Summary
Un protocollo per l'estrazione dei pigmenti dai granuli nanostrutturati in Doryteuthis pealeii cromatofori calamaro è presentato.
Introduction
Cefalopodi, come calamari, seppie, polpi e hanno la capacità di modificare dinamicamente il loro aspetto per camuffare e la segnalazione. 1-6 Questa capacità è sostenuto in parte dall'espansione areale selettivo degli organi pigmentate noto come cromatofori. 4,7-9 Cromatofori sono attuatori morbidi che contengono una rete di granuli di pigmento nanostrutturati confinati all'interno di un sacculus cytoelastic ancorato radialmente dalle fibre muscolari. 1,3 Come sono azionati, chromatophores espandono da 500% della superficie presentata distribuendo i granuli in tutto l'organo. 3,7 , 10,11 Quando questa azione è concertata su un numero di cromatofori, la colorazione generale dell'animale è cambiato. Mentre è noto che i granuli di pigmento contribuiscono a questo cambiamento di colore, la composizione rimane sconosciuta. Descriviamo una procedura per isolare e purificare pigmenti chromatophore che possono essere adattati per i futuri studi compositivi.
3,12 chromatophore tessuto contenente viene raccolto attraverso un'attenta estirpazione dal cefalopode. Un processo di digestione e omogeneizzazione viene poi utilizzato per dissociare il tessuto circostante e separare le cellule chromatophore. I granuli nanostrutturati sono poi isolato e purificato dalle restanti cromatofore utilizzando ripetuta sonicazione e centrifugazione. Al momento di purificazione, i pigmenti vengono estratti dai granuli in un processo che è adattato da l'estrazione del colore visibile da ali di farfalla con soluzioni di metanolo acide. 13 microscopia elettronica a scansione (SEM) e spettrofotometria vengono utilizzati per confermare che i pigmenti chromatophore vengono estratti con successo utilizzando questo processo.
Questo metodo descrive l'isolamento di granuli chromatophore che viene utilizzato per esplorare i contributi molecolari alla coloration in cefalopodi. 12 piccole estrazioni molecola di animali interi possono spesso essere un processo lungo e noioso. L'obiettivo è quello di informare futuri ricercatori di un protocollo efficace e facile per l'acquisizione dei pigmenti granuli nanostrutturati a cefalopodi.
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Protocol
studi su animali invertebrati condotti nel presente documento non sono regolamentati negli Stati Uniti; pertanto il Comitato Cura e uso istituzionale degli animali non ha l'autorità per la revisione di tali protocolli. Al posto di questi che non rientrano sotto la giurisdizione del regolamento negli Stati Uniti, gli autori dichiarano che questi studi sono stati condotti con sforzo sincero verso l'uso etico, la cura e il trattamento di questi animali, il numero di individui è stato ridotto al minimo e questi sforzi sono coerenti con la Dichiarazione di Basilea e del Consiglio internazionale per Laboratory Animal Science (ICLAS) le linee guida etiche.
1. Doryteuthis pealeii (pealeii D.) Dissection
- Acquisto decapitato calamari D. pealeii del Dipartimento risorse marine al Marine Biological Laboratory a Woods Hole, MA o da qualsiasi mercato del pesce fresco. Non usare campioni che sono stati raccordati o precedentemente alterati al fine di applicare questa procedura. In particolare, il chromastrato tophore deve essere ancora intatta sul provino.
- Se gli animali non vengono utilizzati immediatamente, conservarli a -20 ° C fino al momento dell'uso. Per scongelare i campioni, metterli in acqua a temperatura ambiente per 1 ora prima di dissezione.
- Utilizzando diritta di acciaio inossidabile forbici dissezione a punta fine, tagliare lungo il lato posteriore della animale. Iniziare alla base del mantello ventrale, e termina in corrispondenza della zona della pinna.
- Rimuovere tutti gli organi interni (stomaco, Branchia, ghiandola inchiostro, organi riproduttivi, cuore sistemica, e cuore brachiale) sollevandole con dissezione forcipe e recidere il loro tessuto connettivo con le forbici dissezione. Scartare gli organi in un sacchetto campione.
- Utilizzare dissezione T-pin per pin mantello (lato fin verso l'alto) in uno standard 11-1 / 2 "x 7-1 / 2" x 1-1 / 2 "pan dissezione di alluminio contenente un pad dissezione flessibile. Immergere il tessuto in 250 ml di acqua di mare che è stata filtrata attraverso un sistema di filtrazione a vuoto in polistirolo usa e gettacontenente 0,2 micron dimensioni dei pori.
- Rimuovere accuratamente lo strato epidermico della pelle (colore opaco) con dissettore, mantenendo intatto lo strato di pelle chromatophore contenente. Una volta che lo strato epidermico viene rimosso, gettare in un sacchetto campione.
