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方法文章

制备rAAV9以在小鼠心脏中过表达或敲低基因

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DOI：

10.3791/54787

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2016年12月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Howard Hughes Medical Institute

本文内容

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摘要

本文描述了一种制备重组腺相关病毒9型（rAAV9）载体的方法，用于在小鼠心脏中调控基因表达。

摘要

通过在小鼠模型中向心肌递送遗传物质以调控特定基因的表达或活性，可研究基因功能，并评估其在心脏中的治疗潜力。目前可用于 体内 小鼠心脏的分子干预。基于重组腺相关病毒（rAAV）的基因组编辑已被用作一种关键工具 体内 心脏基因操作。该技术的具体优势包括高效性、高特异性、低基因组整合率、最小化 免疫原性低且致病性最小。本文详细描述了重组腺相关病毒9型（rAAV9）载体的构建、包装和纯化步骤。将rAAV9通过皮下注射导入新生小鼠后，可在小鼠心脏中实现目的基因的高效表达或有效沉默，而在肝脏及其他组织中则无此效应。使用心脏特异性TnnT2启动子可实现GFP基因在心脏中的高水平表达。此外，当采用rAAV9-U6-shRNA时，可实现心脏中靶基因mRNA的有效抑制。掌握rAAV9技术的相关知识可能对心血管研究具有重要价值。

引言

在各种生物系统中调控特定基因的表达或活性已成为研究基因功能的重要策略1实现这一目标的直接方法是操纵核苷酸序列并产生突变等位基因。尽管对活细胞基因组进行精确、靶向的修饰仍然 一种耗时且劳动密集型的技术，强大的 TALEN 和 Crispr/Cas9 工具的开发开启了基因组编辑的新时代2-5一种更为常规的实验室基因操作方法是将遗传物质（包含编码序列的DNA和RNA，或siRNA/shRNA）导入细胞，以实现目的基因的表达或敲低1,6.

在许多情况下，基因操作的主要瓶颈是将 DNA、RNA 或蛋白质递送至细胞内。关于 体外 研究中，已在许多培养的细胞系中建立了高效的转染系统。然而，在小鼠模型中，尤其是 体内 基因递送更具挑战性。为了实现外源试剂的有效细胞摄取，需要克服一系列胞外和胞内的屏障。其他障碍还包括递送材料的快速清除以及作用时间短暂。7,8一种克服这些问题的策略是使用病毒载体作为 "载体" 或 "载体" 用于 体内 基因递送。病毒在自然进化过程中形成的转导特性，可实现将目的基因高效递送至细胞内7,9,10. 已开发出多种类型的病毒载体，并实现了灵活的 体内 在小鼠不同细胞类型和器官中的基因操作

最常用的病毒系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）11。逆转录病毒是单链RNA病毒，可在有丝分裂过程中将其遗传物质稳定地整合到宿主细胞基因组中，从而在靶细胞和器官中实现转导基因的长期表达12-14。然而，许多类型的逆转录病毒仅感染分裂期细胞，在非分裂细胞中的感染效率极低15，这限制了其在基因递送中的应用。慢病毒属于逆转录病毒科（Retroviridae）的一个属。与其他逆转录病毒不同，慢病毒可感染分裂期和非分裂期细胞，已被广泛用于有丝分裂后及高度分化的细胞中的基因转移16。慢病毒的生命周期同样涉及将载体DNA整合至宿主基因组中，因此慢病毒介导的基因递送可实现转导基因元件的稳定且持久的表达16-18。然而，这一特性在利用此类病毒调控基因表达时可能是一把双刃剑，因为载体DNA的整合可能导致宿主细胞发生插入突变 ，并引发人为假象效应。腺病毒是另一种广泛应用的基因递送系统。与逆转录病毒和慢病毒不同，腺病毒不会整合至宿主基因组，也不会干扰宿主细胞的基因组完整性8,10,11,19。此外，腺病毒可将DNA转染至多种细胞类型，且感染过程不依赖于活跃的细胞分裂19。腺病毒另一个重要特性是载体易于纯化，因为病毒载体具有自我复制能力19,20。然而，该系统的主要局限在于腺病毒感染可能在靶细胞和器官中引发强烈的免疫反应19，从而限制了其在许多研究中的应用，尤其是在基因治疗研究中。

