Abstract
Immunanalyser används för att detektera proteiner som bygger på förekomsten av associerade antikroppar. På grund av deras omfattande användning inom forskning och kliniska miljöer, kan hittas en stor infrastruktur immun instrument och material. Till exempel, 96- och 384-brunnars polystyrenplattor är tillgängliga kommersiellt och har en standardkonstruktion för att rymma ultraviolett-synligt (UV-Vis) spektroskopi utrustning från olika tillverkare. Dessutom har ett brett utbud av immunoglobuliner, upptäckt taggar och blockerande medel för skräddarsydda immun konstruktioner såsom enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) finns tillgängliga.
Trots den befintliga infrastrukturen, gör standard ELISA kit inte uppfyller alla forskningsbehov, vilket kräver individualiserad immun utveckling, vilket kan vara dyrt och tidskrävande. Till exempel, ELISA kit har låg multiplexering (detektering av mer än en analyt i taget) kapacitet eftersom de vanligtvis är beroende av fluorescens eller colorimetric metoder för detektion. Colorimetric och fluorescensbaserade analyser har begränsad multiplexering kapacitet på grund av breda spektrala toppar. I kontrast, Raman-spektroskopi-baserade metoder har en mycket större kapacitet för multiplexering på grund av smala emissionstoppar. En annan fördel med Raman-spektroskopi är att Raman reportrar upplever betydligt mindre fotoblekning än fluorescerande taggar 1. Trots de fördelar som Raman reportrar har över fluorescerande och kolorimetriska taggar till protokoll tillverka Raman-baserade immun är begränsade. Syftet med detta dokument är att tillhandahålla ett protokoll för att förbereda funktionaliserade prober för användning i samband med polystyrenplattor för direkt detektion av analyter genom UV-Vis analys och Raman-spektroskopi. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att ta en gör-det-själv-strategi för framtida multianalytdetektering medan kapitalisera på förhand etablerad infrastruktur.
Introduction
Typiska sandwichimmun upptäcka indirekt närvaron av ett antigen med två antikroppar. Den infångande antikroppen är bunden till en fast yta och bildar ett antikropp-antigenkomplex när de är i närhet till en lämplig antigen. En detektionsantikropp införes därefter och binder till antigenet. Efter tvättning, är antikroppen / antigenet / antikroppskomplexet lämningar och detekteras av den märkta detektionsantikropp såsom visas i Figur 1A. Typiska detektering sker genom en fluorescerande eller kolorimetrisk detektor, vilket begränsar multiplexering till 10 analyter på grund av breda spektrala toppar 2,3. I motsats, Raman-baserade system har mycket smalare emissionstoppar som resulterar i förbättrade multiplexering kapacitet med källor som hävdar samtidig detektion av upp till 100 analyter 2,3.
Många litteraturkällor finns tillgängliga som täcker viktiga aspekter i samband med immunanalyser 4-6 såsom steg-för-stegdetaljer för att skapa personliga ELISA-kit. Tyvärr är dessa protokoll är för fluorescerande eller kolorimetrisk detektering, vilket begränsar multiplexering förmåga anpassade immun. För att lösa detta behov, presenterar vi ett detaljerat förfarande för att tillverka UV-Vis / Raman immun tidigare 7 publicerats för en direkt immun som visas i figur 1B.
Detta protokoll omfattar tillverkning av funktionaliserad guldnanopartiklar baserade prober, som illustreras i figur 2. Förfarandet för att göra de Raman / UV-Vis prober börjar genom att binda Raman reportrar till ytan av guldnanopartiklar (AuNPs). De AuNPs därefter funktionaliseras med antikroppar som är associerade med polyetylenglykol (PEG). Återstående bindningsställen på de AuNPs blockeras genom bindning metoxipolyetylenglykol tiol (mPEG-SH) till AuNPs att förhindra efterföljande icke-specifik bindning under analysen. De framställda AuNP prober testas genom att binda till antigenerfixerad till brunnarna i en polystyren-platta, såsom visas i figur 1B. Vid tvättning av plattan, är AuNP prober detekteras med hjälp av UV-Vis-spektroskopi medan intresse Raman reportrar detekteras med Ramanspektroskopi. Kombinera UV-Vis och Raman spektraldata ger två analysmetoder, öka kapaciteten hos denna immun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av buffertar
- Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
- Späd 50 ml 10x PBS med 450 ml HPLC-kvalitet vatten till en 1 x PBS koncentration. Sterilt filter av lösningen med ett 0,22 pm filter.
