Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Изучение протеасоме Ассамблею с рекомбинантным архейных Протеасомы и нативных ПААГ: Случай для комбинированного подхода

Published: December 17, 2016 doi: 10.3791/54860
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

Summary

Этот протокол использует как субъединицу коэкспрессия и postlysis субъединицу смешивания для более тщательного изучения рекомбинантного протеосомного сборки.

Abstract

Протеасомы встречаются во всех областях жизни. Они обеспечивают основной путь внутриклеточной деградации белка у эукариот, хотя их сборка не до конца понятен. Все протеасомы содержат структурно законсервированный основную частицу (СР), или 20S протеасомы, содержащие два heptameric -субъединицы кольца зажатой между двумя heptameric α субъединиц колец. Архейных 20S протеасомы композиционно проще по сравнению с их аналогами эукариотических, но они оба имеют общий механизм сборки. Следовательно, архейных 20S протеасомы продолжают оставаться важными моделями для эукариотической протеасомы сборки. В частности, экспрессия рекомбинантного архейных 20S протеасом в сочетании с нативных электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) принесло много важную информацию о протеосомного биогенеза. Здесь мы обсудим средства для улучшения при обычной стратегии соэкспрессии архейных протеосом альфа и бета субъединиц до nondenaturiнг СТР. Показано, что, хотя быстрый и эффективный, A коэкспрессия подход один может пропустить ключевые промежуточные сборки. В случае протеасомы, коэкспрессия не может позволить обнаружение половинной протеасомы, промежуточный, содержащий один полный альфа-кольцо и один полный бета-кольцо. Тем не менее, этот промежуточный продукт легко обнаруживается с помощью лизата смешивания. Мы полагаем, что сочетание коэкспрессия с лизата смешивания дает подход, который более тщательно при анализе сборки, пока остается труд nonintensive. Этот подход может быть полезен для изучения других рекомбинантных мультибелковых комплексов.

Introduction

Мультибелковых комплексы осуществляют многочисленные критические клеточные активности 1. Для многих из этих комплексов, известно гораздо больше о своей структуре и функции , чем об их сборке 2,3. Протеасома является одним из таких комплексов и встречается во всех областях жизни. У эукариот, эта молекулярная машина находится в ядре системы убиквитин / протеасоме (ИБП) и обеспечивает основной путь деградации внутриклеточного белка 4. Эукариотической Протеасома (называемый протеасомы 26S) состоит из двух основных сборочных узлов: в 20S протеасомы, или коровой частицы (СР) 5, которые могут быть блокированы на одном или обоих концах посредством 19S регуляторной частицы (РП) 6.

Протеасома 20S является большой разобщенным протеазы. Его четвертичная структура абсолютно сохраняется во всех областях жизни и состоит из набора из четырех из семи членные кольца, содержащие два типа структурно родственных субъединиц, α; и & beta ; 5,7,8. В эукариот, два внешних кольца каждое из которых состоит из семи различных а субъединиц и два внутренних кольца каждое из которых состоит из семи различных субъединиц; протеолитическая активность находится в пределах трех субъединиц. В противоположность этому, CP кольца архебактерий и бактерий, как правило, состоят только из одного типа а и одного типа -субъединицы. Архейных протеасомы обеспечили важную модельную систему для изучения сборки протеасомы как за счет их композиционной простоты и их обмена общий механизм сборки с их аналогами эукариотических 9-13. Короче говоря, альфа-субъединицы собираются в кольца альфа-первых, которые служат в качестве каркаса, на который субъединиц собрать. Полученные в результате сводными протеасомы (α β 7 7) димеризуются, порождая в полностью собранном виде CP (α β 7 7 β 7 α 7). Во время димеризации, в пропептиды присутствует на субъединицявляются аутокаталитически удалены, подвергая каталитические N-концевые треонина. Использование архейных протеасомах для сборки модели часто использует преимущества получения рекомбинантных архейных протеосом белков в кишечной палочки. Это очень важный подход, поскольку он позволяет субъединиц производить в различных комбинациях, и как WT и мутантных версий, в организме-хозяине, которая не производит свои собственные протеасомы.

Контроль сборки нескольких белковых комплексов биохимически требует какой-то метод фракционирования, отделяющей в полностью собранном виде комплексов из сборочных промежуточных и прекурсоров. Благодаря своей превосходной разрешающей способности, нативных полиакриламидного гель электрофореза (PAGE), оказалось особенно полезным при фракционировании различных крупных мультибелковых комплексов 14-17 лет. Сочетание рекомбинантного архей производства протеосомного и неденатурирующем СТР стала мощным подходом в dissectinг Протеасома сборки 9,11,12,18. Тем не менее, обычный метод , с помощью которого применяется этот подход (т.е.. С помощью рекомбинантного соэкспрессии альфа и бета субъединиц) имеет существенный недостаток. Реакции Сборочные кооперативное и сильно зависит от концентрации 3. Учитывая , что концентрация белка внутри клеток очень высока 19, из - за эффектов исключенного объема, сборочные реакции протекают быстро в естественных условиях. Следовательно, можно пропустить важные промежуточные сборки, когда а и р субъединиц коэкспрессируются.

