Summary
这个协议/手稿描述了生产由伸筋草芽孢孢粉外壁胶囊（秒）的和为亲水性化合物为这些肝窦的装载一个简化的流程。
Abstract
从植物为基础的孢子或衍生的微胶囊提供一个多元化的微胶囊化应用提供了强大的平台。当孢子或花粉进行处理，以除去内部sporoplasmic内容孢粉外壁胶囊（秒）获得。得到的中空微胶囊表现出高度的粉体学均匀性并保留相关的特定植物物种错综复杂显微结构特征。在此，我们展示了从伸筋草孢子生产SEC的和为亲水性化合物进入这些SEC的加载一个简化的流程。当前SEC分离过程最近已经优化以显著减少其常规SEC中单独使用的处理的要求，并确保生产完整微囊。自然L. clavatum孢子脱脂用丙酮，用磷酸处理过的，并充分洗涤以除去sporoplasmiC含量。丙酮脱脂后，用85％的磷酸一单个处理步骤已被证明以除去所有sporoplasmic内容。通过限制酸处理时间为30小时，这是可以分离干净肝窦和避免SEC压裂，这已被证明与延长处理时间发生。用清水充分冲洗，稀酸，稀碱和溶剂确保所有sporoplasmic物质和化学残留物被充分去除。真空加载技术被利用来加载一个模型蛋白（牛血清白蛋白），为代表的亲水性化合物。真空装载提供了一种简单的技术来装载的各种化合物，而不需要这往往需要在其他微囊协议苛刻的溶剂或不希望的化学品。根据这些隔离和装载协议，SEC的提供一种在各种不同的微胶囊的应用，如，治疗剂，食品，化妆品使用一个有前途的材料，和个人护理刺UCTS。
Introduction
有在微胶囊化应用从植物孢子和花粉获得使用天然植物为基础的胶囊显著的兴趣。1-15在自然界，孢子和花粉反对恶劣的环境条件敏感的遗传物质提供保护。植物孢子和花粉的基本结构通常包括外壳层（外壁）中，内壳层（内壁），和内部细胞质材料。外壁是由称为孢粉化学鲁棒生物聚合物1,9,10,13,16和内壁是主要由纤维素材料16-18空胶囊可通过各种方法7,9中分离除去细胞质材料，蛋白质，和内壁层。2,12,16这些孢粉外壁胶囊（秒），由于其窄的尺寸分布和均匀的形态提供令人信服的替代合成密封剂。7,9,13,19,20的标准化的过程，以获得来自不同植物物种，如伸筋草肝窦的发展，打开了一个广泛的药物递送，食品和化妆品等领域的微胶囊的应用的潜力。6,10-13,21
为了获得肝窦，研究人员首先处理孢子和花粉与有机溶剂和碱性溶液回流以除去细胞质内容22-25然而，剩下的胶囊结构被确定为仍然含有纤维素内壁层。为了除去此，研究人员使用盐酸，热硫酸或热磷酸在若干天，22-25用磷酸成为SEC内壁去除的优选方法探讨了使用延长的酸性水解处理2然而，正在进行研究多年来已经表明，各种孢子和花粉具有不同程度的弹性恶劣处理我thods常用。26,27一些孢子和花粉是完全降解并失去在强碱性溶液中的所有结构完整性，或变得严重损坏在强酸性溶液16在SEC对治疗的反应条件的变异性是由于在化学细微变化结构和物种之间的孢粉外壁材料的外壁形态28由于孢粉外壁胶囊（秒）的鲁棒性的可变性，有必要以优化孢子和花粉的各种处理的条件。
从种属植物孢子clavatum已成为肝窦的最广泛研究的单一来源。因此建议，这主要是由于其广泛的可用性，成本低，单分散性，和化学坚固性9,29孢子可以在1分组的形式来方便地收获并含有sporoplasmic内容- 2微米细胞器和biomolecules 11 L. clavatum孢子已被用来作为一种天然粉末润滑剂，30,31一个化妆品的基础上，30和草药32-36为广泛的治疗应用。从L.获得SEC的clavatum已被证明是更有弹性，以来自其它物种的孢子和花粉。2处理之后的处理比肝窦，所得SEC的已显示出保留其错综复杂microridge结构和同时提供用于包囊的大的内部空腔高形态的均匀性。7研究表明，L。 clavatum SEC的可用于药物，10,13疫苗，11种蛋白质，7,14细胞，8油，5-7,9和食品补充剂的封装。5,15观察SEC负载效率相对较高比常规封装材料。7也有一些好处报道SEC的封装诸如掩盖味道，6,10，并提供一定程度的天然保护的抗氧化作用。12在现有的研究的能力，为L.最常用的SEC提取方法clavatum基于四个主要步骤。第一步是在50℃下在丙酮溶剂回流达12小时，脱脂孢子11第二步是在120℃到12小时以除去细胞质和蛋白质材料在6％的氢氧化钾的碱性回流11步骤三是在180℃下在85％的磷酸酸回流至7天以除去纤维素内壁材料11第四步是一个全面的洗涤过程中使用的水，溶剂，酸和碱以除去所有剩余的非外壁材料和化学残留物。