与这些不同类型的病毒载体相比，重组腺相关病毒（rAAV）似乎是理想的基因递送系统21,22。其免疫原性和致病性极低23,24。此外，rAAV能够感染多种细胞类型，包括分裂和非分裂细胞。在大多数情况下，rAAV不会整合到宿主基因组中，因此在靶细胞中发生非预期遗传或基因组改变的风险较低22。

近年来，重组腺相关病毒（rAAV）系统已成功用于将编码蛋白质、miRNA、shRNA 和 Crispr-gRNA 的 DNA 体内递送至小鼠心肌23,25-29。该方法学推动了心血管研究领域内的基础研究和基因治疗研究。本文详细描述了生成 rAAV9 载体的步骤，该载体可高效地在小鼠心脏中过表达或敲低目的基因。本方案为在小鼠实验模型中调控心脏基因表达提供了一种简单且有效的方法。

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方案

所有描述的步骤均在波士顿儿童医院生物安全委员会和机构动物护理与使用委员会批准的协议下进行。波士顿儿童医院拥有无病原小鼠设施，配备受控的明暗循环和气候调节系统。兽医及动物护理人员定期更换笼具，并确保小鼠的健康状况。该设施已获得AAALAC认证，并持有有效的动物福利保证证书（AAALAC认证授予日期：1992年2月24日；动物福利保证编号：A3303-01）。小鼠通过来自压缩气源的CO2实施安乐死。在确认动物心率、活动和呼吸均已停止后，采集组织样本。新生啮齿类动物对CO2安乐死具有抗性，因此采用锋利剪刀进行断头法处死。这些方法符合美国兽医医学协会安乐死专家组的建议。

1. 通过将 cDNA 或 shRNA 表达盒克隆至质粒骨架中构建 rAAV9 载体

注意：用于基因过表达的rAAV9质粒含有AAV2的反向末端重复序列（ITRs），已改造为携带鸡源TNNT2 启动子 (rAAV9.cTNT），可实现转导基因在心肌细胞中的特异性表达25,26,29在启动子下游的质粒中引入了独特的 NheI 和 KpnI 位点。目的基因的 cDNA 片段可通过这两个限制性酶切位点克隆到 rAAV9 载体骨架中。25,26,29在此，以在小鼠心脏中过表达GFP基因的rAAV9载体的构建为例。所得质粒包含由两个ITR位点侧翼的cTNT::GFP表达盒（图1rAAV9.U6::shRNA 构建体用于基因敲低25设计shRNA时，可使用在线shRNA设计服务器。rAAV9.U6::shRNA的构建可通过以下两种方法实现：一是将含有shRNA序列的DNA寡核苷酸退火后连接至经限制性内切酶消化并携带U6启动子的rAAV9载体中；二是通过长片段PCR结合分子内Gibson组装方法完成。 "无缝" 构建30. 所得质粒应包含两侧各有一个ITR位点的U6-shRNA表达盒（图2）。此处以 rAAV9.U6::shRNA 载体为例，用于敲低 Trbp mRNA（Trbp shRNA 序列：GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG）。 scramble shRNA 作为阴性对照（CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG）。

  1. 将cDNA或shRNA表达盒克隆至rAAV9质粒骨架中，随后将DNA转化入感受态E. coli细胞25。
    注意：建议使用stbl2或stbl3 E. coli细胞进行rAAV9 DNA的转化，以最大限度减少不必要的ITR重组。
  2. 从转化后的E. coli细胞中挑取阳性克隆，在500 ml Lilly-Barnett培养基中扩增培养，并从细菌细胞中提取rAAV9质粒25–30。
    注意：应采用中量/大量质粒提取方法以获得较高产量的DNA（> 100 µg）。在制备病毒前，务必通过限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳分析AAV质粒的序列完整性，具体方法如前所述（http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html）。 

2. 使用 rAAV9 质粒转染 HEK293 细胞

  1. 制备1 µg/µl的线性聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将PEI粉末溶于无内毒素的dH₂O中。2将O加热至70–80 °C。冷却至室温后，用1 M HCl将溶液中和至pH 7.0。使用0.22 µm滤器对溶液进行过滤除菌。将1 µg/µl的PEI储存液分装（每管1,400 µl），于-20 °C保存。
  2. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞。将细胞置于37 °C、含5 ± 0.5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中培养。2).
  3. 第0天，在转染前18-20小时，将HEK293细胞接种于10个150毫米培养皿中，进行传代培养 > 1:2 稀释的 90% 汇合度细胞。
    注意：第1天时，细胞应达到90%融合度。
  4. 第1天，用rAAV9质粒转染HEK293细胞（例如， rAAV9.cTNT::GFP 或 rAAV6.U6::shRNA 载体、Ad-Helper 质粒和 AAV-Rep/Cap 质粒，使用 PEI25,26,29.
    1. 对于10个细胞汇合度为90%的培养皿，将70 µg AAV-Rep/Cap质粒、70 µg pf rAAV9质粒和200 µg Ad-Helper质粒加入50 ml离心管中混合。
    2. 如果细胞融合度较低，则需按比例调整DNA用量。例如，当细胞融合度为75%时，应按比例减少DNA用量（即步骤2.4.1中所示用量的75/90）：取58.3 µg AAV-Rep/Cap质粒、58.3 µg rAAV9质粒和166.7 µg Ad-Helper质粒，加入50 ml离心管中混合。
    3. 向50 ml离心管中加入49 ml室温DMEM（不含FBS），充分混匀。
    4. 加入1,360 µl PEI溶液，使PEI:DNA比例（v/w）为4:1。充分混匀，室温孵育15–30分钟。
    5. 将步骤2.4.4中制备的混合物5 ml加入每个150 mm培养皿中（共十个150 mm培养皿，需50 ml混合物）。
  5. 在37 °C、5 ±0.5% CO₂的培养箱中培养细胞2 60–72 小时。

3. 转染HEK293细胞的收获及rAAV9载体的纯化

  1. 转染后60-72小时收集细胞。用培养基反复吹打，使细胞脱离并悬浮于培养皿中。将所有细胞悬液转移至无菌的50 ml离心管中。
  2. 在500 × g条件下离心5分钟。每管用5 ml PBS重悬细胞沉淀，并将所有细胞悬液合并至一个50 ml离心管中。
  3. 在500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液。此步骤中，可将细胞沉淀储存于-80 °C，或立即按照步骤3.4-3.15所述方法从沉淀中纯化AAV。
  4. 配制裂解缓冲液：150 mM NaCl 和 20 mM Tris-HCl，pH 8.0。经0.22 µm滤膜过滤除菌，4 °C保存。
  5. 用10 ml裂解缓冲液重悬沉淀。
  6. 将裂解液在-80 °C或干冰/乙醇浴中冷冻，然后在37 °C解冻。涡旋振荡1分钟。重复冻融过程共3次。
  7. 向解冻后的裂解液中加入MgCl2溶液（使裂解液中MgCl2终浓度为1 mM）。加入核酸酶至终浓度为250 U/ml。37 °C孵育15分钟，以溶解DNA/蛋白质聚集物。
    注意：若经核酸酶或内切酶处理后DNA/蛋白质聚集物仍未溶解，可用Dounce匀浆器匀浆20次。
  8. 在4 °C、4,800 × g条件下离心20分钟。收集上清液。
  9. 同时，配制碘克沙醇梯度溶液：
    1. 通过混合5 ml 10x PBS、0.05 ml 1 M MgCl2、0.125 ml 1 M KCl、10 ml 5 M NaCl和12.5 ml密度梯度介质配制17%梯度溶液。用H2O定容至50 ml。
    2. 通过混合5 ml 10x PBS、0.05 ml 1 M MgCl2、0.125 ml 1 M KCl、20 ml密度梯度介质和0.2 ml 0.5% (w/v) 酚红配制25%溶液。用H2O定容至50 ml。
    3. 通过混合5 ml 10x PBS、0.05 ml 1 M MgCl2、0.125 ml 1 M KCl和33.3 ml密度梯度介质配制40%溶液。用H2O定容至50 ml。
    4. 通过混合0.05 ml 1 M MgCl2、0.125 ml 1 M KCl、50 ml密度梯度介质和0.1 ml 0.5% (w/v) 酚红配制60%溶液。
  10. 使用针头和注射器，从离心管底部开始，依次加入5 ml 17%、5 ml 25%、5 ml 40%和5 ml 60%的碘克沙醇梯度溶液。将步骤3.8获得的全部裂解液（14-16 ml）加至梯度顶部。梯度自下而上依次为60%、40%、25%、17%及裂解液层。用裂解缓冲液补满离心管，并加盖密封。
  11. 在16 °C、185,000 × g条件下离心90分钟。
  12. 用注射器收集病毒组分（40%层）。将针头（21号）插入40%与60%层交界处，仅吸取40%层。
    注意：避免吸取任何25%层。
  13. 将病毒组分与无菌的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物PBS溶液（10%聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物原液以1:10,000比例稀释于PBS中）混合，总体积至15 ml。将混合液加入超滤管（截留分子量=100 kD）。在4 °C、2,000 × g条件下离心30分钟。
  14. 弃去滤出液。用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物PBS溶液重新加满超滤管至15 ml。在4 °C、2,000 × g条件下离心20分钟。重复此步骤两次。收集纯化的rAAV9病毒（滤膜上方组分）。
  15. 将超滤管中纯化的rAAV9转移至1.7 ml离心管中。根据AAV的体积和滴度，分装为每管100-400 µl，并于-80 °C保存。
    注意：避免反复冻融。

4. rAAV9 滴度的测定

  1. 准备标准DNA样品。
    1. 针对rAAV9载体设计特异且高效的PCR引物，并优化PCR反应条件。
      注意：本研究中使用的引物为"正向引物：TCGGGATAAAAGCAGTCTGG；反向引物：TCGGACGGAGATACGTGAGT"。PCR反应条件如下：95 °C预变性3分钟；进行35个循环，每个循环包括95 °C变性20秒、60 °C退火15秒、72 °C延伸10秒；最后在72 °C延伸10分钟。然而，优化后的引物和PCR条件具有质粒特异性，因为rAAV9载体中的插入序列可能影响PCR的特异性和效率31。
    2. 按照步骤4.1.1所示条件进行PCR反应，使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。
    3. 使用分光光度计测定纯化后DNA的浓度，并根据PCR产物的分子量/长度计算以DNA分子数表示的浓度。
      1. 使用以下公式计算分子浓度：分子浓度（DNA分子或片段/ml）= 6.23 × 1023 mol-1 × Con. × 10-6/MW。注：（6.23 × 1023 mol-1为阿伏伽德罗常数；Con.：DNA浓度，单位为µg/ml；MW.：分子量，单位为g/mol）。例如，若PCR产物浓度为100 µg/ml，长度为200 bp，则双链DNA的分子量为2 × 200 × 310 = 124,000（单链DNA中每个核苷酸的平均分子量约为310 g/mol）。因此，分子浓度（DNA分子/ml）= 6.23 × 1023 mol-1 × 100 µg/ml × 10-6 / 124,000 g/mol = 5.18 × 1014 DNA分子/ml。
      2. 对DNA片段进行系列稀释，制备浓度分别为1013 分子/ml、1012 分子/ml、1011 分子/ml、1010 分子/ml、109 分子/ml、108 分子/ml和107 分子/ml的标准样品。每个标准样品取1 µl用于定量PCR（qPCR，见步骤4.6）。
  2. 将5 µl纯化的rAAV9溶液与5 µl 10× DNA酶缓冲液、1 µl DNA酶（10,000 U/ml）和39 µl ddH2O混合，总体积为50 µl。
  3. 在37 °C孵育30分钟，以去除残留的未包装质粒DNA。
  4. 在95 °C加热10分钟使DNA酶失活。冷却后，加入44 µl H2O、5 µl 10× DNA酶缓冲液和1 µl蛋白酶K原液（10 mg/ml）。
  5. 在50 °C孵育2小时。反应结束后，在95 °C加热10分钟使蛋白酶K失活。
  6. 取1 µl样品进行定量PCR（qPCR）检测，并计算滴度。
    1. 使用步骤4.1.1中设计的引物，对步骤4.1.4制备的标准样品和步骤4.5处理的待测样品进行定量PCR（qPCR）。
      1. 每项反应中混合以下组分：10 µl 2× Green预混液（含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液、MgCl2和Green染料）、0.5 µl正向引物（5 µM）、0.5 µl反向引物（5 µM）、8 µl H2O和1 µl待测样品。PCR程序如下：50 °C保持2分钟，95 °C预变性10分钟；进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒和60 °C退火延伸1分钟；熔解曲线阶段为95 °C 30秒和60 °C 15秒。根据标准样品的CT值绘制标准曲线（图3）。
    2. 根据标准曲线计算AAV样品的分子浓度/滴度。rAAV9基因组为单链DNA，因此其实际分子浓度应为计算值的2倍（2× power(10, y)，图3B）。此外，由于病毒在DNA酶和蛋白酶K反应中被稀释了1:20（5 µl病毒加入至总体积100 µl），因此纯化后的rAAV9滴度应为计算结果的20倍。

5. 新生小鼠中 rAAV9 的注射及心脏基因表达检测

  1. 在聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物 PBS 溶液中配制 rAAV9 工作液。将病毒原液稀释至滴度为 1–7 × 1012 颗粒/毫升
    注意：通过皮下注射，向每只出生后0.5至1.5天的小鼠递送50–70 µl的rAAV9溶液。为实现高效的基因过表达或敲低，建议在每项研究中先进行预实验，以优化注射的AAV用量。每项研究中应使用等量的rAAV9.cTNT::Luc或rAAV9.U6::scramble作为对照，以尽量减少偏差。
    注意：我们使用了 1-1.5 x 1011 过表达的颗粒/每只幼崽 2.5 - 5 x 1011 出生后0.5-1.5天小鼠中用于基因敲低的颗粒/幼崽ce)
  2. 在出生后0.5至2.5天通过皮下注射对新生小鼠进行rAAV9处理。
    1. 用 rAAV9 溶液预填充一支 29G1/2、0.33 x 12.7 mm 的胰岛素注射器。注意去除气泡。
    2. 握住 用拇指和食指握住一只经冷冻麻醉的幼鼠。注射前，用浸有70%异丙醇的棉签擦拭幼鼠背部皮肤，以维持无菌条件。将注射器针头以5°至10°的角度插入动物前背部的皮下组织。使用胰岛素注射器注入50–70 µl的rAAV9溶液。
      注意：rAAV9 也可通过腹腔注射或静脉注射的方式递送至小鼠体内26,27心脏中递送基因的表达效率较高。然而，腹腔注射有时可能导致肝脏出现渗漏性表达。注射后，每天监测幼崽的健康状况。
  3. 可通过qPCR、免疫荧光或蛋白质印迹法检测心脏中基因表达水平（代表性结果如图所示） 图4 和 5)25,26.
    注意：小鼠通过 CO2 由压缩气体源输送。在确认动物心率、活动和呼吸停止后，采集组织样本。新生啮齿类动物对 CO 具有抗性2 安乐死，并使用锋利的剪刀通过断头法处死。该方法符合美国兽医医学协会安乐死专家组提出的建议。

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结果

rAAV9.cTNT::GFP 或 rAAV9.U6::shRNA 质粒构建 rAAV9 的策略分别如图1和图2所示。以这些质粒为例，构建了用于在小鼠心脏中过表达 GFP 基因的 rAAV9 载体。所获得的质粒包含由两个 ITR 位点侧翼包围的 cTNT::GFP 表达盒（图1）。rAAV9.U6::shRNA 载体则用于敲低 Trbp mRNA（图2）

通过qPCR数据经线性回归生成rAAV9滴定的标准曲线。自变量y表示各标准样品DNA分子浓度的Log10值，对应的变量x表示CT值。Log10 （浓度）值（y）与CT值（x）之间呈现良好的线性相关性（R2 = 0.9971），并符合方程 y = -0.2832...

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讨论

在质粒构建过程中，应尽量减少不必要的ITR重组。在产生病毒之前，必须始终通过限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳来检测AAV质粒的ITR完整性。获得100%完整的质粒是不可能的，但应尽可能降低重组比例。对于成功的rAAV9包装，重组率低于20%是可以接受的。值得注意的是，在较低温度（30 °C）下培养细菌，并采用较低的摇床转速（180–200 rpm），可降低ITR发生重组的概率。

必须确保HEK293细胞处于健康状态，以实现高效的转染和rAAV9包装。 "健康" 细胞通常具有很强的增殖能力，生长迅速。然而，HEK293细胞的快速增殖和生长并不一定保证重组腺相关病毒9型（rAAV9）包装的高效率。因此，实验应使用新鲜的细胞开始。建议使用低代次的HEK293细胞（<10 代，细胞每 2–3 天传代一次）用于 rAAV9 包装。需要注意的是，其他血清型的 rAAV 可能需要采用不同的纯化步骤进行纯化32.

在构建rAAV9质粒时，研究者具有一定的灵活性。可采用限制性酶切位点介导的连接或Gibso...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Zaffar Haque 博士对稿件的仔细审阅。感谢 Masaharu Kataoka 博士和 Gengze Wu 博士的讨论与帮助。王实验室的工作得到了美国心脏协会、肌肉萎缩症协会以及美国国立卫生研究院（HL085635、HL116919、HL125925）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚乙烯亚胺，线性（分子量 25,000）Polysciences, Inc. #23966-2
聚丙烯管，36.2 ml，25 x 87 mm（数量：56）Beckman Coulter, Inc# 362183
核酸酶，超纯级SIGMA#E8263-25KU
密度梯度介质（碘克沙醇）SIGMA#D1556-250ML
带 Ultracel-100 膜的离心过滤装置EMD Millipore Corporation#UFC910008
实验室移液针，90° 钝端，14 号规格，长 6 英寸，镍镀接头SIGMA#CAD7942-12EA
泊洛沙姆 188 溶液（Pluronic® F-68 溶液）SIGMAP5556-100ML
蛋白酶 KSIGMA3115828001
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）Roche10104159001
离心机Thermo Scientific75004260
离心系统Beckman Coulter363118
超速离心机Beckman Coulter
DMEM 培养基Fisher ScientificSH30243FS
胎牛血清 Atlanta Biologicals              S11150
rAAV9 载体Penn Vector CoreP1967

参考文献

  1. Primrose, S. B., Twyman, R. Principles of gene manipulation and genomics. , John Wiley & Sons. (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  4. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  6. Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
  7. Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342(2015).
  8. Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
  9. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  10. Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
  11. Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
  12. De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
  13. Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
  14. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
  15. Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
  16. Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
  17. Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
  18. Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
  19. Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
  20. Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
  21. Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
  22. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  23. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
  24. Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
  25. Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
  26. Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
  27. Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
  28. Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
  29. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
  30. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
  31. Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
  32. Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
  33. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
  34. Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
  35. Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894(2013).
  36. Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).

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Formal Correction: Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.

One of the authors names and affiliation was corrected from:

Jian-Ming Jiang3,4
3 Department of Genetics, Harvard Medical School
4 Howard Hughes Medical Institute

to:

Jianming Jiang5
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

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