Здесь мы приводим доводы в пользу комбинированного подхода в изучении сборки протеасомы с использованием рекомбинантных архейных протеосом субъединиц. При таком подходе используются оба соэкспрессии и лизат методы смешивания. Первый позволяет быстрый анализ сборки, поскольку коэкспрессия является менее трудоемким. Последнее зависит от отдельного выражения а и р субъединиц с последующим перемешиванием. Хоть это requiРез немного больше усилий, чем соэкспрессии, это больше, чем компенсируется способностью обнаруживать промежуточные продукты, которые пропущены во время соэкспрессии. Вместе эти два метода могут дать более полную картину сборки протеасомы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Бактериальный Expression.

Примечание: Плазмиды экспрессии , использованные в этом исследовании , приведены в таблице 1. Решения, средства массовой информации и буферы , используемые в данном исследовании , приведены в Таблице 2. Клонирование генов архейных Протеасома субъединиц и генерирование экспрессионных плазмид описаны в другом месте 18,20. Вкратце, плазмиды для рекомбинантного соэкспрессии субъединиц используют бицистронную стратегию оперона , которая помогает в получении сопоставимых уровней экспрессии отдельных субъединиц 18,20. Параметры экспрессии, перечисленные ниже, были определены эмпирически оптимальным для субъединиц протеасом в данном исследовании. Может возникнуть необходимость оптимизации экспрессии для других протеасом мутантов, для протеасом из других видов архей, или для других рекомбинантных белковых комплексов (обсуждение см).

  1. Transform выражение плазмида интерес к химически компетентной Е. coli BL21 (DE3) клетки.
  2. Добавьте 1 - 2 мкл плазмиды (как правило, 50 - 100 нг) в аликвоты клеток DE3, которые были только что размораживали на льду, и продолжают инкубировать на льду в течение 20 мин.
  3. Тепловой шок клетки при 42 ° С в течение 45 с и возвратная трубка на льду в течение 2 мин additionl.
  4. Добавить 1 мл LB среды, и инкубируют при 37 ° C при встряхивании (150 оборотов в минуту) в течение 1 ч.
  5. Spread 100 - 200 мкл трансформационной смеси на LB-кан пластин (пластин, содержащих твердые носители LB, дополненных канамицину (все плазмиды, используемые в данном исследовании сопротивления кодируют к этому антибиотику)). Инкубируйте пластин при 37 ºC O / N.
  6. На следующее утро, прививают одну колонию от LB-кан пластины в 3 мл жидкой LB-кан сред в стеклянной трубке культуры. Инкубировать при 37 ° С при встряхивании (150 оборотов в минуту) в течение примерно 2,5 - 3 ч, или наблюдается до мутности.
  7. Измерьте оптическую плотность культуры при 600 нм (OD 600) в спектрофотометре. Развести культ клетокЮр с соответствующим количеством предварительно нагретые LB-КАН сред на OD 600 0,4 в конечном объеме 6 мл. Резюме встряхивании при 37 ° С в течение 40 мин.
  8. Индуцируют экспрессию белка в жидких культурах путем добавления IPTG из исходного раствора до конечной концентрации 1 мМ. Инкубируют при 37 ° С при встряхивании (150 оборотов в минуту) в течение примерно 6 - 7 ч.
  9. Урожай бактериальных клеточных культур во всей их полноте в 1,5 мл микропробирок.
  10. Добавить 1,5 мл культуры в микроцентрифужных трубки. Центрифуга при 10000 х г в течение 1 мин.
  11. Жидкость над осадком сливают и добавляют еще 1,5 мл той же культуры, к осадку. Центрифуга при 10000 х г в течение 1 мин.
  12. Повторите шаг 1.11 до всей культуры собирают в пробирку микроцентрифужных.
  13. Хранить индуцированные гранулы при температуре -80 & deg; С до лизиса.

2. Бактериальные лизис и лизат Смешивание.

Заметка: (т.е. он проверяет , что выражалось белок и растворимый). Таким образом, мы настоятельно рекомендуем включать анализ TSP первоначально. После того, как оптимальный протокол был достигнут для конкретной комбинации субъединиц, анализ ТСП не является обязательным, поэтому она описывается как факультативный ниже.