- Butikslösning vid rumstemperatur.
- Framställning av Tris saltlösning + Tween 20 (TBST)
- Späd 50 ml av 10x Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 450 ml av HPLC-kvalitet vatten till en 1x koncentration. Tillsätt 250 pl av Tween-20 för en 0,05% (volym / volym) Tween-20. Sterilt filter av lösningen med ett 0,22 pm filter.
- Förvaras vid rumstemperatur.
- Framställning av humant serumalbumin (HSA) blockeringslösning
- Väg 0,45 g av HSA i 15 ml steril filtrerad 1 x PBS för att göra en 3% vikt / volym HSA-lösning. Vortex lösningen tills HSA är helt upplöst.
- Store HSA-lösning vid 4 ° C.
OBS: Bovint serumalbumin(BSA) kan också användas som en blockeringslösning.
- Framställning av PEGylerad antikropp (PEG-Ab) lösning
OBS: Antikroppslösningen måste vara fri från bärare eller stabiliseringsproteiner såsom BSA, som skulle störa konjugationsreaktioner genom att konkurrera för n-hydroxisulfosuccinimid (NHS) bindningsställen. Om antikroppen kommer i en Tris eller glycin-buffertlösning, måste den genomgå en buffertbyte för att förhindra aminer eller ammoniumsalter från att störa NHS konjugeringsreaktionen. Om antikroppen är i en lyofiliserad form, kan den återsuspenderas i enlighet med tillverkarens rekommendation med en koncentration av 1-10 mg / ml.- För antikroppar i en Tris eller glycinbuffert, utför en buffertbyte till 100 mM natriumbikarbonat med användning av en avsaltningskolonn. Använda 100 mM buffert för att höja pH till ca 8,5 för att påskynda konjugeringsreaktionen.
- Hydrat orto-pyridyldisulfid-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) med 100 mM sodium bikarbonat till en volym av 1 ml vid en koncentration av 1 mg / ml eller högre.
OBS: OPSS-PEG-NHS bör göras färskt och användas inom ca 20 min. NHS-gruppen på den OPSS-PEG-NHS har en halveringstid på ungefär 20 min i en vattenlösning vid pH 8,5. - Lägga OPSS-PEG-NHS till antikroppslösningen vid ett 2: 1-förhållande (PEG: antikropp) konjugering förhållande som skall användas för testproverna. I ett separat mikrocentrifugrör, lägga OPSS-PEG-NHS till antigenlösningen vid ett 2: 1 konjugering förhållande som skall användas för kontroll.
OBS! 2: 1 förhållande antar en 50% konjugering effektivitet. Målet är att märka varje antikropp med en PEG-kedja. I detta steg, övermärkning är bättre än under-märkning. Använd följande ekvation för att bestämma de lämpliga volymer av OPSS-PEG-NHS och antikroppslösning:
där V är volymen, är C-koncentration uttryckt i molekyler eller entibodies per ml. Indexen PEG och Ab är OPSS-PEG-NHS och antikropp, respektive. Den slutliga volymen bör vara ungefär 250 l. - Inkubera PEG-Ab-lösning vid 4 ° C under 8 h eller över natten. Butikslösning i arbets portioner av cirka 25 ^ vid -20 ° C för att begränsa de frystupptiningscykler och se till att använda låga bindande rör.
2. Förbered UV-Vis / Raman Probes
- Förbereda nakna AuNP lösning
- Bered en 2 ml lösning av AuNPs med en koncentration av ca 1 x 10 11 partiklar per ml.