相对于封装应用SEC提取的主要目标是产生胶囊它们是空的细胞质材料制成的，自由往复中号潜在变应原性蛋白质和形态完好。2.37然而，从工业制造的角度来看，它也是重要的考虑附加的经济和环境因素，比如，能源效率，生产持续时间，安全性，和产生的废物。至于能量效率，兼具高的温度和长的处理时间会影响生产成本以及环境的影响。生产时间和周转时间是影响加工盈利的关键因素。特别值得关注的是，高温磷酸处理提高了安全性问题，并已知会导致腐蚀性缩放这导致在基础设施维护显著增加和延迟在批量周转时间。38-40在可能的情况，尽量减少可能会导致所需的步数到显著减少所产生的废物。然而，常用的L的四个步骤clavatum SEC提取具有简单的EV从几十年的研究和olved已很少实际过程的优化。近日，穆恩达尔吉等人 ，41通过系统地评估和优化的最常见的SEC提取技术之一提出在这一领域正在进行的工作显著的贡献。
在这项研究中的第一部分：孢子脱脂论证利用丙酮处理在50℃下6小时; sporoplasm和内壁去除过程证明利用85％的磷酸处理，在70℃，30小时;与水，溶剂，酸和碱充分洗涤用于演示的去除残留sporoplasmic内容;和SEC干燥证明利用对流干燥和真空烘箱干燥。在第三部分中，SEC真空装载证明利用模型蛋白的真空加载，牛血清白蛋白（BSA），其次是BSA-加载-SEC洗涤和冷冻干燥。在第四部分中，determin的BSA包封率通货膨胀论证利用离心，超声探头和紫外/可见光光谱。
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Protocol
1.孢粉外壁胶囊的提取（秒）从L. clavatum孢子
注意：美国证券交易委员会的提取过程涉及的易燃粉（L. clavatum），热腐蚀性酸和易燃溶剂，因此，适当的个人防护装备（护目镜，面罩，手套，实验室外套），使用情况获得批准的风险评估和处置由授权的实验室工作人员的化学品是必不可少的。
- 孢子脱脂
- 通过使用玻璃冷凝器，循环水系统，和水浴（ 图1）准备在通风橱中回流设置。
- 称取百克L. clavatum孢子不要产生灰尘和任何火源。
注意：这里使用的是商业上获得孢子（见材料清单）。 - 转印孢子慢慢到1L聚四氟乙烯（PTFE）的圆底烧瓶中有磁力搅拌棒。
- 500ml丙酮添加到在孢子聚四氟乙烯烧瓶中并轻轻摇动烧瓶中以形成均匀悬浮液。
- 放置在水浴集聚四氟乙烯烧瓶在50℃下，并连接到回流冷凝器。
- 在丙酮进行回流6小时，以200rpm搅拌，然后允许在室温冷却。
- 使用过滤器真空过滤纸暂停并收集孢子脱脂大（直径15厘米）的玻璃培养皿中。
- 通过用铝箔与溶剂蒸发的孔覆盖干燥，在室温（通风柜）的孢子。
- 酸解
- 制备85％（V / V）磷酸，用去离子（DI）水和脱脂干孢子转移到一个1升的PTFE烧瓶中。
- 500毫升的磷酸（85％V / V）添加到脱脂孢子。
- 放置在水浴集聚四氟乙烯烧瓶在70℃，并连接到回流冷凝器。
- 在磷酸执行温和回流（70℃）30小时，然后允许凉爽室温。
- 通过用500毫升温去离子水稀释悬挂和使用滤纸真空过滤收集SEC的。
- 转移SEC的一个3升的玻璃烧杯中进行一系列洗涤的。
- SEC清洗
- 放置装有肝窦在通风橱中的3升玻璃烧杯中。
- 800毫升热（50℃）去离子水添加到SEC的温和搅拌10分钟。
- 通过使用滤纸和真空过滤设置进行过滤悬浮液中。
- 收集SEC的在干净的3升的玻璃烧杯中。
- 重复步骤1.3.1。 1.3.4。五次。
- 添加600毫升热（45℃）丙酮SEC的温和搅拌10分钟。
- 通过过滤收集SEC的真空下和SEC的转移到一个干净3升玻璃烧杯中。
- 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。用600毫升热（50℃）的2M盐酸。