  1. Лизис бактериальных клеток и получения растворимых фракций.
    1. Разморозить индуцированный осадок клеток на льду в течение 5 мин. Ресуспендируют осадок в 600 мкл буфера для лизиса.
    2. IncУбате суспензии при 30 ° С при встряхивании (150 оборотов в минуту) в течение 30 мин для генерации общего сырого лизата.
      Примечание: Следующий шаг и подраздел , который следует не являются обязательными.
    3. Удалите два 25 мкл аликвоты из общего сырого лизата в отдельные 1,5 мл микропробирок и проводят анализ TSP следующим образом.
      1. К одному из двух 25 аликвот мкл, добавьте 5X SDS буфера для образцов до конечной концентрации 1х. Этикетка трубки с "T" для "общего сырого лизата".
      2. Выдержите "T" образца при температуре 100 ° С в течение 5 мин, чтобы полностью денатурации белков.
      3. В то же время, возьмите второй 25 мкл аликвоты и центрифугируйте при 10000 × г в течение 10 мин. Осторожно удалите супернатант, не нарушая крошечные гранулы, и перенести его на новый 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавьте эту новую трубу "S" для "растворимой фракции".
      4. Для крошечных гранул, оставшихся бэхий в предыдущем шаге, добавьте 25 мкл буфера для лизиса и вихря ресуспендирования. Добавьте эту трубку "P" для "гранулированной фракции".
      5. Добавить 6 мкл 5X SDS буфера для образцов в "S" и "P" трубок и инкубировать при температуре 100 ° С, как описано выше.
        Примечание: Если образцы TSP не будут использоваться в тот же день , чтобы анализировать экспрессию, они могут быть заморожены при -20 ° С до тех пор , пока это необходимо. После размораживания, они должны быть повторно инкубировать при температуре 100 ° С, как описано выше, непосредственно перед загрузкой на стандартном геле SDS-PAGE на 12% и / или 15%.
    4. В то время как анализ ТСП осуществляется, центрифуга остальные 550 мкл общего сырого лизата (или весь 600 мкл общего сырого лизата , если анализ ТСП не выполняется) при 10000 х г в течение 10 мин. Собирают супернатант в свежую 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Это растворимый лизат, который будет использоваться для очистки.
  2. Лизат смешивание.
    1. Проведение лизиса, как описано в пунктах 2.1.1 и 2.1.2 выше.
    2. Смешайте 600 мкл общего сырого лизата из бактерий, экспрессирующих желаемый -субъединицы с 600 мкл общего сырого лизата от бактерий, экспрессирующих желаемый -субъединицу. Инкубировать при 37 ° С с медленным встряхивания в течение 30 мин.
      Примечание: Это может быть необходимо для оптимизации времени инкубации для достижения максимальной сборки во время лизата смешивания (см Обсуждение). Время и температура , представленные здесь , являются оптимальными для рекомбинантных белков в данном исследовании и были определены в другом месте 18.
    3. Центрифуга смешанный лизат при 10000 х г в течение 10 мин , чтобы отделить растворимый материал от нерастворимых гранул. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Используйте этот смешанный растворимый лизат для очистки белков.

3. Белок Очистка с помощью иммобилизованного Cobalt Affinity смолы(ИКАР).