- Om de AuNPs måste koncentreras, fyll låga bindnings centrifugrör med 2.000 | il lager AuNP och centrifugera vid 5000 xg under 20 min eller tills supernatanten är klar. Avlägsna supernatanten genom pipettering, försiktigt så att inte störa AuNP pelleten.
- Kombinera de återstående AuNP lösningar in i ett rör och uppskatta koncention genom att erhålla en UV-Vis mätningar och jämföra värden till kända koncentrationer eftersom det är ett linjärt förhållande.
- Bered en 2 ml lösning av AuNPs med en koncentration av ca 1 x 10 11 partiklar per ml.
- Bestämma lämplig Raman reporter märkning förhållande
- Bered en arbetslösning av Raman-reporter löstes i metanol. Denna koncentration kommer att vara beroende av reportern används. I detta arbete, förbereda 3,3'-diethylthiatricarbocyanine jodid (DTTC) vid en arbetslösning av 200 pM.
- Under antagande av en slutlig volym av 100 | il för varje brunn, tillsätt tillräckligt med arbets reporter-lösning till varje brunn i den första raden av en 96-brunnsplatta så att den Raman reporter kommer att sträcka sig i koncentrationer från 0,2 pM till 10 pM. Tillsätt tillräckligt HPLC-kvalitet vatten till varje brunn så att volymen är 80 | il. Tillsätt 20 | il av AuNP till varje brunn gör en slutlig volym av 100 | il för varje brunn. Ett exempel ges i tabell 1.
- Mäta UV-Vis-spektra från 400 till700 nm med användning av en platt läsning UV-Vis spektrofotometer. Den lämpliga koncentrationen är den högsta koncentrationen med definierade toppar för den UV-Vis-spektra. Upprepa steg 2.2.2 vid ökande koncentrationer tills den högsta koncentrationen förhållandet mellan Raman reportrar till AuNPs hittas.
OBS: färgämnet och AuNP form, storlek, och tillverkare påverka den lämpliga koncentrationen. Därför måste stegen som anges utvärderas och ändras beroende på de komponenter som används. Detta protokoll involverade användning av en positivt laddad färgämne. Som sådan var bindningen mellan AuNP och reporter förbättras genom att använda negativt laddade AuNPs. Detta gjordes genom att använda citrat utjämnade AuNPs. Se diskussionen för ytterligare information.
- Bindande Raman reporter och PEG-Ab till AuNP
- Förbered två 1,5 ml satser av AuNP och Raman reporter på den tidigare bestämda koncentrationen, vilket gör att Raman reporter för att binda till de AuNPs under 30 min vid rumstemperatur.
- Lägga det PEGylerade antikropp (PEG-Ab) till en sats av den AuNP och Raman reporter lösning för att skapa en 200: 1-förhållande av antikroppar till partiklar. Denna lösning kommer att vara för testproverna. I ett separat mikrocentrifugrör, lägga det PEGylerade antigenet till den andra sats av AuNP och Raman reporter lösning vid ett 200: 1 förhållande av antikropp till partiklar som skall användas som kontroll. Inkubera lösningarna för 30 min vid rumstemperatur.
OBS: Förhållandet mellan antikroppar mot partiklar kommer att vara specifika för de AuNPs och färgämne som används och bör optimeras för varje enskilt fall. Målet här är att ha den högsta kvoten av antikroppar för AuNP prober för att binda till och samtidigt förhindra aggregation av partiklarna. Använd följande ekvation för att bestämma de lämpliga volymer för att lägga ihop:
där V är volymen, är C-koncentration uttryckt i partiklar eller antikroppar per ml. fenanal volym bör vara ungefär 1,5 ml.
- Block återstående platser på AuNP yta med mPEG-SH.
- Förbered mPEG-SH genom upplösning av fast metoxipolyetylenglykol tiol till en 200 ^ M koncentration med vatten. Vortexa lösningen tills mPEG-SH är helt upplöst.