- 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。使用600毫升浩T（50°C）2M的氢氧化钠。
- 重复步骤1.3.1和1.3.4八次。
- 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。用600毫升热（45℃）丙酮。
- 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。用600毫升热（45℃）乙醇。
- 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。使用800毫升热（50℃）去离子水。
- 转移清洁SEC的六个大的玻璃培养皿中，并干燥在通风橱中在室温下放置24小时以除去所有的水含量。
- 干燥在真空烘箱SEC的在60℃和1毫巴下真空10小时或直至恒重。
- 收集干燥的SEC的并转移到聚丙烯瓶中。
- 在干燥的柜子存放SEC的。
2. SEC的表征
- 使用在不同阶段产生的孢子和肝窦进行扫描电子显微镜分析41。
- 使用在不同阶段产生的孢子和SEC的执行元素分析41。 ðRY在60℃元素分析之前至少1小时的所有样品，并计算使用具有6.25乘法系数氮百分比的蛋白质含量。11获取使用用于每个样品一式三份测量的结果。
- 使用动态图像颗粒分析仪进行粉体学性质分析。41
- 使用共聚焦激光扫描显微镜扫描未处理，处理，和FITC-BSA的加载肝窦41
3.生物大分子封装真空载荷技术
- 准备使用去离子水，并转移到50毫升聚丙烯试管的1.2ml 125毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）溶液。
- 重150毫克肝窦的并传送到BSA溶液。
- 涡管10分钟，以形成均匀的溶液。
- 封面用滤纸筒。
- 在1毫巴管转移到冻干机瓶和干燥4小时真空。
- 执行步骤3.1到3.5。三个独立的批次。
- 收集的BSA加载肝窦并使用研钵和杵除去团块。
- 传送BSA的加载肝窦至50ml管中并加2ml DI水以去除残留的BSA。
- 收集离心SEC的在4704×g离心5分钟并弃上清。
- 重复用DI水洗涤一次。
- 覆盖含有用滤纸BSA加载肝窦管。
- 转移SEC的一个冰箱（-20℃），并冷冻1小时。
- 冷冻干燥SEC的在冷冻24小时，直到店进一步鉴定。
- 准备用同样的步骤不含BSA安慰剂SEC的如在步骤3.1。 3.13。
- 使用相同的程序，在3.1的步骤制备FITC-BSA加载肝窦。 3.13。
4.测定包封率
- 称量5毫克BSA-加载肝窦在2ml聚丙烯管中。
- 加入1.4毫升磷德缓冲盐水pH为7.4（PBS）中，并涡旋5分钟。
- 探针超声处理在40％振幅的悬浮液10秒的3个循环。
- 过滤用0.45微米的聚醚砜（PES）过滤器解决方案。
- 执行相同的步骤，在步骤4.1。 4.4。使用安慰剂SEC的。
- 测量在使用安慰剂作为空白280nm的吸光度。
- 量化使用在PBS中BSA标准曲线（200至1000微克/毫升）包封的BSA的量。42
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Representative Results
对于孢粉外壁胶囊简化提取工艺
该L. clavatum SEC提取由三个主要步骤实现：（1）用丙酮脱脂; （2）酸解使用磷酸85％（体积/体积）;并使用（3）广泛SEC洗涤溶剂。流线型SEC提取处理的流程在图1中提示的-我简言之，该方法涉及在50℃下用丙酮回流一个脱脂步骤6小时，然后将脱脂孢子在通风橱中干燥过夜，以除去残余丙酮。脱脂孢子进行使用磷酸进行30小时以酸解。在酸解大多数sporoplasmic材料均溶解，然后在真空过滤步骤除去。为了使用溶剂来去除残留的sporoplasmic材料一系列广泛的洗涤步骤，酸中，进行的基础上，和水。 SEC的在RT最初干燥24小时，并在60℃和1毫巴下真空进一步干燥10小时以除去残留的溶剂和水分。
如图1所示，在一个危险通知通风橱中进行所有SEC萃取步骤。期间SEC萃取，约70％的质量损失，由于从初始脱脂步骤观察到去除sporoplasmic材料和我们的数据与生产清洁和完好肝窦的现有报告是一致的。7，19,20,29的简化的流程最终产品是在约5天内完成，该方法可以很容易地扩展到1kg的实验室规模批次与适当的安全控制。
男，这些是有利的，由于没有involvin是简单的步骤， -利用SEC的包封步骤在图1焦耳呈现摹苛刻的有机溶剂或需要机械剪切力。7我们封装实验涉及150毫克SEC的和一个装载溶液的体积足够摄取SEC的。在这些SEC的装载是由化合物的溶解度在选定的水或有机溶剂的限制，和装载可通过任何三种装载方法来实现：被动，压缩和真空负载。然而，真空加载提供了化合物的相对较高的封装。7，19,20
孢粉外壁胶囊的物化表征
来确定通过使用图1中呈现的精简方法生产肝窦的清洁度，表面和横截面形态，粉体学性质，和元素的组合物在SEC提取过程的不同阶段进行了检查。如图图2中，SEM图像表明了一个独特的微观结构完好孢子和处理之前，在横截面图像中观察到微米尺度sporoplasmic细胞器。随着孢子脱脂和碱处理是从sporoplasmic细胞器观察到的破裂除了没有形态和结构的变化。
图3示出了使用磷酸在不同时间点从5小时至30小时酸解后肝窦的SEM图像。这些结果支持了酸解长达30小时提供泯灭sporoplasmic材料的完整和干净的肝窦。为了证实残留的蛋白质物质，CHN元素分析29进行和数据列于图4。这些结果提供了选择最佳加工条件，实现清洁，完好SEC的指导方针。在脱脂和碱处理SEC的情况下，没有实质性的蛋白质材料去除观察。然而，在使用磷酸酸解，多数蛋白质的材料是在30小时除去并没有进一步减少与增加处理时间多达120小时观察到。元素数据与SEC的7,11的延伸加工和商业肝窦以前的报告一致。
粉体学性质通过动态图像颗粒分析（DIPA）分析，结果显示在图5中。这些结果支持酸解后肝窦的粒度分布均匀长达30小时，用尺寸为31.0±2.2微米。与此相反，SEC结构完整性与长期酸解减少，开始引起超出30小时的治疗持续时间SEC的的显著碎片。
图6示出用于与仅酸解亲产生肝窦的SEM和DIPA数据使用磷酸进行30小时cessing。这些结果证实，在脱脂步骤之后，酸解产生干净和完好SEC的32.5±2.7微米的粒度分布均匀。酸解仅SEC的具有仅0.15±0.0％的残留蛋白含量，以相确定为％的氮含量，11以上，并与以前的报告中讨论这与通过碱和酸解处理制肝窦7
通过孢粉外壁微胶囊胶囊
为了证明使用L的使用唯一的酸解工艺生产clavatum肝窦，使用BSA作为模型蛋白进行微胶囊化实验。装载到SEC的是通过使用真空加载技术用150mg肝窦和1.2毫升125毫克/毫升牛血清白蛋白来实现的。 图7示出了CLSM即时之前和之后仅酸解处理以及与FITC-BSA封装肝窦的年龄。数据表明未处理肝窦展览自发荧光由于sporoplasm成分的存在下，孢子腔内。然而，在仅酸解加工，所有sporoplasmic内容被除去造成空内腔。引人注目的是，FITC-BSA的包封后，绿色荧光SEC的内部观察，证实了模型蛋白进入肝窦的封装。19,20,41
此外，调查的BSA的载肝窦，SEM和DIPA分析被进行，该数据在图8中给出。该SEM图像证实完整且干净的微嵴的BSA的加载后的存在形态改变和粉体学性质。另外，在直径，圆形度和纵横比观察的BSA装入肝窦后没有实质性的变化。这些数据是consisteNT上的使用SEC的药物包封以前的报告。7,10
量化包封的BSA的量，BSA从5毫克BSA加载肝窦的萃取，将数据在表1中。这些数据表明0.170±0.01每克肝窦的BSA的负载。总体而言，SEM，DIPA，激光共聚焦显微镜，并通过光谱分析BSA的量化，确定BSA的L.成功封装clavatum肝窦和SEC形态稳定性。
图为 L. 1.简化提取工艺 clavatum 孢粉外壁胶囊（秒）。 （A）未处理的孢子。（B）的孢子用50℃的回流设置为6小时脱脂（C）溶剂的过滤和收集离子脱脂孢子（D）在室温下脱脂孢子干燥（E）中，用85％（V / V）磷酸在70℃下进行30小时的PTFE烧瓶孢子酸解。用真空过滤（F）的酸的过滤用真空烘箱在60℃和1毫巴下真空10小时建立。使用一系列水，酸，碱（G）的 SEC洗涤和溶剂洗涤步骤。（H）的 SEC干燥。（Ⅰ）完整，清洁并干燥SEC的作为最终产品。（J）混合的肝窦和BSA的解决方案。（K）的肝窦和BSA溶液均匀化。（L）BSA的真空装载到SEC的。（M）BSA-装肝窦。 请点击此处查看该图的放大版本。
54768 / 54768fig2.jpg“/>
L.图2.扫描电子显微镜分析在预酸处理的不同阶段clavatum孢子。（A）未经处理的孢子显示sporoplasmic细胞器和生物分子。（B）丙酮处理孢子显示打乱sporoplasmic内容。（C）（D）碱处理孢子显示去除sporoplasmic内容皱内部纤维素内壁层。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
L.图3.扫描电子显微镜分析在酸的不同阶段clavatum孢子治疗5〜30小时（A - D）分别，5，10，20和30小时酸处理的孢子显示完整的外部微观结构和干净的内部腔体。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.孢子外壁孢粉素胶囊（秒），治疗的各个阶段之后，蛋白质含量和蛋白质含量 。表示的数据是平均三次测量的标准偏差（n = 3）。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看大版本OF该数字。
孢子图5.动态成像颗粒分析（DIPA）和孢粉外壁胶囊在治疗的不同阶段（秒）列（A - C）分别是，酸预处理，酸处理，和完整SEC的。图是SEC直径，圆形度，纵横比，和边缘梯度的代表性的曲线图。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. 扫描电子显微镜（SEM）和30小时的动态成像粒子分析（DIPA）AcidolySIS-只孢粉外壁胶囊（秒）。（A）SEC的显示完整的外部微观结构和干净的内部腔体。（B）美国证券交易委员会的直径，圆度，和纵横比的代表图。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7.激光共聚焦显微镜前和治疗BSA封装后的孢粉外壁胶囊（秒）的（CLSM）分析。第一行显示了未经处理的孢子显示sporoplasmic细胞器和生物分子自发荧光。第二行描述了一个空的内腔30小时只酸解，SEC的。第三行示出了FITC-BSA装进入30小时只酸解，SEC的。 （比例尺是10微米）。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8.扫描电子显微镜（SEM）和BSA的载孢粉外壁胶囊（秒）的动态成像粒子分析（DIPA）表征。 BSA的加载SEC的（A）的SEM图像。（B）中的BSA-装载SEC直径，圆形度，纵横比，和边缘梯度的代表性的曲线图。从41改编，并与科学报告许可使用。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1.牛血清白蛋白（BSA）为未处理孢子和肝窦的封装 。 用于每150毫克一批“未经处理的孢子”或“SEC的”装载的BSA溶液的体积。表示的数据是一式三份的平均批与标准偏差（n = 3）。从41改编，并与科学报告允许使用。
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Discussion
在这项工作中，从L. SEC提取的系统分析clavatum孢子提出并此报告表明，它能够生产更高质量的胶囊剂，同时实现11的预先存在的常用协议。一个显著精简与此相反的现有协议需要高的处理温度（180℃）和一个较长的过程持续时间（7天）， 第11的当前SEC提取处理优化主要是集中于降低酸解步骤的温度和持续时间。
脱脂，碱处理提供了从最小的孢子去除sporoplasmic材料。然而，从5小时酸解至120小时除去sporoplasmic材料的最大金额。结果表明，总的处理时间和温度可以从常规的技术，11大幅度减少，并且在适中的温度仅30小时（70℃）磷酸中提供的最佳质量胶囊。另外，超过30小时的酸解，我们发现，该SEC的开始断裂并观察到在粒子片段一个显著增加，这表明SEC的整批可以表现出在总体结构完整性的下降。另外，应该指出的是，L。 clavatum被认为包括相对健壮孢粉，2和参与这一协议的具体的处理条件，例如，酸浓度，温度，和/或水解的持续时间，可能需要调整为其他花粉物种。
它表明，通过酸解，仅使用磷酸（85％V / V）为30小时的产量清洁和完好肝窦41的数据证实，酸解是SEC中生产的关键步骤生产肝窦的。最后，使用酸仅肝窦对于BSA的包封和观察到高度加载的。加载W¯¯作为用真空，由此内部SEC腔压力被改变强行绘制BSA溶液送入空胶囊的应用来实现。纳米通道（直径15日- 20纳米），其已在L的外壁壁已预先确定的草 ，7允许溶液进入到大的内部空腔。装载后，将胶囊洗涤并在冷冻干燥器中干燥，得到自由流动的粉末。
大小的均匀性和形态特征是用于评估一个成功的封装材料的质量的重要因素。 BSA装载SEC的观察到的大小均匀和完整的形态酸解证实只处理SEC的的微胶囊化应用的潜力用法。
这些结果是重要的大规模工业生产肝窦的并用于刺激在药物的微胶囊在SEC的潜在应用更大的兴趣，蛋白质，肽，食品补充剂，营养保健品，化妆品等。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lycopodium clavatum spores (s-type) | Sigma | 19108-500G-F | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | |
| FITC-conjugated BSA | Sigma | A9771-250MG | |
| Phosphoric acid (85% w/v) | Sigma | 438081-2.5L | |
| Hydrochloric acid | Sigma | V800202 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-1KG | |
| Acetone | Sigma | V800022 | |
| Ethanol | AcME | C000356 | |
| Deionized water | Millipore purified water | ||
| Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose) | |||
| Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm) | Thermoscientific (CA, USA) | 4250A | |
| Vectashield | Vector labs (CA, USA) | H-1000 | |
| Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide | Ibidi GmbH (Munich, Germany) | 10812 | |
| Commercial Lycopodium SECs (L-type) | Polysciences, Inc. (PA, USA) | 16867-1 | |
| Heating plates | IKA, Germany | ||
| Scanning electron microscope | Jeol, Japan | JFC-1600 | |
| Elemental analyzer | Elementar, Germany | VarioEL III | |
| FlowCam: The benchtop system | Fluid Imaging Technologies, USA | FlowCamVS | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Germany | LSM710 | |
| Freeze dryer | Labconco, USA | ||
| UV Spectrometer | Boeco, Germany | S220 |
References
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