  1. Равновесие смолы.
    1. Тщательно ресуспендирования смолы путем переворачивания бутылки и переносят по 50 мкл суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Центрифуга при 700 х г в течение 2 мин до гранул смолы. Тщательно аспирата супернатант.
      Примечание: Мы выполняем пипеток стремление с помощью синий кончик 1 мл пипетки , чтобы удалить большую часть жидкости. Белый 2 мкл наконечник используется для точного контроля удаления оставшейся надосадочной жидкости, оставляя очень тонкий слой жидкости, покрывающей бусинки.
    2. Добавить 1 мл буфера A. Аккуратно ресуспендирования смолы и центрифуге при 700 × г в течение 2 мин , чтобы осадить полимер. Тщательно аспирата супернатант и повторите этот шаг мыть еще один раз.
  2. Применяют растворимый лизат, полученный ранее в разделе 2.1 или 2.2 к уравновешенной смолы. Инкубируйте пробирку с легким вращением при 4 ° С в течение 60 мин. Центрифуга трубки при 700 × г </ EM> в течение 5 мин и тщательно аспирата супернатант.
  3. Промыть смолу следующим образом для удаления неспецифически связанных белков.
    1. Ресуспендируют смолы с 1 мл буфера А и инкубировать при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 10 мин. Отцентрифугировать пробирку при 700 х г в течение 5 мин и тщательно аспирата супернатант. Повторите этот шаг мыть еще один раз.
    2. Ресуспендируют смолы с 1 мл буфера В (буфер А с 5 мМ имидазола) и инкубировать при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 5 мин. Отцентрифугировать пробирку при 700 х г в течение 5 мин и тщательно аспирата супернатант. Повторите этот шаг мыть еще один раз.
    3. Ресуспендируют смолы с 1 мл буфера С (буфер А с 10 мМ имидазола) и инкубировать при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 5 мин. Отцентрифугировать пробирку при 700 х г в течение 5 мин и тщательно аспирата супернатант.
  4. Элюции белка путем добавления 400 мкл буфера E (буфер А с 200 мМ имидазола) то смолы. Выдержите при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 5 мин. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин.
  5. Перенести супернатант, содержащий очищенный белок в новый 1,5 мл центрифужную пробирку.
  6. Обессоливания очищенного белка путем последовательного центрифугирования следующим образом.
    1. К 400 мкл очищенного белка, вносят по 100 мкл буфера А (это снижает концентрацию имидазолом от 200 мМ до 160 мМ). Применение очищенного белка до 0,5 мл ultracentrifugal фильтров с 10 кДа молекулярной массой отсечением. Центрифуга при 14000 х г в течение 5 мин.
    2. Отбросьте фильтрат и добавляют 400 мкл буфера А, чтобы разбавить ретентат и центрифуга снова. Продолжить циклы центрифугирования / разбавления до концентрации имидазола не упадет ниже 4 мм. В качестве примера, если каждый центрифугирование концентрирует 500 мкл до ~ 70 мкл (или приблизительно в 7 раз), а затем два цикла уменьшит начальную 160 мМ имидазола концентрации (7 × 7 = 49-кратное) к проверoximately 3,3 мМ.
    3. Измерение концентрации белка в обессоленной образце с использованием анализа ВСА 21.
      Примечание: обессоливания требуется для снижения уровня имидазола ниже предела допуска для анализа BCA, как описано в инструкции изготовителя. Наша лаборатория предпочитает анализ BCA, поскольку он чувствителен, имеет большой динамический диапазон, и проявляет гораздо меньше вариаций белка к белку. Тем не менее, другие методы определения концентрации белка может быть заменен на анализе BCA. Ключ заключается в том, чтобы быть в курсе преимуществ и ограничений каждого метода.
  7. Добавить 5X нативный буфера для образцов до конечной концентрации 1х и перейти к электрофорезу. В качестве альтернативы, образцы хранить при температуре -20 ° С для последующего анализа.

4. нативных полиакриламидном геле (PAGE).

Внимание: Неполимеризованные акриламид является нейротоксин. Необходимо использовать соответствующую защитную Хеар.

  1. Подготовьте нативных гель PAGE следующим образом.
    1. Подготовка геля кассеты для литья с использованием чистых стеклянных пластин и литья стенд. Поместите градиентное мейкера на вершине небольшой магнитной мешалкой и поместить крошечные мешалку в каждую камеру.
    2. С помощью 40% (вес / объем) акриламид и 2% (вес / объем) бисакриламида маточные растворы, готовят 5% и 10% (вес / объем) акриламид гель растворов в нативной разрешающего буфере. Убедитесь, что отношение общего количества акриламида к бис-акриламида составляет 37.5: 1. Холод на льду перед заливкой.
      Примечание: Система нативных ПААГ используется здесь, по существу , идентична системе SDS-PAGE Laemmli, с ДСН опущена 22.
    3. Добавить персульфат аммония (от 10% (вес / об) маточного раствора, полученного в воде) к акриламид растворов для инициирования полимеризации. Конечная концентрация персульфат аммония составляет 0,1% (вес / объем).
    4. Налить акриламидов растворы в двух камерах градиентной мейкера. С выпускной трубки, вставленной бetween пластины геля кассеты, активировать магнитную мешалку и открыть Градиент мейкера клапанов. Залить 5 - 10% геля нативных градиента.
    5. После того, как вылили, накладывать гель с тонким слоем изопропанола и позволяют гель полимеризуется в течение 30 мин. За это время приготовить свежий 5% раствор акриламида гель в родном разрешающего буфере. После того, как наборы геля, слейте изопропанолом и прополоскать верхнюю часть геля с деионизированной водой из бутылки шприца.
    6. 5% раствор геля, полученного выше, добавляют персульфат аммония (в точности, как описано в 4.1.3) и вылить поверх полимеризованного геля до тех пор, стеклянные пластины не заполнятся. Вставьте гель гребень. Дайте гель накладным полимеризоваться в течение еще 30 мин.
    7. После того, как гель полимеризуется, собирают гель кассету в аппарате для электрофореза. В качестве альтернативы, хранить гель при 4 ° С, не обернутый в увлажненными бумажными полотенцами и полиэтиленовую пленку до готовности к использованию.
  2. После того, как неденатурирующем гель PAGE собран в электоприводtrophoresis аппарат, наполните бак 1X родной проточной буфера, приготовленного из свежей 10X родной пробег буферного запаса.
  3. Нагрузка 10 мкг очищенного белка, полученный в конце раздела 3, в каждую лунку при помощи стеклянного шприца.
  4. Нагрузка 2 мкл высокого веса родного стандарта молекулярного белка (разведенного в 1X родном рабочем буфере) в одну из лунок.
  5. Выполнить гель при 55 В и 4 ° С, пока фронт красителя не стекает гель (приблизительно 4 - 4,5 ч).
  6. В дополнение к гелю неденатурирующем, анализируют аликвоты очищенного белка с помощью стандартных SDS-PAGE 22.
    1. Смешайте Аликвоты (10 мкг) очищенных образцов белков, полученных в конце раздела 3, с буфером 5X SDS-образца до конечной концентрации 1Х.
    2. Инкубируют при температуре 100 ° С в течение 5 мин и нагрузки на стандартные 12% и / или 15% SDS-PAGE гели 22.
    3. Запуск на 80В в течение 20 мин, а затем при 120 V, пока фронт красителя не стекает гель (это примерно надстройкаitional 75 мин в течение 12% геле, и 120 мин в течение 15% геле).