- Lägg mPEG-SH på en 40,000: 1 förhållande till AuNP-PEG-Ab lösning i steg 2,3. Inkubera lösningen vid rumstemperatur under 10 min för att säkerställa de återstående ställen på guldnanopartiklar är blockerade. Använd följande ekvation för att bestämma de lämpliga volymer för att lägga ihop:
där V är volymen, är C-koncentration uttryckt i partiklar eller antikroppar per ml. Den slutliga volymen bör vara ungefär 1,5 ml.
- Återvinna funktionaliserade Raman-sonder.
- Centrifugera partiklar vid 5000 xg under 20 minuter i låg bind centrifuge rör eller tills supernatanten är klar. Avlägsna supernatanten genom pipettering försiktigt så att inte störa AuNPs.
- Suspendera partiklarna med 1 ml 1X PBS-lösning som gjordes tidigare. Uppskatta AuNP koncentrationen genom att ta en UV-Vis mätningar av en liten volym av lösning (3 | j, l) och jämför resultaten för att mätningarna från en känd AuNP koncentration. Justera volymen så att den slutliga lösningen är åtminstone 1 x 10 11 partiklar per ml.
- Butikslösningar vid 4 ° C tills det används för funktionalisering av immunplattan. Använd lösningarna inom en vecka.
| Volymerna för att lägga av varje komponent (ml) | |||
| DTTC slutlig koncentration (mM) | DTTC arbetslösning (200 mM) | AuNP | Vatten |
| 0,2 0,1 | 20 | 79,9 | |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| 2 | 1,0 | 20 | 79 |
| 5 | 2,5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3,5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5,0 | 20 | 75 |
Tabell 1. DTTC utspädnings exempel. Olika spädningar av DTTC och de associerade volymer av lager DTTC, guld nanopartikel-lösning och vatten.
3. Immunoassay Plate Framställning
- Binda önskade antigenet till immunanalysplattan.
- Förbered tillräckligt utspädd antigen (50 ng / ml) för att fylla polystyrenbrunnar. Vortexa lösningen,och omedelbart tillsätta lösningen till de plattbrunnar. Göra det möjligt för antigenet att binda till plattorna under 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta bort obundna antigener.
- Avlägsna överflödigt antigenlösningen genom att dumpa lösning i en avfallsbehållaren och slå plattan mot en pappershandduk täckt bordsskiva.
- Lägg TBST till brunnarna för att tvätta ytan sedan bort tvätten på samma sätt som tidigare angivits. Upprepa detta steg två gånger.
- Block Återstående bindningsställen på plattan för att förhindra icke-specifik bindning.
- Lägg 70 | il HSA blockeringslösning till varje brunn i plattan och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Ta bort och skölj plattan med användning av samma förfarande som angivits i steg 3,2. Täck plattan och lagra torrt vid 4 ° C tills redo för vidare användning.
- Funktionalisera immunplatta.
- Lägg 70 | il than sond nanopartiklar som framställts i avsnitt 2 till den första kolumnen i en platta med 96 brunnar och späd efterföljande kolumner med hjälp av en 1: 2 serieutspädning. Låt plattan inkubera under åtminstone en timme. Ett exempel på hur man framställer immunanalysplattan ges i figur 3.
- Tvätta plattan med TBST fem gånger som beskrivs i steg 3,2, och se till att förfoga över AuNPs lämpligt sätt. Efter den slutliga tvätten, tillsätt 70 | il av 1 x PBS till varje brunn och täck med en plattförslutning.
OBS: De kontrollprover ska vara klar. Om icke-specifik bindning har inträffat, kommer kontrollproverna har en liknande färg som testproven.
- Test analyskänslighet genom UV-Vis och Ramanspektroskopi.
- För varje brunn, mäta UV-Vis-spektra i intervallet från 400 till 700 nm med användning av en platt läsning UV-Vis spektrofotometer.