- Sezionare piccoli (1 cm x 1 cm) sezioni dello strato chromatophore con pinze e forbici dissezione. Raccogliere campioni in provette da 1,5 ml micro-centrifuga (riempire la metà di ciascun tubo vuoto con il tessuto sezionato).
- Aggiungere 500 ml di acqua di mare filtrata al tessuto contenente tubi. I campioni possono essere conservati a 4 ° C.
2. isolamento chromatophore pigmento Granuli
- Tissue Digestione
- Preparazione di papaina / collagenasi
- Pesare 30 mg di collagenasi e 5 mg di papaina utilizzando una "x 4" a basso azoto 4 pesare carta. Trasferire questi in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml con tappo a vite.
- Misurare 10 ml di deionizacqua ed usando una pipetta graduata. Aggiungere direttamente al flacone contenente papaina / collagenasi. Vortex l'impostazione più alta fino a quando la soluzione è chiara.
- La rimozione del tessuto extracellulare
- Centrifugare il tessuto chromatophore raccolti dal punto 1.7 per 5 minuti a 14.000 x g. Eliminare lo strato superiore di acqua marina in un secchio rifiuti di plastica.
- Aggiungere 500 microlitri della soluzione di papaina / collagenasi al tessuto mediante un P1000 volume variabile singolo canale micropipetta. Vortex ogni campione per 1-2 minuti sulla posizione più alta.
- Sonicare i campioni per 5 min ad una frequenza di 40 kHz dissociare le cellule dal tessuto circostante.
- Centrifugare per 5 min a 14.000 x g. Eliminare il surnatante in un secchio di rifiuti di plastica.
- Centrifugare il tessuto chromatophore raccolto per 5 min a 14.000 x g. Eliminare lo strato superiore di acqua marina in un secchio rifiuti di plastica. Ripetere ancora una volta.
- rimuovere manualmente ogni residuo grande sec tessutozioni che non digeriscono in questo processo con forcipe prima di procedere alla fase successiva.
- Preparazione di papaina / collagenasi
- Isolando il pigmento Granuli
- Preparazione di omogeneizzazione Buffer
- Pesare 2,38 g di (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic) (HEPES, 100 mM), 0,095 g di cloruro di magnesio (10 mM), 0,856 g di potassio-aspartato (50 mM), e 0,015 g di ditiotreitolo (1 mM). Trasferire in un contenitore di polistirolo da 150 ml con tappo a vite. Aggiungere una mini inibitore della proteasi tablet commerciale.
- Misurare 100 ml di acqua deionizzata utilizzando un cilindro graduato. Aggiungere direttamente al contenitore contenente i sali di omogeneizzazione. Vortex fino a quando la soluzione è limpida.
- Omogeneizzazione dei granuli di pigmento
- Centrifugare ogni campione dal punto 2.1 a 14000 g per 5 min. Eliminare il surnatante in un secchio di rifiuti di plastica. Questo campione fosse nulla di tessuto extracellulare.
- Aggiungere 500 &# 181; l di tampone di omogeneizzazione a ciascuna provetta e vortex per 1-2 minuti ciascuno per mescolare accuratamente i campioni. Sonicare i campioni per 30 minuti (~ 40 kHz) e seguire con 5 minuti di centrifugazione a 14.000 x g.
- Eliminare il surnatante in un secchio di rifiuti di plastica, e ripetere il passaggio precedente 2-3 volte per assicurare la completa digestione delle proteine chromatophore sacculus e pastoie. Il residuo della soluzione deve contenere un surnatante giallo chiaro e una pastiglia di colore rosso contenente gli isolati granuli di pigmento.
- Preparazione di omogeneizzazione Buffer
3. pigmento Estrazione
- Preparazione di Metanolo acido (HCl-MeOH)
- Aggiungere con cautela 25 ml di concentrato (36,5-38% (w / w)) acido cloridrico (HCl) a 5 ml di metanolo (MeOH). Conservare la soluzione di HCl-MeOH in un tappo a vite fiala del campione di vetro. Agitare delicatamente per mescolare uniformemente la soluzione.
NOTA: Il più acido della soluzione, la più pigmento verrà estratto durante la fiprima estrazione.
- Aggiungere con cautela 25 ml di concentrato (36,5-38% (w / w)) acido cloridrico (HCl) a 5 ml di metanolo (MeOH). Conservare la soluzione di HCl-MeOH in un tappo a vite fiala del campione di vetro. Agitare delicatamente per mescolare uniformemente la soluzione.
- Estrazione di pigmento
- Centrifugare la sospensione di pigmento granuli (da 2.2.2) per 5 min a 14000 g e scartare il surnatante in un secchio di rifiuti di plastica.