5. Визуализация активности и белка Окрашивание.

  1. После электрофореза тщательно отдельные стеклянные пластины и передать гель нативных на подносе гель, содержащий 50 мл деионизированной воды. Промойте гель с нежным качалки в течение 5 мин. Откажитесь воду и повторить этот шаг мыть три раза.
  2. Выполните подложки наложения анализ следующим образом.
    1. Добавить 1 мл буфера, содержащего разработку флуорогенного пептидного субстрата SUC-LLVY-AMC и равномерно распределяли по гелю. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
      Примечание: стеклянный стержень или гель пусковым (небольшой клин из пластика , используемый для разделения стеклянных пластин) могут быть использованы для распределения жидкости над гелем.
    2. Тщательно передачи гель на УФ-просвечивания системы гель-документирования и наблюдения флуоресценции из-за скола пептидного субстрата. Запись изображения. Аккуратно перенести гель баск к лотку геля.
    3. Ополосните гель дважды с 50 мл деионизированной воды в течение 5 мин при осторожном покачиванием.
    4. Пятно гель с 10 мл коллоидного реагента Кумасси пятно в течение 60 мин при осторожном покачиванием. Destain гель с 50 мл воды до фона становится ясно. Этот шаг окрашивание относится к стандартным SDS-PAGE, гелей, а также.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протеасома сборки (Рисунок 1) начинается , когда альфа - субъединицы объединяются , чтобы сформировать кольца 9. Это можно проиллюстрировать , когда альфа - субъединицы от archaeon Methanococcus maripaludis S2 выражены в E.coli , как C-терминально гексагистидиновый помечено (его-меченый) производные (таблица 1). Когда рекомбинантный α-его белок был очищен с помощью ICAR и анализировали с помощью неденатурирующем ПААГ, две полосы наблюдались (рис 2А, дорожка 1). Ранее мы показали , что они соответствуют одинарной колец a (SR) и двойными альфа-Rings (DR) 18. DR является тупиковый вид , который не является продуктивным для последующей сборки 9,18.

Когда его альфа-субъединицы были коэкспрессируются с субъединиц, представляющий обычный метод, с помощью которого сборка рекомбинантных архейных протеасомах анализируют, наблюдали роман видов миграции у стенда 670 кД размераARD (Фигура 2А, дорожка 3). Этот вид был протеолитически активным (Фигура 2В, дорожка 3) и содержит только полностью зрелые субъединиц (mβ) , чьи пропептиды были удалены (рисунок 2С, дорожка 3). Этот вид является полностью зрелым CP. В этом примере также содержит некоторые SR видов, которые, как ожидалось, так как SR является известным промежуточным сборки, но ни один из видов DR. Отсутствие DR , когда его альфа-и бета - субъединицы коэкспрессируются позволяет предположить , что правильная сборка происходит достаточно быстро , таким образом, что введение субъединиц был в состоянии вытеснять непроизводственного образование DR (для более детального анализа см 18).