- Med användning av ett inverterat Raman mikroskop, fokusera målet på ytan av den brunn som har den AuNP sonder. obtain en Raman-spektra av brunnen. Samla ett spektrum som sträcker sig från 1800 cm -1 till 400 cm -1. Upprepa detta steg för alla brunnar.
- Använda en lämplig spektral programvara, utföra en 11: e ordningens polynom baslinjekorrigering för Raman-spektra och en 3: e ordningens polynom för UV-Vis-spektra.
- Använda en lämplig spektral programvara, normalisera Raman och UV-Vis-spektra. Ställ in maxvärdet till en och skala alla andra värden i enlighet därmed. För att normalisera Raman-spektra, välj en unik polystyren topp och ställ in den lika med en och skala alla andra värden i enlighet därmed.
- Använda en lämplig spektral programvara, utför toppintegrering för varje spektrum. För Raman spektra, måste toppen representerar Raman reporter vara i ett område frånvarande av polystyren toppar. För att utföra toppintegrering, ange integrerade gränser för den önskade toppen och spela den önskade toppytan för samtliga prover inklusive kontroll.
- plot den genomsnittliga topparean av intresse som en funktion av logaritmen för AuNP koncentration med felstaplar för varje punkt som anger dess tillhörande standardavvikelse. Montera dessa kalibreringspunkter till en 4-parameter logistisk kurva.
- Bestämma medelvärdet av ämnet genom medelvärdes området för toppen av intresse för ett blankprov. Bestämma standardavvikelsen av dessa områden; detta är standardavvikelsen av ämnet.
- För samma topp analyserades i det föregående steget, finner standardavvikelsen för att topparean för den lägsta koncentrationen.
- Beräkna gränsen för ämnet och lägre detektionsgräns som anges i resultaten avsnittet representanten. Använd dessa värden med 4PL kalibreringskurvor för att bestämma LLOD i termer av AuNP koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie var 60 nm guldpartiklar som används för UV-Vis-spektroskopi. UV-Vis absorptionsspektra från 400 till 700 nm samlades in och toppområden för varje AuNP koncentration bestämdes med hjälp av en öppen källkod spektralanalys programvara 8. Före topp integration, det uppsamlade spektra gick baslinjekorrigering använder en trepunkts polynomanpassning. Toppytorna användes för att generera en logaritmisk kalibreringskurva såsom visas i fig 4. Det bör noteras att figurerna 4 och 5 införlivas logaritmiska kalibreringskurvor. Användningen av icke-linjära kalibreringskurvor kan avsevärt utöka det dynamiska omfånget av en analys och har blivit en vedertagen praxis för olika immun som kräver lågväxel detektionskapacitet 9,10.
För att kvantitativt bedöma känsligheten hos analysen, gränsen för ämnet (LOB) ochden lägre detektionsgränsen (LLOD) beräknades enligt följande 
där standardavvikelsen för blankprovet och av de lägsta provkoncentrationen är σ BLANK och σ Low, respektive, medan 
är medelvärdet av ämnet 11,12. Med hjälp av dessa definitioner, liksom den genererade 4-parameter logistisk kalibreringskurva, den LLOD för UV-Vis var 3:05 guldnanopartiklar.
Med användning av en Raman-spektroskopi inställning i detalj tidigare 7, ett 785 nm inverterat Raman mikroskop användes för att samla in spektra från DTTC Raman reporter associerad med den funktionaliserade immunanalysplattan. Driftparametrar inkluderade 7 mW lasereffekt och en 10 sek acförvärvstiden. Spektra genomgick baslinjekorrigering (11: e ordningens polynom) och toppintegrering. Figur 5 visar fyra-parameters logistisk kalibreringskurva genereras för de DTTC toppareor för 493 cm-1 och 508 cm-1 DTTC toppar. Som den exakta koncentrationen av Raman reporter bunden till AuNP ytan var okänd, var kalibreringskurva baserad på AuNP koncentration. Med hjälp av ekvationerna beskrivna ovan, var LLOD bestämdes till 13:07 av AuNP.