- Aggiungere 500 ml di soluzione di HCl-MeOH e vortice ogni campione per ~ 3-4 min. Sonicare i campioni per 10 min (~ 40 kHz), quindi si centrifuga per 5 min a 14.000 x g.
- Usando una pipetta di trasferimento, raccogliere il surnatante in un flaconcino tappo a vite in vetro 1 dram. Il supernatante dovrebbe essere di colore rosso scuro.
- Ripetere la fase di estrazione 3.2.2 fino a quando non più di colore viene estratto (~ 4-5 lavaggi).
NOTA: ogni estrazione sarà resa ~ 1,5 ml di pigmento. Il pellet incolore rimanente è il pigmento estratto granuli. NOTA: Entrambi i granuli incolori e pigmenti estratti possono essere conservati in acqua a 4 ° C fino all'utilizzo.
4. Caratterizzazione tutta Processo di estrazione
- scansione ElECTRON Microscopia
- Immagine granuli (non reagiti dal punto 2.2.1 e pigmento-estratta al passo 3.2.3) mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) per verificare la purezza del processo di estrazione.
- Per preparare i campioni granulari per l'imaging, prima centrifuga sia granuli che non hanno reagito e pigmenti estratti granuli per 5 minuti a 14000 g, e scartare il surnatante in un secchio di rifiuti di plastica. Risospendere questi in 1 ml di etanolo, e deposito 2-3 gocce di sospensione granuli Onto mozziconi di alluminio SEM utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Dopo l'essiccazione dei campioni durante la notte, sputtering cappotto con rivestimento in oro-platino per 3 minuti per ottenere un rivestimento 15 nm.
- Immagine al SEM con un emettitore Schottky e un rivelatore di elettroni secondari. Utilizzare una tensione fascio 5-7 kV e una distanza di lavoro tra 8 e 9 mm di immagine questi materiali.
- Le misurazioni spettrofotometriche ultravioletto-visibile (UV-vis)
- Monitorare l'assorbanza profile per tutte e 3 le condizioni (granuli che non ha reagito da 2.2.2, il pigmento estratto dalla 3.2.3, e pigmenti estratti da granuli 3.2.4) utilizzando uno spettrofotometro a doppio raggio 200-800 nm.
- Raccogliere una misurazione vuoto utilizzando acqua deionizzata in una cuvetta 1 ml per i granuli non reagiti ei pigmenti estratti granuli. Raccogliere spettri di assorbimento UV-Vis per entrambi i campioni.
- Raccogliere una misurazione vuoto utilizzando la soluzione di metanolo acido in una cuvetta 1 ml per il pigmento estratto. Raccogliere spettro di assorbimento UV-Vis per il campione.
- Determinare la massima lunghezza d'onda di ciascun campione identificando la lunghezza d'onda alla quale il picco di assorbanza raggiunge la sua altezza relativa massima.
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Representative Results
Cromatofori sono sezionati dal D. pealeii dorsale del mantello (Figura 1A, 1B). Una volta che sono rimossi, chromatophores vengono lisate e purificati mediante centrifugazione e lavaggio cicli di isolare i granuli pigmentati (figure 2A, 2B). Soluzioni acide metanolo (HCl-MeOH) sono utilizzati per estrarre il pigmento dai granuli (Figura 2C), ottenendo un estratto di pigmenti solubili e insolubili, granuli di pigmento estratti incolori.
Il processo di estrazione riduce il diametro medio dei granuli. Questo si osserva mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Prima che i granuli sono esposti a HCl-MeOH, hanno un diametro medio di (527.3 ± 91,8) nm (N = 100, l'errore è la deviazione standard; Figura 3A). Se il pigmento è estratto dai granuli, la diminuzione dimensionis a (202,6 ± 32,2) nm (N = 100, l'errore è la deviazione standard, la figura 3B). Questa riduzione delle dimensioni si ipotizza sia dovuta alla estrazione di pigmento dal granulo quando trattato con HCl-MeOH.
Per verificare questa ipotesi, le differenze di pre colore visibile e l'estrazione post sono monitorati utilizzando la microscopia ottica e spettrofotometria. Dopo aggiunta di HCl-MeOH, il colore associato con i granuli non reagiti riduce visibilmente (Figura 4A). Questo è ulteriormente caratterizzato mediante spettrofotometria UV-vis (Figura 4B), in cui si osserva un ampio profilo assorbanza (~ 280-800 nm) per i granuli pre-estratto e granuli postali estratti, sebbene ad intensità molto più bassa; mentre, l'estratto di pigmento solubile presenta un max lambda centrata a ~ 500 nm, con una spalla a ~ 380 nm. Collettivamente, questi dati suggeriscono un metodo per estrarre correttamente il colore visibile dai granuli.
Figura 1: Cromatofori da calamari D. pealeii. (A) Squid D. pealeii manto dorsale. (B) di campo immagine luminosa di cromatofori rosso, giallo, e marrone. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Illustrazione di processo di estrazione (A) Cromatofori vengono sezionati. (B) granuli di pigmento vengono rimossi dal tessuto chromatophore omogeneizzata e purificato usando una serie di cicli di centrifugazione e lavaggio. (C) Il pigmento può essere ex rappresenta un'opera dai granuli utilizzando HCl-MeOH producendo un surnatante pigmento solubile che è separato dai granuli di pigmento incolore estratti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: HCl-MeOH estrazione altera diametro dei granuli nanostrutturati microscopio elettronico a scansione di (a) metanolo pre-acido estratto granuli di pigmento e (B) metanolo post-acido estratto granuli di pigmento.. Scala bar = 1 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4: HCl-MeOH estrazione altera colore visibile di granuli nanostrutturati (A) le immagini in campo chiaro di granuli di pigmento in tutto il processo di estrazione.. (B) spettri di assorbimento di pre (nero) - e dopo (blu) -. Estrazione con il surnatante pigmento (rosso) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo dimostrato un metodo per estrarre i pigmenti da granuli chromatophore calamari. Prendendo di mira in particolare i granuli, il nostro obiettivo è quello di determinare il loro ruolo nella mediazione colorazione adattivo. Questo metodo si differenzia da precedenti relazioni destinate a caratterizzare i pigmenti di cefalopodi utilizzando campioni di tessuto di massa 14 o liofilizzato pelle 15.
Mentre questo protocollo è efficace a estrarre pigmenti chromatophore, è limitata a piccole scaglie di reazione. Sezionare uno rendimenti calamari ~ 11 mg di granuli purificati. Circa il 58% di tale massa contiene il pigmento solubile, che viene estratto utilizzando la soluzione HCl-MeOH. 12 La purezza del tessuto di partenza chromatophore influenza direttamente la resa del prodotto da una dissezione. Se i campioni appaiono contaminati da eccesso epidermico o tessuto iridophore raccolti durante la dissezione, è meglio separare il contenuto del campione, li risospendere in buf aggiuntivofer, e iniziare l'omogeneizzazione passi da capo. Isolamento di una popolazione pura di granuli di pigmento dal tessuto chromatophore può richiedere un massimo di otto, 4 cicli hr sonicazione che potrebbe estendersi in tutto 4 giorni. È importante rimanere paziente in isolamento per garantire una popolazione pura di granuli di pigmento.
La purezza della soluzione di partenza granuli influenza anche le fasi di estrazione di pigmenti con HCl-MeOH. Se i granuli sono occluse da tessuto non digerito, semplicemente vortice e sonicazione campioni fino a 1 ora e omogeneizzare il campione prima di iniziare di nuovo l'estrazione. Spesso 4-5 lavaggi con 500 ml di HCl-MeOH per campione sono necessarie per estrarre il pigmento dai granuli. Se fatto correttamente, questa procedura sarà resa tra 2-3 ml di pigmento solubile per campione. Quando purificazione addizionale viene impiegata tramite cromatografia su strato sottile, i pigmenti isolati separano in quattro frazioni uniche contenenti concentrazioni variabili di xanthommatin e decarboxanthommatin xylated. 12
Questo metodo può essere utilizzato da chimici, biologi, o ingegneri di comprendere meglio il ruolo dei pigmenti nella modulazione colore. La presenza del pigmento all'interno dei granuli suggerisce un meccanismo gerarchico per la colorazione in cefalopodi che ha origine con i componenti molecolari contenuti in nanostrutturato chromatophore granuli di pigmento. Questi risultati possono essere utilizzati per informare i sistemi attrezzata, progettata per imitare la gamma dinamica di colori precisa visualizzato in cefalopodi utilizzando nanoparticelle pigmentate preconfezionate.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Alfa Aesar | 9001-12-1 | No hazard |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3482-12-3 | Irritant, acute toxicity |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | Mild irritant |
| Hydrochloric acid | EMD Chemicals | 7647-01-0 | Corrosive |
| k-Aspartate | Sigma-Aldrich | 1115-63-5 | Reacts violently with oxidants |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Mild eye irritant |
| Methanol | Pharmco-AAPER | 67-56-1 | Highly flammable |
| Mini tablet prtoease inhibitor | Sigma-Aldrich | 469315-90-01 | Corrosive to metal and skin |
| Papain | Sigma-Aldrich | 9001-73-4 | Irritant |
References
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