Чтобы продемонстрировать ограниченность метода соэкспрессии, и доводы в пользу полезности комбинированного подхода, α-его были выражены и субъединиц отдельно в E.coli. После лизиса, растворимые фракции смешивали и белки очищали с помощью ICAR доАнализ с помощью неденатурирующем PAGE. Полностью функциональные протеасомы также генерироваться с помощью лизата смешивания подхода (рис 2А и 2В, дорожка 2), и СХ видов также наблюдалась , как и ожидалось. Повторное появление вида DR в лизате смешивания образца указывает на то, что когда-то образуется, субъединиц не способны обратимо разобрать его; это подчеркивает тупиковый характер DR. Интересно, что новый вид также появился в лизата смешивания образца, мигрирующие чуть ниже CP (называется "половина"). Недавно мы показали , что этот вид соответствует половинной протеасоме (а 7 & beta ; 7) 18. Чтобы проиллюстрировать это здесь, была принята на работу β-субъединицы мутант (R166W). Эта мутация разрушает кольцо взаимодействия β-бета, что приводит к нарушению наполовину протеасомы димеризации 18. С пол-протеасомы являются непосредственными предшественниками CP, мутация R166W должно привести как к накоплению сводными Протеасомы апснижение да в формировании СР. Когда лизат смешивания с альфа-его и р (R166W) субъединиц проводили, наблюдались более низкие уровни СР и повышенные уровни "половинки" видов (рис 2А, дорожка 4). Это согласуется с предшественником отношения-продукта для этих двух групп, и подтверждает идентичность "половинки" вида, как пол-протеасомы. Немного быстрее миграция половинной протеасоме в мутантной образце (дорожка 4 по сравнению с дорожка 2), вероятно, из-за мутации R166W изменяя отношение массы к заряду в бета-субъединицы.

Способность визуализировать полупериод протеасомы во время перемешивания лизата обусловлено, главным образом, до значительно более низких концентраций белка в лизате, по сравнению с высокой концентрацией белка внутри клеток. Более низкие концентрации приводят к снижению эффективности (т.е. более медленного) сборки, что позволяет промежуточные продукты, чтобы стать более заселена и , таким образом , обнаруживается. К тому же внешний вид половинной протеасомы, дополнительное наблюдение подчеркивает уменьшенную эффективность сборки во время лизата смешивания: необработанный субъединиц, которые сохраняют свои пропептиды, становятся обнаружены (proβ). Поскольку обработка пропептид не происходит до половины Протеасомы димеризуются, появление незрелых формы proβ коррелирует с уровнем накопления наполовину протеосомного (сравните рис 2С, полоса 3 против 2 полосы движения по сравнению полоса 4). В случае мутантов R166W, отказ обработки пропептида во время перемешивания лизата абсолютна, даже если небольшое количество CP делает форму. Это происходит потому , что обработка пропептида не только требует наполовину протеасом димеризации, но и правильно сформированный β-β кольцо интерфейс 23 , который мутация R166W не дает. Более подробный рассказ о соэкспрессии против лизата смешения, как она относится к рекомбинантной протеасом сборки, можно найти здесь 18.

1 цифра "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Упрощенная схема ядра частиц (СР) Ассамблеи.
Альфа-субъединицы могут собираться в одну альфа-кольца первого (SR), который служит в качестве матрицы для включения субъединиц. Это приводит к образованию половинного Протеасома промежуточного (половина), которая быстро димеризуется. Одновременно с димеризации, то β субъединиц пропептиды (не показаны) аутокаталитически удалены порождая полностью функциональной центральной частицей (СР). Двойные a-кольца (DR) могут возникать из СР и не компетентны для сборки в CP. Их образование представляет собой непродуктивный путь сборки (пунктирная стрелка) в отличие от производительных сборочных событий (сплошные стрелки). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2 Рисунок 2: Комбинированный подход для опробования протеасоме Ассамблеи.
Коэкспрессия (С) и лизат смешивания (L) , были использованы для изучения сборки рекомбинантных протеасом из archaeon M. maripaludis. Белки были очищены с помощью иммобилизованного Cobalt аффинном сорбенте (ICAR). (А, В) Очищенные белки (10 мкг) наносили на неденатурированных 5 - 10% градиентном геле. После электрофореза пептидазы активность визуализировали путем накладывания геля с буферным раствором , содержащим флуорогенный пептидный субстрат Suc-LLVY-АМС (В) до окрашивания геля с коллоидным Кумасси реагентом пятно (A). Черные размерные стрелки обозначают позиции центральной частицы, собранные 20S (СР), наполовину Протеасома промежуточное соединение (половина), двойной α-кольца (DR) и одного альфа-кольца (SR). Миграция нескольких стандартов молекулярных размеров (в кДа) указывается справа. (С) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

плазмида Генотип Источник
AKB191 pET42 Psma-его Kusmierczyk и др., (2011)
AKB464 pET42 Psma-его psmB Kusmierczyk и др., (2011)
AKB946 pET42 psmB Panfair и др., (2015)
AKB952 pET42 psmB (R166W) Panfair и др., (2015)

Таблица 1: Бактериальные Плазмиды , используемые в данном исследовании. Psma является архейного ген α-субъединицы и psmB является архейного гена β-субъединицы.