Figur 1. Illustration av direkt och indirekt immunanalys. Illustration av indirekt (A) och direkta (B) detektionssystem för immun. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Nanopartiklar sond tillverkning illustration. Process av funktionalise Raman / UV-Vis sönder för immun. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Beredda immunplatta. Bild av en preparerad immunplatta. Rader A till E är tester prover, medan rader F-H är kontrollprover. Kolumn 1 innehåller outspädda nanopartiklar och varje efterföljande kolumn har halva koncentrationenav AuNP sonder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. UV-Vis kalibreringskurva för immunanalys med användning nanopartikelsonder. Logaritmisk kalibreringskurva för UV-Vis-toppareor till nanopartikelkoncentration. Monterade linjen är en 4-parameter logistisk (4PL) kurva. Felstaplar indikerar topparean standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Raman kalibreringskurva för immun använder nanopartiklar sonder. Kalibreringskurva korrelerar Raman reporter topparea guld nanopartiklar koncentration. Monterade linjen är en 4-parameter logistisk (4PL) kurva. Felstaplar indikerar topparean standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den detaljerade protokoll, det finns flera kritiska punkter för att ta itu med. En fråga är valet av Raman reporter och guld nanopartiklar. Även protokollet skrevs anpassas för enskilt bruk, var Raman reporter DTTC används som ett exempel. DTTC är en positivt laddad reporter och binder till negativt laddade ytor såsom citrat utjämnade AuNPs. Detta protokoll kan anpassas för negativt laddade reportrar med hjälp av guldnanopartiklar med en positiv ytladdning. Till exempel, polyetylenimin (PEI) utjämnade AuNPs ge en positiv ytladdning och bättre bindning med negativt laddade reportrar.
Upprätthålla balansen mellan proteiner och nanopartiklar är ett kritiskt steg i detta protokoll. Denna balans uppnås genom att tillsätta PEGylerade antikroppar vid en optimerad antikropp guld nanopartiklar förhållande på 200: 1. Om pegylerat antikropparna tillsätts till guldnanopartiklar lösning på en betydligt högre andel än this, kan jon-inducerad partikelaggregation inträffa. Alternativt, vid för liten för ett förhållande, skulle protein aggregation och olöslighet inträffa. Detta förhållande måste bestämmas i varje enskilt fall.
En annan kritisk protokoll steg är konjugering av OPSS-PEG-NHS till antikroppen. Detta steg föregås genom suspendering OPSS-PEG-NHS i natriumbikarbonat där NHS-gruppen binder till antikroppen. Denna konjugering steg konkurrerar med den ogynnsamma hydrolysreaktionen som tidigare 7 detalj. Hydrolysreaktionen är mer sannolikt att hända med tiden, och som sådan bör den OPSS-PEG-NHS till antikroppsbindning utföras omedelbart.
Slutprodukten av protokollet är en immunanalys som kan testas med avseende på känslighet genom konstruktion av en kalibreringskurva med användning av UV-Vis och Raman-spektroskopi. Resultaten indikerar att immunanalysen är jämförbar med andra bioanalyser 13-17 vilka har detektionsgränser of 01:00. Inte bara är Raman immunoassay känslighet konkurrenskraftiga med andra biologiska testsystem, har den potential för förbättrad känslighet med hjälp av ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS). SERS omfattar användningen av guldnanopartiklar eller en uppruggad guld yta för att öka utsläppen Raman. Eftersom detta protokoll finns redan användningen av guldnanopartiklar sonder, det är väl lämpad för utveckling i en SERS immun. I framtiden skulle denna teknik kunna användas för utveckling av en ljusspridande immun som skulle kunna användas för att detektera många protein analyter samtidigt. Som biomarkör profilering blir allt viktigare för diagnos och behandling av en mängd olika sjukdomar, kan denna teknik ha djupgående kliniska tillämpningar.
Vanliga problem som är förknippade med detta protokoll inkluderar aggregering av guld nanopartiklar, otillräcklig bindning av blockerande proteiner, bindning av icke-specifika proteiner, och en svag Raman signal. Dessa problem äranges i tabell 2 tillsammans med den möjliga orsaken till problemet och handlingssteg för att ta itu varje problem. Andra problem kan uppstå på grund av begränsningar i protokollet. För det första är detta protokoll begränsas till AuNP koncentrationer upp till 5 x 10 12 partikel / ml, såsom högre koncentrationer tenderar att orsaka aggregation. Tekniken bygger på stabila, icke-aggregerade nanopartiklar för uppskattning av nanopartiklar koncentrationer. Om det finns aggregering, kommer uppskattningen av nanopartiklar koncentration vara partisk. Protokollet är också begränsad till Raman reportrar med toppar starka nog att övervinna den polystyren bakgrunden och är unika från polystyren. Slutligen användningen av traditionella 96-brunnars plattor begränsa protokoll som ska användas av en inverterad Raman mikroskop på grund av höjden på plattorna. I annat fall måste en låg förstoring användas för mikroskopobjektivet Raman att rymma 96-brunnar höjd.
| Symptom | Trolig orsak | Korrigerande åtgärder |
| Guldnanopartiklar aggregera efter centrifugering och resuspension. | Raman-reporter koncentrationen är för hög. | Testa en rad Raman reporter koncentrationer som anges i avsnitt 2.2 eller detta protokoll. |
| Antikroppen till AuNP förhållandet är för högt. | Minska antalet PEGylerade antikroppar bundna till nanopartiklar ytan för att öka partikelstabiliteten. | |
| MPEG-SH blockeringsmedlet är inte bindande till AuNP ytan. | Förbered mPEG-SH lösning färsk före nanopartiklar blockering. | |
| Icke-specifik bindning till immunanalysplattytan | Den immunplattan är otillräckligt blockerad. | Bered blockerande lösningen frisk innan plattan kulctionalization. |
| Molekylvikten för mPEG-SH inte är tillräckligt stort. | Säkerställa att mPEG-SH-molekyl som används för blockeringen inte har en molekylvikt av 5.000 kDa eller högre. | |
| Svag eller frånvarande Raman signal | Raman reporter är inte bindande till partikelytan. | Säkerställa Raman reporter får binda under åtminstone 30 minuter före tillsats av det PEGylerade antikropp. |
| Molekylvikten för mPEG-SH inte är tillräckligt stort. | Se till att nanopartiklar kapslingsmedlet har lämplig avgift för jonisk Raman reporter bindning. |
Tabell 2. Felsökning för vanliga problem. Förteckning över vanliga problem under protokollet med tillhörande orsaker och korrigerande åtgärdspunkter.
I detta manuskript har vi presenterat aprotocol för anpassad tillverkning av en nanopartikel-sond baserad immun för analys med hjälp av UV-Vis / Raman-spektroskopi. Protokollet inkluderar funktionalisering av guldnanopartiklar med Raman reportrar och immunoglobuliner för direkt detektion av antigener bundna till en polystyrenplatta. Protokollet kan anpassas för att passa en viss Raman reporter och tillhörande excitationsvåglängd. Guld nanopartiklar form och storlek kan också ändras. Men lösningsförhållanden för lämplig bindning varierar beroende på Raman reporter används samt nanopartiklar storlek, form, och tillverkare. Protokollet har skrivits för att spola forskare när lösningsförhållanden skall bestämmas för varje unikt arrangemang och därmed göra det möjligt för anpassad tillverkning enligt forskningsbehov. Till skillnad från de typiska fluorescerande / kolorimetrisk immun protokoll, håller detta protokoll potential för större multiplexering kapacitet medan kapitalisera på en befintlig infrastruktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 ml | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 | |
| In-house built 785 nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/ (2004).
- ELISA development guide. , [Accessed: 28-Mar-2016] https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , [Accessed: 28-Mar-2016] http://www.effemm2.de/spekwin/ (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
