでかき混ぜます。 pHを7.4に持参してください。水で1Lにボリュームを上げます。
   2. 2 L 1×PBSを準備します。 1800ミリリットルの水に200ミリリットル10×PBS原液を追加します。
   3. 20％w / vスクロースにするために、1×PBSのこのストックを使用してください。
2. から幼虫のバイアルを削除（一般的に卵のコレクション後5日目に）バイアルの側面をさまよう40幼虫 - インキュベータは、かつて20あります。日付と時刻のアッセイと同様に幼虫を放浪の数を記録します。
3. 50ミリリットルコニカルチューブに11.5ミリリットルのPBSおよび9 mlの20％ショ糖を加えることによって、実験的なソリューションを準備します。
4. バイアルの上部から1インチ - それが0.5になるまでバイアルに20％スクロースを追加します。
5. 優しくまだ食品中に掘り進むされている無料の幼虫に食品の最上層をかき立てるためにへらを使用します。すべての幼虫は、スクロース溶液の表面に上昇します。
6. 静かにステップ3.3から初期スクロース濃度に幼虫を転送するために鉗子を使用してください。
7. 静かにこの溶液中の幼虫を攪拌するへらを使用してください。
8. コニカルチューブに蓋をし、溶液を十分に混合するために数回を覆します。
9. コニカルチューブをキャップを取ると穏やかな渦を作成するために旋回。
10. いずれかの溶液またはSIの最上部に浮遊、幼虫が安定することを許可します底にnking。解決するための幼虫のために5分 - 2を待ちます。
    注：いずれかの浮きや沈没間違いではありません幼虫がまだある場合は、フローターやシンカーのいずれかとして幼虫を標識するために、カットオフポイントとして使用する回線を選択します。すべての遺伝子型に、この同じ基準を適用します。私たちは、境界としてコニカルチューブの底に角度を使用します。ADPまたはSIR2 ¹⁷変異体の幼虫は^、19の変異体は、アッセイのキャリブレーションのための陰性対照として使用することができる陽性対照とlsd2として使用することもできます。
11. 浮遊幼生の数および試験された特定の濃度を記録します。
12. その密度を増大させるために、実験溶液1 mlの20％スクロースを加えます。
13. 繰り返しは、3.10から3.7のステップ。浮遊幼生の数と、この新しい濃度を記録します。
14. 幼虫の少なくとも95％がフローティングされるまで、ステップ3.12と3.13を続けます。
15. PBSで満たされた解剖皿にすべての幼虫を収集するために鉗子を使用してください。
16. OBSどんな小さな幼虫、前蛹、蛹、または遺伝子型との間の任意の他の相違点がある場合は、顕微鏡やノートの下erveの幼虫。
    注：理想的には、すべての幼虫が均質と同じ発達段階で表示されます。我々は、これらの条件下で、一貫した脂肪測定値を観察しました。
17. 幼虫の合計数を記録します。
18. 鉗子を使用して、実験室に10幼虫を移す乾燥させるために拭いてください。マイクロチューブにラベルを付け、チューブで10幼虫を配置します。
19. Flashは、液体窒素中で幼虫を凍結します。 -20ºCでチューブを保管してください。

Representative Results

図1は、浮力に基づくアッセイは、遺伝子操作幼虫に上位と下位の両方の脂肪の店舗を検出することができる方法の例を表している。 図1Aは、幼虫の脳内の神経細胞の特定のサブセットの励起またはサイレンシング（E347）が低く、高脂肪を誘導することを示しますそれぞれ格納されています。同一の遺伝的背景の制御を両方の場合に使用した。 図1Bは、濃度分析によって得られたこの表現型は、GCMSによって中性脂質の抽出および定量化することによって確証される方法の例を提供します。

幼虫の脳の特定の領域における 図1. 神経機能は、体脂肪の規制のために必要かつ十分です 。指示されたE347-GAL4ラインの神経活動は、市^DNの過剰発現により静まり返りました。パネルに示されている、と脂肪体への影響を評価したとして。平衡状態で浮遊幼生の（A）の割合の異なる密度のソリューションで、または、NBの過剰発現によって活性化されます。五幼虫は、生物学的反復ごと調べ、N = 7た-遺伝子型当たり9の生物学的複製物（B）パーセント体脂肪（体重で割ったトリアシルグリセリドとリン脂質を含む全中性脂質）GCMS ^17,20によって測定される（N = 8）。青い線または棒が表すGAL4-のみ（UAS）の動物は、遺伝的背景の影響を制御するために^、1118ワットに渡りました。 P値は、両側t検定の結果を表します。 **** P <0.0001、*** P = 0.001から0.0001、** P = 0.001〜0.01、* P = 0.05から0.01。エラーバーはSEMを示します。この図は^、16を変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

^{10 -}脂質レベル^8を測定するために開発された技術の多くがあります。しかし、これらの各方法は、上記で概説した浮力ベースのアッセイによって対処されているいくつかの大きな欠点が付属しています。まず、このアッセイは非常に迅速です。 60分 - フル濃度勾配をテストしても30以上を取りません。これは、現在使用されている技術のほとんどに大きな改善です。それらを分析するために、脂質および他のいくつかの時間を分離するために9時間 - たとえば、MSによる脂質定量は7かかります。多数の動物のスクリーニングを行うとき、これは強力な抑止力です。迅速な浮力表現型を測定することによって、素早く目的の表現型を持っている遺伝子型に焦点を当てることができます。第二に、密度のアッセイは、そのような（PBS用）塩およびスクロースなどの唯一の共通の試薬を必要とします。これは、幼虫の多数をスクリーニングするか、すぐに興味深い遺伝子型をテストすることがはるかに容易かつ安価になります。最後に、このプロトコルI非侵襲性と幼虫のは終わりにまだ生きています。これにより、実験は、特定の脂質の定量または転写物またはタンパク質の分析などの動物で行うことができます。さらに、回収した幼虫は、成人期まで成長を継続させてもよいです。

他人に対するこの技術のさらなる利点は、集団中の脂肪レベルの小さな変化に対する感度を増加させます。幼虫がフローティング始まり、完全にフローティングされる濃度が対照と異なってもなくてもよいが、50幼虫の集団の全濃度勾配を実施することによって、人口脂肪レベルのわずかなシフトは、中間の濃度の変化によって同定され。彼らは分析するために、幼虫の大規模なグループを必要とする人口のこの小さなシフトは、常に他の脂肪定量方法によって同定することはできません。一方、密度アッセイは、集団内の個人を問い合わせ、その結果、目を識別することができます全体の人口分布の小さな変化やシフトをESE。

この技術は信頼できる結果を生成するために溶液の濃度に依存しているように、PBSおよびスクロース溶液を一貫して行われることが極めて重要です。我々は、別のPBSレシピが異なる結果につながる、溶液濃度の違いを生じさせることを見出しました。私たちは、一貫性のある結果を得るために上記で概説したレシピを使用しています。それは、同じ背景の溶液濃度をもたらすようにさらに、1×PBSの同じバッチから、20％ショ糖を製造することが重要です。二つの溶液を別々に行われた場合は、PBSの密度のわずかな変動は、実験的な円錐バイアルにスクロースを加え超えて追加の密度変数に持って来ることができます。時間をかけて解決策は、水の蒸発と、より濃縮されるため、最後に、蒸発は、問題になる可能性があります。しっかりとボトルをキャップすると、毎週ソリューションをリメイクすることが重要である実験的なようにソリューションは、一貫性を維持します。

上記の手順の中で、変更された場合、浮力アッセイにより不正確な結果をもたらす可能性があることを、いくつかの重要なステップがあります。まず、実験食品バイアルに移し幼虫は同じ年齢であることが重要です。サイズが異なる幼虫を転送する浮力アッセイが行われた時点で異なる発生段階の幼虫になります。このプロトコルは、L3幼虫をさまように脂肪レベルの変化を決定するために開発されており、早期のL3または前蛹以降のために正確に動作しません。初期の3齢幼虫であっても使用した最高濃度で前蛹と蛹シンクしながら、独立脂肪レベルのフロートする傾向があります。このため、転送さL1幼虫の年齢は重要です。同様に、バイアルを浮力のアッセイを行うために採取される点が重要です。上記同じ発生タイミングの理由から、バイアルのみ時20取られるべきです -40幼虫は、正確な密度測定を確実にするためにさまよっています。さらに、L1の数も結果に影響を与える可能性が転送されます。このプロトコルで使用される幅広いバイアルを50幼虫は、開発中の競争せずに食べることができます。これより転送幼虫のはるかに大きい数は、食品のための競争になりますと遺伝子型とは無関係に保存されている脂肪の量に影響を与える可能性があります。

幼虫のほとんどまたはすべてが第1の濃度で浮遊するような非常に高脂肪レベルの遺伝子型があるかもしれません。この場合、プロトコルは、人口密度分布の完全なスペクトルを得るために、出発溶液の濃度を減少させることによって修飾することができます。一方、特定の遺伝子型には幼虫初期スクロース中で浮遊しないようにリーンであってもよいです。この場合、最初のステップを省略することができ、より高い出発濃度は、使用します。このアッセイは、非常に柔軟であり、より良い脂肪レベルの広い範囲に適合するように修正することができます。当社は、（遺伝的背景のために制御された）適切な野生型動物（例えば、ADPまたはのSir2 ¹⁷として確立された脂肪変異体、）ポジティブコントロール、およびネガティブコントロール（例えばlsd2 ¹⁹として公開されたリーン変異体）などのコントロールを使用することをお勧めします。このプロトコルの適切な使用は、代謝と肥満素因の新たな調節因子を決定するために、コレクションの将来のスクリーニングを可能にします。また、このプロトコルは、興味のある遺伝子操作が複雑なプロトコルや高価な設備を必要とせずに、脂肪レベルの変化を引き起こすかどうかをテストするために、任意の分野の研究者のための簡単な方法を提供します。このプロトコルは、遺伝学と肥満との間の複雑な関係を解明するのに役立ちます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50 ml Conical	Fisher	50-869-569