Буфер A 50 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2. Буферы В, С и Е, являются производными буфера А, содержащего имидазола. Полезно добавить имидазолом из 2 М маточного, полученного в воде и хранили в темноте.
Родные решения буфера 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 0,1% (об / об) тетраметил-этилендиамин (TEMED) и 0,1% (вес / объем) Аммоний Perulfate (АПС). не приготавливались не более чем за час до гель должен быть полимеризуется и держится на льду. При приготовлении акриламид гелевых растворов в родном разрешающего буфере, полезно добавить Трис-HCl с 4-кратным запаса (1,5 М Трис-HCl, рН 8,8). APS добавляют непосредственно перед началом полимеризации.
Родной пробег буфера 10X складе 250 мМ Трис, 1,92 М глицин, не регулировать рН.
5X родной буфер выборки 0,5 М Трис-HCl, рН 8,8, 50% (об / об) глицерина, следы бромофенола голубого. Следы относится к очень небольшое количество, как правило, несколько зерен, перемещаемый по шпателем.
5X SDS-буфера выборок 0,3 М Трис-HCl, рН 6,8, 600 мМ дитиотреитола (ДТТ), 10% (вес / объем) SDS, 50% (об / об) глицерина и следы бромофенола голубого. Следы относится к очень небольшое количество, как правило, несколько зерен, перемещаемый по шпателем,
Разработка буфера 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ АТФ, 50 мМ Suc-LLVY-АМС. Suc-LLVY-АМС представляет собой флуорогенный пептидный субстрат используется для анализа активности протеасом.

Таблица 2: Решения, средства массовой информации и буферов , используемых в данном исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Показано преимущество комбинированного подхода к анализу сборки протеасомы путем неденатурирующем PAGE с использованием рекомбинантных архейных протеасомы. Обычный метод 9,11 бактериального соэкспрессии субъединиц протеасом позволяет для экспресс - анализа , но не может выявить ключевые промежуточные сборки. Мы предлагаем объединять коэкспрессия лизатом смешивания разработать более широкую картину сборочных событий.

Преимущество такого комбинированного подхода состоит в том, что, несмотря на который надо рассматривать отдельно экспрессию & alpha; и & beta; субъединиц для лизата смешивания, то она по-прежнему относительно рабочей среды. Результаты могут также быть полуколичественный если один обеспечивает сравнимые и последовательные уровни экспрессии отдельных белков. С этой целью, мы рекомендуем проводить обычную оптимизацию экспрессии рекомбинантного белка для определения условий, которые позволяют сопоставимые уровни белков, выраженных предшествующих лизата смешивания. Оптимизация может включать в себя изменения индукции тиме, индукционная температура, оптическая плотность при индукции, бактериальный экспрессирующий штамм, и так далее, до тех пор, желательные уровни растворимого белка пока не будут достигнуты. Это особенно важно при сравнении WT и мутантных вариантов белка, так как иногда мутант может демонстрировать сопоставимые уровни экспрессии, но снижению растворимости. Мы также подчеркиваем важность определения концентрации протеина в ICAR очищенных образцов до загрузки нативных PAGE. Даже при оптимизации экспрессии в месте, и с лучшей тщательность, чтобы гарантировать, что параллельные пробы обрабатывали с проведением стадий очистки таким же образом, дисперсия может все еще быть непреднамеренно введен. Измерение концентрации гарантирует, что одинаковое количество общего белка загружают в лунку с образцом. Это делает переулка к переулку сравнение интенсивностей полос для данного мигрирующих видов более значимым.

Если сопоставимые и последовательные уровни экспрессии белка не может быть достигнуто за Lysáт.е смешивание, всегда можно очистить все компоненты заранее и проводить эксперименты с смешивания чистых белков. Это имеет то преимущество, что позволяет более точные определения белка и, таким образом, делает подход количественный. Тем не менее, недостаток полной очистки является то , что этот процесс становится значительно более трудоемким, что может препятствовать быстрый анализ множественных мутантов одновременно 18. Окончательный нюанс стоит отметить, что иногда отдельные выражения а и р субъединиц может оказаться невозможным. Это может произойти , если мутация приводит к субъединицу , нерастворима в E.coli при экспрессии сам по себе , но позволяет растворимостью быть вновь , когда мутант выражается с его партнером по связыванию. Если это произойдет, то будет ограничивать анализ для соэкспрессии только. Тем не менее, это один нюанс , который может возникнуть при экспрессии рекомбинантного белка в целом, и не является специфическим для архей субъединиц протеасом 24,25.

Мы выбрали генкции его-маркированные производные наших протеасом белков из-за легкости очистки и доступности по цене от ИКАР смолы. Другие теги эпитоп возможны, в том числе для очистки на основе антител, и мы успешно экспрессируют и очищают Flag-меченый версии наших субъединиц протеасом (не показан). Однако, если требуется очистка до гомогенности (или увеличения масштаба производства), то его-меченые версии обеспечивают самые быстрые и экономически эффективные способы сделать это.

Это данность , что результаты , полученные с рекомбинантных белков, будь они архейных или эукариотические белки , продуцируемые бактериями, приобретут более глубокое значение , когда следует с наблюдениями в естественных условиях. Тем не менее, в естественных условиях подход не всегда может быть непосредственно доступны экспериментально. Это особенно верно, когда предметом исследования является большой, мультисубъединичный комплекс, такой как протеасомы. Рекомбинантный белок подходы обеспечивают важную точку запуска для грядущих событийповторно экспериментов. В случае протеасомы, спаривания рекомбинантного производства архейного протеосом с неденатурирующем СТР будет по- прежнему очень эффективны в выяснении ключевые особенности сборки протеасомы, которые разделены между архей и эукариот видов 9,11,12,18. Такой подход может быть полезен для изучения сборки других крупных мультибелковых комплексов, а также. В последнее время мы использовали эту стратегию , чтобы продемонстрировать , что архейных протеасомы может собрать более чем через один путь, и что а-кольца не являются облигатными промежуточными продуктами во время сборки , что они думали , чтобы быть 18. Остается определить, если то же самое верно и для эукариотических протеасомах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Исследовательского фонды поддержки Грант (RSFG) из Университета Индианы-Университета Пердью, Индианаполис, и частично награду от Американской ассоциации сердца 14GRNT20390154, чтобы ARK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide (40%) solution Biorad 1610104 Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear
Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters EMDMillipore UFC501024
Ammonium Persulfate Sigma A3678
ATP Sigma A7699
BCA assay kit Pierce 23225
Bisacrylamide (2%) solution Biorad 1610142
Bromophenol blue Sigma B8026
DNaseI Sigma DN25
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher BP172
E. coli BL21 competent cells EMD Millipore 69450
GelCode Blue Thermo Fisher 24592 Colloidal coomassie stain reagent for gels
Gel doc EZ system Biorad 1708270 Gel documentation system
Gel releasers Biorad 1653320 Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.
Glass rod Thermo Fisher 11-380B
Glycerol Sigma 49767
Glycine Thermo Fisher BP3865
Hamilton syringe Thermo Fisher 14-813-38 Glass syringe for loading gels
HEPES US Biologicals H2010
HMW Native calibration kit GE Healthcare 170445-01 High molecular weight protein standards
Hoefer SG30 Thermo Fisher 03-500-277 Gradient maker
Imidazole US Biologicals 280671
IPTG US Biologicals I8500 For induction of protein expression
Isopropanol Thermo Fisher BP26181
Kanamycin sulfate US Biologicals K0010
Lysozyme Sigma L6876
MgCl2 Fluka analytical 630680
Mini Protean Tetra Cell Biorad 1658002EDU Gel electrophoresis apparatus
NaCl Thermo Fisher S640-3
NaOH Thermo Fisher S318-1
Pefabloc SC Roche 11429876001 Protease inhibitor
pET42 EMD Millipore 70562 Expression plasmid
Precision plus all blue standard Biorad 1610373 Molecular protein standard for SDS-PAGE
Quickchange mutagenesis kit Agilent technologies 200521
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Thermo Fisher BP166
Suc-LLVY-AMC Enzo lifesciences BML P802-0005 Fluorogenic substrate
Talon Metal Affinity Resin Clontech 635502 Immobilized Cobalt Affinity Resin
TEMED Sigma T7024
Tris US Biologicals T8600
Triton-X100 Sigma 93426
Tryptone Bacto BD 211699
UV sample tray Biorad 1708271 For UV imaging of gels
Yeast extract Bacto BD 212720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

Tags

Биохимия выпуск 118 Протеасома сборка белка археи рекомбинантный белок не денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле,
Изучение протеасоме Ассамблею с рекомбинантным архейных Протеасомы и нативных ПААГ: Случай для комбинированного подхода
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Panfair, D., Kusmierczyk, A. R.… More

Panfair, D., Kusmierczyk, A. R. Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE: The Case for a Combined Approach. J. Vis. Exp. (118), e54860, doi:10.3791/54860 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter