Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הפקת קפסולות צמחית עבור יישומי מיקרואנקפסולציה

Published: November 9, 2016 doi: 10.3791/54768
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

כתב יד פרוטוקול / זה מתאר תהליך יעיל לייצור קפסולות exine sporopollenin (שניות) מ נבגי clavatum Lycopodium ועבור והעמסת תרכובות הידרופיליות לתוך SEC שניות אלה.

Abstract

Microcapsules נגזר נבגים על בסיס צמחי או אבקה לספק פלטפורמה איתנה עבור מגוון רחב של יישומים מיקרואנקפסולציה. קפסולות exine Sporopollenin (שניות) מתקבלות כאשר נבגים או אבקת מעובדים כדי להסיר את תוכן sporoplasmic הפנימי. Microcapsules החלול וכתוצאה להפגין רמה גבוהה של אחידות micromeritic ולשמר תכונות microstructural מורכבים קשורים מיני צמחים בפרט. בזאת, אנחנו מדגימים תהליך יעיל לייצור secs from נבגים clavatum Lycopodium ועבור והעמסת תרכובות הידרופיליות לתוך SEC שניות אלה. הליך בידוד SEC הנוכחי עבר אופטימיזציה לאחרונה כדי להפחית את דרישות העיבוד משמעותי אשר משמשות כמקובל בבידוד SEC, ועל מנת להבטיח את הייצור של microcapsules ללא פגע. טבעי L. נבגי clavatum הם נטולי שומן עם אצטון, שטופלו בחומצה זרחתית, ורחצו נרחבים כדי להסיר sporoplasmiתוכן ג. לאחר אצטון defatting, צעד עיבוד בודד באמצעות 85% חומצה זרחתית הוכח להסיר את כל התוכן sporoplasmic. על ידי הגבלת זמן עיבוד החומצה ל -30 שעות, אפשר לבודד SEC שניות נקיות ולהימנע שבירת SEC, אשר הוכחה להתרחש עם זמן עיבוד ממושך. כביסה נרחבת עם מים, לדלל חומצות, בסיסים לדלל, וממסים מבטיחים כי כל שאריות החומר כימי sporoplasmic יוסרו כראוי. הטכניקה טעינת ואקום הוא מנוצל כדי לטעון חלבון מודל (שור סרום אלבומין) כמתחם הידרופילי נציג. טעינת אבק מספקת טכניקה פשוטה לטעון תרכובות שונות ללא צורך ממסים קשים או כימיקלים לא רצויים אשר נדרשים לעתים קרובות בפרוטוקולים מיקרואנקפסולציה אחרים. מבוסס על פרוטוקולי בידוד וטעינה אלה, SEC שניות לספק חומר מבטיח לשימוש במגוון רחב של יישומי מיקרואנקפסולציה, כגון, תרופות, מזון, קוסמטיקה, לדרבן טיפוח אישיucts.

Introduction

יש עניין משמעותי בכמוסות צמחיות טבעיות המתקבלות נבגי צמח פריחה לשימוש ביישומי מיקרואנקפסולציה. 1-15 בטבע, נבגים ואבקה לספק הגנה לחומרים גנטיים רגישים מפני תנאים סביבתיים קשים. המבנה הבסיסי של נבגי צמח ואבקה בדרך כלל כולל שכבת מעטפת חיצונית (exine), שכבת קליפה פנימית (intine), וחומר ציטופלסמית הפנימי. Exine מורכבת biopolymer חזק מבחינה כימית 1,9,10,13,16 המכונה sporopollenin ואת intine מורכבת בעיקר של חומרים מתאית. 16-18 קפסולות ריקות יכולות להיות מבודדות על ידי תהליכים שונים 7,9 להסרת חומר cytoplasmic חלבונים,, ושכבת intine. 2,12,16 אלה כמוסים exine sporopollenin (שניות) לספק חלופה איכותית encapsulants הסינטטי עקב התפלגות גודל הצרה שלהם ומורפולוגיה אחידה. 7,9,13,19,20פיתוח של תהליכים סטנדרטיים להשיג secs from מיני צמחים שונים, כגון Lycopodium clavatum, ופותח את האפשרות עבור מגוון רחב של יישומים מיקרואנקפסולציה בתחומי אספקת סמים, מזון ומוצרי קוסמטיקה. 6,10-13,21

על מנת לקבל שניות, החוקרים טיפלו הראשונה נבגים ואבקה עם ממיסים אורגניים refluxed בתמיסות בסיסיות להסיר תוכן cytoplasmic. 22-25 עם זאת, המבנה כמוסה הנותרים נקבע עדיין להכיל את שכבת intine מתאית. כדי להסיר את זה, חוקרים בחנו את השימוש בעיבוד הידרוליזה חומצית ממושך באמצעות חומצה הידרוכלורית, חומצה גופרתית חמה, או חומצה זרחתית חמה על פני כמה ימים, 22-25 עם חומצה זרחתית היא השיטה המועדפת של הסרת intine SEC. 2 עם זאת, מתמשך מחקר לאורך השנים הראה כי נבגי פריחה שונים יש דרגות שונות של חוסן אל הקשה עיבוד אותיthods נפוץ. 26,27 חלק נבגי פריחת מפורקים לחלוטין ולאבד את כל השלמות המבנית בתמיסות בסיסיות חזקות, או ניזוק בכבדות בפתרונות חומצי חזקים. 16 ההשתנות בתגובת SEC לתנאי טיפול בשל שינויים קלים הכימי מבנה ומורפולוגיה exine של חומר sporopollenin exine בין מינים. 28 לאור ההשתנות באיתנות קפסולות exine sporopollenin (שניות), יש צורך לייעל את תנאי עיבוד עבור כל מין של נבג ואבקה.

נבגי צמח מן המין L. clavatum הפך המקור היחיד למד הנרחב ביותר של שניות. מוצע כי זה נובע בעיקר בזמינותו הנפוצה, בעלות נמוכה, monodispersity, וחוסנם כימי 9,29 הנבגים ניתן לקצור בקלות להכיל תוכן sporoplasmic בצורת קבוצות של 1 -. 2 מיקרומטר אברונים הסלולר בiomolecules. 11 ל נבגי clavatum שמשו כחומר סיכת אבקה טבעית, 30,31 בסיס תמרוקים, 30 ו בצמח מרפא 32-36 עבור מגוון רחב של יישומים רפואיים. SEC שניות המתקבל L. clavatum הוכח להיות עמיד יותר עיבוד מאשר SEC שניות ממינים אחרים של נבגים ואבקה. 2 לאחר עיבוד, SEC השניות וכתוצאה הוכחו לשמור מבני microridge המורכבים שלהם ואחידות מורפולוגיים גבוהה תוך מתן חלל פנימי גדול אנקפסולציה. 7 מחקרים מצביעים על כך ל SEC שניות clavatum יכולה לשמש עבור אנקפסולציה של תרופות, 10,13 חיסונים, 11 חלבונים, 7,14 תאים, 8 שמנים, 5-7,9 ותוספי מזון. 5-15 יעילות טעינת SEC נצפתה הן גבוהה יחסית בהשוואה קונבנציונלית חומרי אנקפסולציה. 7 יש גם מספר יתרונות דיווחאנקפסולציה SEC כגון היכולת להסוות טעמים, 6,10 ו לספק מידה מסוימת של הגנה טבעית מפני חמצון. 12 המחקרים הקיימים, שיטת החילוץ SEC הנפוץ ביותר עבור L. clavatum מבוססת על ארבעה שלבים עיקריים. שלב ראשון הוא refluxing ממס אצטון עד 12 שעות ב 50 ° C עד defat הנבגים. 11 שלב שני הוא refluxing אלקליין הידרוקסיד אשלגן 6% לתקופה של עד 12 שעות ב 120 ° C כדי להסיר ציטופלסמית וחומרים חלבוניים. 11 שלב שלוש הוא refluxing חומצה חומצה זרחתית 85% לתקופה של עד 7 ימים בחום של 180 מעלות כדי להסיר את החומר intine מתאית. 11 שלב רביעי הוא תהליך הכביסה מקיף באמצעות מים, ממיסים, חומצות, בסיסים כדי להסיר את כל החומר הנותר הלא exine ושאריות כימיות.

המטרות העיקריות של מיצוי SEC ביחס ליישומים אנקפסולציה הן לייצר קפסולות אשר ריקות של חומר cytoplasmic, חינם הלוך ושובמ חלבונים אלרגניים פוטנציאלי, שלמים מורפולוגית. 2,37 עם זאת, מנקודת מבט ייצור תעשייתי, זה חשוב גם לקחת בחשבון גורמים כלכליים וסביבתיים נוספים, כגון, התייעלות אנרגטית, משך ייצור, בטיחות, ופסולת שהתקבלה. באשר ליעילות אנרגיה, הוא טמפרטורות גבוהות זמני עיבוד ארוכים משפיעים על מחירי ייצור, כמו גם טביעת רגל סביבתית. משך ייצור וזמן אספקה ​​הם גורמים מרכזיים המשפיעים רווחי עיבוד. דאגה מיוחדת היא עיבוד חומצה זרחתית בטמפרטורה גבוהה מגדילה בעיות בטיחות ידוע לגרום דרוג מאכל אשר מוביל עליות משמעותיות תחזוקת תשתית עיכובים בזמני הביצוע אצווה. 38-40 במידת האפשר, צמצום מספר הצעדים הנדרשים עלול להוביל כדי לצמצם את הפסולת המיוצרת באופן משמעותי. עם זאת, נפוץ תהליך ארבעה שלבים של L. מיצוי clavatum SEC יש פשוט evolved מעשרות שנים של מחקר צופה אופטימיזציה תהליך בפועל מעט. לאחרונה, Mundargi et al., 41 תרם תרומה משמעותית העבודה השוטפת בתחום זה על ידי הערכה שיטתית ואופטימיזציה אחת טכניקות חילוץ SEC הנפוצות ביותר שדווחו.

בחלק הראשון של מחקר זה: defatting נבג מודגם ניצול עיבוד אצטון על 50 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות; sporoplasm ונהלי intine הסרת מודגמות ניצול עיבוד חומצה זרחתית 85% ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות; כביסה נרחבת עם מים, ממסים, חומצה, בסיס משמשת כדי להדגים את הסרת תוכן sporoplasmic שיורית; ייבוש SEC מודגם ניצול ייבוש הסעה וייבוש ואקום תנור. בחלק השלישי, טעינת ואקום SEC מודגם ניצול טעינת ואקום של חלבון המודל, אלבומין בסרום שור (BSA), ואחריו BSA טעון-SEC כביסה lyophilization. בקטע הרביעי, determination של יעילות אנקפסולציה BSA מודגם ניצול צנטריפוגה, לחקור sonication, ו- UV / Vis ספקטרומטריית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפקת קפסולות Sporopollenin Exine (שניות) מ ל clavatum נבגים

הערה: תהליך החילוץ SEC כרוך אבקה דליקה (L. clavatum), חומצות מאכל חמות, וממסים דליקים, ולכן ציוד מתאים אישית מגן (משקפי מגן, מסיכת פנים, כפפות, חלוק מעבדה), הערכת סיכונים אושרו על שימוש, וסילוק כימיקלים על ידי אנשי מעבדה מוסמכים הם חיוניים.

  1. Spore Defatting
    1. הכן הגדרת ריפלוקס במנדף באמצעות מעבה זכוכית, מערכת זרימת מים, מים וכלי רחצה (איור 1).
    2. לשקול 100 גרם ל נבגי clavatum מבלי ליצור אבק הרחק מכל מקור הצתה.
      הערה: הנבגים משמשים כאן התקבלו מסחרי (ראה רשימת חומרים).
    3. נבגים העברת לאט אל polytetrafluoroethylene 1 L (PTFE) בסיבוב הבקבוק התחתון עם מוט בחישה מגנטית.
    4. הוסף 500 מ"ל אצטון כדי נבגים בבקבוק PTFE ולנער את הבקבוק בעדינות כדי ליצור השעיה הומוגנית.
    5. מניח את בקבוק PTFE במערכה באמבט מים ב 50 ° C ולהתחבר קבל ריפלוקס.
    6. בצע refluxing אצטון במשך 6 שעות עם ערבוב ב 200 סל"ד ולאחר מכן להתקרר ב RT.
    7. סנן את ההשעיה באמצעות נייר סינון תחת ואקום לאסוף את נבגי נטול שומן בצלחות פטרי זכוכית גדול (15 ס"מ קוטר).
    8. ייבש את הנבגים בטמפרטורת חדר (במנדף) על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום עם חורים לאידוי ממס.
  2. Acidolysis
    1. כן 85% (v / v) חומצה זרחתית עם יונים (DI) מים ולהעביר נבגים יבשים נטולי שומן בבקבוק 1 ליטר PTFE.
    2. הוסף 500 מיליליטר של חומצה זרחתית (85% v / v) את הנבגים נטולי שומן.
    3. מניח את בקבוק PTFE ב סט באמבט מים ב 70 ° C ולהתחבר קבל ריפלוקס.
    4. בצע refluxing העדין (70 מעלות צלזיוס) בחומצה זרחתית במשך 30 שעות ולאחר מכן לאפשרמגניב בטמפרטורת החדר.
    5. לדלל את ההשעיה באמצעות 500 מ"ל מים חמים DI לאסוף את SEC שניות על ידי סינון ואקום באמצעות נייר סינון.
    6. מעביר את השניות כדי כוס זכוכית 3 L לבצע סדרה של כביסות.
  3. כביסת SEC
    1. מניח את כוס זכוכית 3 L המכילה SEC שניות במנדף.
    2. להוסיף 800 מיליליטר חם (50 מעלות צלזיוס) מים די אל SEC השני עם ערבוב עדין במשך 10 דקות.
    3. סנן את ההשעיה באמצעות נייר סינון וכן הגדרת סינון ואקום.
    4. אסוף את SEC השניות בכוס 3 L זכוכית נקיה.
    5. חזור על שלבים 1.3.1. עד 1.3.4. חמש פעמים.
    6. להוסיף 600 מיליליטר חם (45 מעלות צלזיוס) אצטון אל SEC השני עם ערבוב עדין במשך 10 דקות.
    7. אסוף את SEC השניות על ידי סינון תחת ואקום ולהעביר את השניות כדי מבחנת 3 L זכוכית נקיה.
    8. חזור על שלבים 1.3.6. ו 1.3.7. באמצעות 600 מ"ל חם (50 ° C) 2 חומצה הידרוכלורית M.
    9. חזור על שלבים 1.3.6. ו 1.3.7. באמצעות 600 מ"ל הוt (50 ° C) 2 M נתרן הידרוקסידי.
    10. חזור על שלבים 1.3.1 ו 1.3.4 שמונה פעמים.
    11. חזור על שלבים 1.3.6. ו 1.3.7. באמצעות 600 מ"ל חם אצטון (45 מעלות צלזיוס).
    12. חזור על שלבים 1.3.6. ו 1.3.7. באמצעות 600 מ"ל חם אתנול (45 מעלות צלזיוס).
    13. חזור על שלבים 1.3.6. ו 1.3.7. באמצעות 800 מ"ל חם (50 מעלות צלזיוס) מים די.
    14. מעביר את SEC שניות הנקיות לשש צלחות פטרי זכוכית גדולות ויבשות במנדף ב RT למשך 24 שעות כדי להסיר את כל תכולת המים.
    15. יבש את SEC שניות בתנור ואקום ב 60 ° C ו 1 mbar ואקום במשך 10 שעות או עד משקל קבוע.
    16. אסוף את SEC השניות היבשות להעביר בקבוק פוליפרופילן.
    17. אחסן את SEC השנייה בארון יבש.

.2 אפיון SEC השני

  1. ביצוע ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים סורק 41 באמצעות נבגים SEC שניות המיוצר בשלבים שונים.
  2. בצע ניתוח יסודי 41 באמצעות נבגים SEC שניות המיוצר בשלבים שונים. Dר"י כל הדגימות ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לפחות לפני ניתוח יסודות ולחשב את תכולת החלבון באמצעות חנקן אחוזים עם מקדם הכפלה של 6.25. 11 להשיג תוצאות באמצעות מדידות בשלושה עותקים עבור כל דגימה.
  3. לנהל נכסי ניתוח micromeritic באמצעות נתח חלקיק תמונה דינמי. 41
  4. סרוק מעובד, מעובדים SEC שניות FITC-BSA טעונים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. 41

3. Encapsulation Biomacromolecule ידי טכניקה טוען אבק

  1. הכן 1.2 מ"ל של 125 מ"ג / אלבומין בסרום שור מ"ל פתרון (BSA) באמצעות DI מים והעברת צינור פוליפרופילן 50 מ"ל.
  2. לשקול 150 מ"ג של SEC השנייה ולהעביר את פתרון BSA.
  3. וורטקס הצינור במשך 10 דקות כדי ליצור תמיסה הומוגנית.
  4. מכסים את הצינור באמצעות מסנן נייר.
  5. מעבירים את הצינור בבקבוק מייבש להקפיא ויבש למשך 4 שעות עם ואקום ב 1 mbar.
  6. לבצע שלבים 3.13.5. במשך שלוש קבוצות עצמאיות.
  7. אסוף את SEC שניות BSA טעון ולהסיר את agglomerates באמצעות ובמכתש.
  8. מעבירים את SEC שניות BSA טעונים לצינור 50 מ"ל ולהוסיף מים 2 מ"ל DI להסיר את BSA שיורית.
  9. אסוף את SEC שניות על ידי צנטריפוגה ב 4,704 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
  10. חזור על כביסה עם DI מים פעם.
  11. מכסים את הצינור המכיל SEC שניות טעון BSA באמצעות נייר סינון.
  12. מעביר את השניות כדי במקפיא (-20 ° C) ולהקפיא עבור שעה 1.
  13. להקפיא לייבש את SEC שניות למשך 24 שעות ולאחסן במקפיא עד אפיון נוסף.
  14. הכן את SEC שניות פלצבו ללא BSA באותו אופן כמו צעדים 3.1. כדי 3.13.
  15. הכן את SEC שניות FITC-BSA טעון באותו אופן כמו צעדים 3.1. כדי 3.13.

4. קביעת יעילות Encapsulation

  1. לשקול 5 מ"ג של SEC שניות BSA-טעון 2 מ"ל צינורות פוליפרופילן.
  2. להוסיף 1.4 מ"ל phosphate שנאגר מלוחים pH 7.4 (PBS) ו מערבולת למשך 5 דקות.
  3. Probe sonicate ההשעיה ב משרעת 40% במשך 3 מחזורים של 10 שניות.
  4. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר polyethersulfone (PES).
  5. בצע אותו נוהל כמו בצעדים 4.1. ל -4.4. באמצעות SEC שניות פלצבו.
  6. מדוד את הספיגה ב 280 ננומטר באמצעות פלצבו כמו ריק.
  7. לכמת את כמות BSA במארז באמצעות עקומת סטנדרט BSA (200 עד 1,000 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תהליך הפקה יעיל עבור קפסולות Sporopollenin Exine

L. מיצוי clavatum SEC הושג על ידי שלושה שלבים עיקריים: (1) Defatting באמצעות אצטון; (2) Acidolysis באמצעות חומצה זרחתית 85% (V / V); ו (3) שטיפת SEC נרחבת באמצעות ממסים. זרימת תהליך חילוץ SEC היעיל מוצגת באיור 1 א -. אני בקצרה, התהליך כרוך צעד defatting עם refluxing אצטון במשך 6 שעות ב 50 מעלות צלזיוס, הנבגים נטולי השומן ואז יובשו הלילה במנדף להסיר שיורית אֲצֵטוֹן. הנבגים נטולי השומן היו נתוני acidolysis באמצעות חומצה זרחתית במשך 30 שעות. במהלך acidolysis רוב חומרי sporoplasmic מתמוססים ולאחר מכן הוסר במהלך שלב סינון ואקום. על מנת להסיר חומרי sporoplasmic שיורית סדרה מקיפה של צעדי כביסה בעזרת ממסים, חומצה, בסיס, והיא מבוצעת מים. SEC השניות בתחילה יובשו ב RT במשך 24 שעות מיובשות נוסף ב 60 ° C ו 1 mbar ואקום במשך 10 שעות כדי להסיר ממסים שיורית ולחות.

כפי שניתן לראות בתרשים 1, כל צעדי חילוץ SEC בוצעו במנדף עם הודעת מפגע. במהלך חילוץ SEC, כ 70% אובדן מסה הוא ציין עקב הסרת חומרי sporoplasmic והנתונים שבידינו עולים בקנה אחד עם דיווחים קיימים של הייצור של SEC שניות נקיות והשלמות. 7, 19,20,29 התהליך היעיל מהשלב הראשוני defatting אל המוצר הסופי הושלמה בימים כ 5 ותהליך וניתן לשנותם בקלות עד אצווה בקנה מידה מעבדה 1 ק"ג עם בקרות בטיחות נאותה.

צעדים Encapsulation ניצול SEC שניות מוצגים באיור 1 J - M, אלה הם יתרון בשל צעדים פשוטים להיות בלי involvinממסים גרם אורגניים קשים או הדורשים כוחות גזירה מכאניים. 7 הניסויים אנקפסולציה שלנו לערב 150 מ"ג של SEC השנייה ואת נפח פתרון טעינה מספיק לספיגה על ידי השניות. הטעינה לפי סעיפים אלה היא מוגבלת על ידי מסיסות מתחם שנבחר ממיס מימי או אורגני, וטעינה יכולה להיות מושגת על ידי כל אחת משלוש שיטות טעינה: פסיבית, דחיסה וטעינת ואקום. עם זאת, טוען ואקום מספק אנקפסולציה יחסית גבוהה של תרכובות. 7, 19,20

אפיונים physicochemical של Sporopollenin Exine קפסולות

כדי לקבוע את הניקיון של SEC שניות מיוצרות באמצעות התהליך היעיל מוצג באיור 1, את המורפולוגיה פני שטח החתך, תכונות micromeritic, ורכב יסודות נבחנו בשלבים שונים של תהליך חילוץ SEC. כפי שניתן לראותאיור 2, התמונות SEM מצביעים נבגים שלם עם מיקרו ייחודי, ולפני עיבוד, אברונים sporoplasmic בקנה מידה מיקרון נצפו בתמונה חתך. עם defatting נבג וטיפול אלקלי אין שינויים מורפולוגיים ומבניים נצפו מלבד פקיעת האברונים sporoplasmic.

איור 3 מציג תמונות SEM של SEC השנייה לאחר acidolysis באמצעות חומצה זרחתית בנקודות זמן שונות מ -5 שעות עד 30 שעות. תמיכת תוצאות אלו כי acidolysis עד 30 שעות מספקת SEC שניות ללא פגע והנקי נטולות חומרי sporoplasmic. על מנת לאשר חומר חלבוניים שיורית, ניתוח יסודות CHN 29 בוצעו ונתונים מוצגים באיור 4. תוצאות אלו נותנות הנחיה לבחירת מצב העיבוד הטוב ביותר להשיג SEC שניות נקיות ושלמות. במקרה של SEC שניות מטופלים נטולות שומן אלקלי, לא חלבוניים משמעותייםהסרת חומר הוא ציין. עם זאת, עם acidolysis באמצעות חומצה זרחתית, רוב חומרי חלבוניים מוסר 30 שעות ולא הפחתה נוספת הוא ציין עם הגדלת זמן התהליך עד 120 שעות. נתוני היסודות עולים בקנה אחד עם דיווחים קודמים על עיבוד מורחב של SEC שניות 7,11 ועם SEC שניות מסחריות.

נכסי Micromeritic נותחו על ידי ניתוח חלקיקי תמונה דינמי (DIPA) ותוצאות מוצגות באיור 5. תוצאות אלו תומכות התפלגות הגודל האחידה של SEC השנייה לאחר acidolysis עד 30 שעות, עם גודל של 31.0 ± 2.2 מיקרומטר. בניגוד לכך, השלמות המבנית SEC פוחתת עם acidolysis ממושך ומתחיל לגרום לפיצול משמעותי של SEC שניות מעבר 30 משכי הטיפול hr.

איור 6 מציג את נתוני SEM ו DIPA עבור SEC שניות מיוצרות עם רק acidolysis פרוcessing באמצעות חומצה זרחתית במשך 30 שעות. תוצאות אלו מאשרים כי לאחר השלב defatting, acidolysis מיוצר SEC שניות נקייה ושלמה עם התפלגות גודל אחיד של 32.5 ± 2.7 מיקרומטר. יש SEC שניות Acidolysis בלבד תכולת חלבון שיורית של רק 0.15 ± 0.0%, כיחסי נחושה תוכן חנקן%, 11 אשר ניתן להשוות SEC שניות המיוצרות על ידי אלקלי acidolysis טיפול כפי שפורט לעיל עם דיווחים קודמים. 7

מיקרואנקפסולציה באמצעות Sporopollenin Exine קפסולות

על מנת להדגים את השימוש ל SEC שניות clavatum הופק באמצעות תהליך רק-acidolysis, ניסויים מיקרואנקפסולציה בוצעו באמצעות BSA כחלבון מודל. טעינת לתוך SEC שניות הושג באמצעות טכניקה טעינת ואקום באמצעות 150 SEC שניות מ"ג ו -1.2 מ"ל של 125 מ"ג / מ"ל BSA. איור 7 מציג את im CLSMהגילאים של SEC שניות לפני ואחרי עיבוד acidolysis בלבד ועם אנקפסולציה FITC-BSA. הנתונים מצביעים על כך autofluorescence תערוכת SEC שנ המטופל בשל נוכחותם של מרכיבי sporoplasm בתוך חלל הנבג. עם זאת, לאחר עיבוד acidolysis בלבד, כל התכנים sporoplasmic יוסרו והתוצאה היא חלל פנימי ריק. באופן מפתיע, לאחר אנקפסולציה של FITC-BSA, פלואורסצנטי ירוק הוא ציין בתוך שניות, המאשר את אנקפסולציה של החלבון מודל לתוך שניות. 19,20,41

יתר על כן, כדי לחקור את השינויים המורפולוגיים ומאפייני micromeritic של BSA טעון שניות, SEM וניתוח DIPA נערכו ואת הנתונים מוצגים באיור 8. תמונות SEM לאשר את קיומו של microridges השלם והנקי לאחר טעינת BSA. בנוסף, אין שינויים מהותיים נצפו קוטר, מעגלי, ואת יחס ממדים לאחר טעינת BSA לתוך שניות. נתונים אלה הם consisteNT עם דיווחים קודמים על אנקפסולציה של תרופות באמצעות שניות. 7,10

כדי לכמת את כמות BSA כמוס, BSA הופק מ -5 מ"ג של SEC שניות טעון BSA, ואת הנתונים מוצגים בטבלה 1. הנתונים מצביעים על 0.170 ± 0.01 גרם של טעינת BSA לגרם של שניות. בסך הכל, SEM, DIPA, CLSM, וכימות של BSA ידי ניתוח ספקטרוגראפי, לאשר את אנקפסולציה מוצלח של BSA ב L. SEC שניות clavatum ויציבות מורפולוגית SEC.

איור 1
תהליך באיור 1. הפקה יעילה עבור L. clavatum Sporopollenin Exine קפסולות (שניות). (א) נבגים מטופל. (ב) Spore defatting באמצעות הגדרת refluxing על 50 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. (C) סינון מרכך ולאסוף יון של נבגים נטול שומן. (ד) ייבוש נבגים נטול שומן בטמפרטורת החדר. (E) Spore acidolysis בבקבוקון PTFE באמצעות 85% (v / v) חומצה זרחתית ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות. (F) סינון חומצה באמצעות סינון ואקום הגדרה. (G) כביסת SEC באמצעות סדרה של מים, חומצה, בסיס, וממסי שלבי כביסה. (H) ייבוש SEC באמצעות תנור ואקום ב 60 ° C ו 1 mbar ואקום במשך 10 שעות. (I) שלמים, נקי , מיובשים SEC שניות כמוצר סופי. (J) ערבוב של פתרון SEC שניות ו BSA. (K) המגון של פתרון SEC שניות ו BSA. (L) טעינת אבק של BSA לתוך שניות. (M) SEC שניות BSA-טעון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

54,768 / 54768fig2.jpg "/>
איור 2. אלקטרוני סורק מיקרוסקופי ניתוח של L. נבגי clavatum במהלך שלבים שונים של טיפול טרום חומצה. (א) נבגי מטופלת מראים אברונים הסלולר sporoplasmic ביומולקולות. (ב) נבגי מטופלי אצטון מוצגים, שבשו תוכן sporoplasmic. (C) & (D) אלקליות מטופלי נבגים מראים הסרת תוכן sporoplasmic ו שכבה פנימית מתאית intine מקומטת. מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. אלקטרוני סורק מיקרוסקופי ניתוח של L. נבגי clavatum במהלך שלבים שונים של חומצהטיפול בין 5 ל -30 שעות (A - D). בהתאמה, 5, 10, 20, ו -30 שעות נבגים שטופלו בחומצה מראה מיקרו חיצוני שלם חלל פנימי נקי. מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
תכולת חלבון איור 4. הנבגים Sporopollenin Exine קפסולות (שניות). תוכן חלבון לאחר בשלבים שונים של טיפול. הנתונים המיוצגים הם ממוצע של מדידות בשלושה עותקים עם סטיית תקן (n = 3). מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר of דמות זו.

איור 5
איור 5. דינמי הדמית חלקיקי ניתוח (DIPA) של נבגי Sporopollenin Exine קפסולות (שניות) בשלבים שונים של טיפול עמודות (A - C). הם בהתאמה, טיפול קדם-חומצה, טיפול בחומצה, ו SEC שניות ללא פגע. מגרשי גרפי נציג בקוטר SEC, מעגלי, יחס גובה, ואת שיפוע קצה. מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. מיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM) ו- Dynamic הדמיה החלקיקים ניתוח (DIPA) של 30 שעות Acidolyאחותי בלבד Sporopollenin Exine קפסולות (שניות). (א) SEC שניות מראה מיקרו חיצוני שלם חלל פנימי נקי. (ב) גרפים נציג של קוטר SEC, מעגליות, ואת יחס הממדים. מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. מיקרוסקופית סריקת לייזר Confocal (CLSM) ניתוח של Sporopollenin Exine קפסולות (שניות) לפני ואחרי טיפול BSA Encapsulation. השורה הראשונה מתארת נבגים מטופל מראה אברון הסלולר sporoplasmic ו autofluorescence biomolecule. השורה השנייה נראית 30 שניות hr acidolysis בלבד עם חלל פנימי ריק. השורה השלישית מתארת ​​FITC-BSA טעוןלתוך 30 שניות hr acidolysis בלבד. (ברי סולם הם 10 מיקרומטר). מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ו- Dynamic הדמיה החלקיקים ניתוח (DIPA) אפיון BSA טעון Sporopollenin Exine קפסולות (שניות). (א) SEM תמונות של SEC שניות BSA-הטעונות. (ב) גרפי נציג של קוטר SEC BSA טעון, מעגלי, יחס גובה, ואת שיפוע קצה. מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חוֹמֶר טעינת BSA לכל אצווה (125 מ"ג / מ"ל) BSA ב 5 שניות מ"ג (מ"ג) סכום BSA טעון (גרם לכל גרם של שניות) נבגי מטופל 0.6 מ"ל 0.654 ± 0.05 0.131 ± 0.01 SEC שניות 1.2 מ"ל 0.831 ± 0.05 0.170 ± 0.01

Encapsulation טבלה 1. שור סרום אלבומין (BSA) אל מטופל נבגים שניות. נפח של פתרון BSA המשמש לטעינה לכל 150 יצוו מ"ג 'נבגי מטופל' או 'SEC שנ'. הנתונים המיוצגים הם ממוצע של יצוות בשלושה עותקים עם סטיית תקן (n = 3). מעובד מתוך 41 ונמצאים בשימוש באישורו מ דוחות מדעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו, ניתוח שיטתי של מיצוי SEC מ ל נבגי clavatum מוצגים ו מהדוח עולה כי אפשר לייצר קפסולות באיכות גבוהות תוך השגה גם התייעלות משמעותית של הפרוטוקול נפוץ קיים. 11 בניגוד לפרוטוקול הקיים המחייבת טמפרטורת תהליך גבוה (180 מעלות צלזיוס) משך תהליך ארוך (7 ימים), 11 אופטימיזציה עיבוד החילוץ הנוכחי SEC התמקד בעיקר על הפחתת הטמפרטורה ומשך צעד acidolysis.

טיפולי defatting אלקלי לספק הסרה מינימאלית של חומר sporoplasmic מ נבגים. עם זאת, acidolysis מ -5 שעות עד 120 שעות הסירו את הסכום המקסימאלי של חומר sporoplasmic. התוצאות הצביעו על כך משך העיבוד הכולל והטמפרטורות יכולים להיות מופחתות באופן דרסטי מ טכניקות קונבנציונליות, 11 וכי רק 30 שעות בטמפרטורה בינונית (70° C) חומצה זרחתית סיפק את כמוסות לאיכות מיטבית. כמו כן, מעבר 30 שעות acidolysis, נמצא כי SEC השניות החלו בפני שברי עלייה משמעותית שברי חלקיקים נצפתה, דבר המצביע על כך את המנה כולה של SEC שניות ניתן הציג ירידת שלמות מבנית הכוללת. בנוסף, יש לציין כי ל clavatum נחשב מהווה sporopollenin חזק יחסית, 2 וכי תנאי העיבוד הספציפיים המעורבים בפרוטוקול זה, כגון, ריכוז חומצה, טמפרטורה, ו / או משך הידרוליזה, אולי צריכים להיות מותאמים עבור מיני אבקה אחרים.

היא הוצגה כי הייצור של SEC שנ ידי acidolysis בלבד חומצה זרחתית אלקטרוני (85% v / v) עבור 30 תשואות hr נקייה ושלמה שניות. 41 הנתונים מאשרת כי acidolysis הוא צעד חיוני בייצור SEC. לבסוף, SEC שניות חומצה בלבד שמשו אנקפסולציה של BSA ורמה גבוהה של טעינה נצפתה. טעינת wכפי שהושג עם היישום של ואקום, לפיה לחץ חלל SEC הפנימי משתנה לצייר את פתרון BSA בכוח לתוך קפסולות הריקות. Nanochannels (קוטר 15 -. 20 ננומטר), אשר זוהו בעבר בקירות exine של L. clavatum, 7 לאפשר הפתרון להיכנס לתוך החלל הפנימי הגדול. לאחר טעינה, קפסולות נשטפו ויובשו ומייבש להקפיא להניב אבקה בחופשיות.

גודל אחיד מאפייני מורפולוגיים הם גורמים חשובים על מנת לאמוד את איכותו של חומר אנקפסולציה מוצלח. האחידויות בגודל שנצפו והמורפולוגיה שלמה של SEC שניות טיעון BSA אשרו את השימוש הפוטנציאלי של acidolysis בלבד SEC שניות מעובד עבור יישומי מיקרואנקפסולציה.

תוצאות אלה חשובות לייצור התעשייתי בקנה המידה הגדולה של SEC השנייה ועבור מגרת עניין רב יותר את היישומים האפשריים של SEC שניות ב מיקרואנקפסולציה של תרופות,חלבונים, פפטידים, תוספי מזון, תוספי תזונה, קוסמטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17 (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. , University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45 (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43 (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21 (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21 (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22 (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1 (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. , Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6 (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31 (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2 (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. , Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12 (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26 (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461 (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148 (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5 (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. , 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12 (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109 (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. , 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47 (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21 (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698 (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57 (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3 (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6 (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, , (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190 (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , CRC press. 182 (2011).

Tags

Bioengineering גיליון 117, נבגים טבעיים כמוסות exine sporopollenin אנקפסולציה מיקרו microridges
הפקת קפסולות צמחית עבור יישומי מיקרואנקפסולציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potroz, M. G., Mundargi, R. C.,… More

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter