Protocol
NOTA: Todos os protocolos de estudo com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Seul Bundang National University Hospital (BA1308-134 / 072-01).
1. Síntese de ácido hialurônico-ceramida (HACE)
- Solubiliza-se 12,21 mmol de ácido hialurónico (HA) de oligómero e 9,77 mmol de tetra-n-butilamónio hidróxido (TBA) em 60 ml de água duplamente destilada (ADD). Agita-se durante 30 min.
- Para sintetizar o ligante DS-Y30, dissolve-se 8,59 mmol de ceramida DS-Y30 e 9,45 mmol de trietilamina em 25 ml de tetra-hidrofurano (THF). Misturar com 8,59 mmol de cloreto de 4-clorometilbenzoilo em THF. Agita-se durante 6 h a 60 ° C.
- Dissolve-se a 8,10 mmol sintetizado de HA-TBA e 0,41 mmol de ligante DS-Y30 em uma mistura de THF e acetonitrilo (4: 1, v / v). Agita-se durante 5 h a 40 ° C.
- Remover as impurezas por filtração com um filtro de agente, e eliminar o solvente orgânico por evaporação sob vácuo. Purifica-se o produto usando uma membrana de diálise (peso molecular de corte: 3,5 kDa) e liofilizar.
2. Preparação das nanopartículas
- Dissolve-se 1 mg de HB e 1 mg de paclitaxel em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) e misturam-se com 0,5 ml de DDW por vortex para mistura durante 5 min. Em seguida, solubilizar HACE nessa mistura por vórtice de mistura durante mais 5 min.
- Para eliminar o solvente, aquece-se a 70 ° C durante 4 horas sob uma corrente suave de azoto gasoso.
- Ressuspender o filme composto por HACE, HB, e paclitaxel com 1 ml de DDW. Filtrar com um filtro de seringa (0,45 um de tamanho de poro) para remover droga não encapsulados.
3. A fototoxicidade in vitro
- A absorção de nanopartículas em linhas de células de câncer de pulmão
- Prepare (v / v) de soro de meio RPMI-1640 a 10% contendo meio de bovino fetal e 1% (w / v) de penicilina-estreptomicina.
- Semente células A549 em placas de cultura celular de 24 poços a uma densidade de 1 x 10 5 células / poço (triplicados para cadagrupo). Incubar durante 24 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 e 95% de ar.
- Após a fixação das células, remover o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Dissolve-se as nanopartículas em PBS para uma concentração final de 2 jiM / ml HB. Em seguida, incubar as células com 1 ml de PBS, o NPS vazios, HB-NPs, ou HB-P-NPs em cada poço durante 4 horas no escuro.
- Remove toda a solução e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Adicionar meio de cultura fresco.
- ensaio de viabilidade celular
- Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Usar óculos de segurança do laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm2), no escuro durante vários períodos de tempo: 0, 5, 10, 20, 30, e 40 seg (0, 2, 4 , 8, 12, e 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro.
- Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 10 ul de solução de medição da citotoxicidade de cada poço. Incubar no escuro durante 2 horas.
- Medir a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
- A análise microscópica
- Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Use óculos de segurança a laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) no escuro, durante 0, 20 ou 40 segundos (0, 8, ou 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro.
- Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Adicionar 50? L de anexina V-FITC e 50 ul de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1,5 ug / ml). Agitar suavemente a placa e incubar-lo por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
NOTA: Use anexina V-FITC a partir do kit de microscópio de fluorescência. - Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Manter as células em PBS fresco. Identificar as células em apoptose utilizando um microscópio óptico com ampliação de 100X.
- separação de células activadas por fluorescência (FACS)
- Colocar a placa de cultura celular sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra TFD ao poço). Use óculos de segurança a laser e iluminar as células com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) para 0, 20 ou 40 segundos (0, 8, ou 16 J / cm 2). Em seguida, as células incubar durante 24 horas no escuro.
- Aspirar o meio e lava-se as células por adição de 1 ml de PBS frio. Repetir o passo de lavagem mais uma vez.
- Ressuspender as células em 1 ml de 1 × tampão de ligação (diluído 1 parte de tampão de ligação 10x; 0,1 M de Hepes / NaOH (pH 7,4), NaCl 1,4 M, e 25 mM de CaCl 2 a 9 partes de água destilada) e transferência de 100 uL da solução de amostra para a 5 mltubo de cultura.
- Adicionar 5 uL de anexina V-FITC e 5 ul de iodeto de propídio (PI). Suavemente vortex do tubo e incubar durante 15 min à temperatura ambiente (TA) no escuro. Adicionar 400 mL de 1 × tampão de ligação.
NOTA: Use anexina V-FITC e PI a partir do kit microscópio de fluorescência. - Identificar as células apoptóticas por SCAF usando 14. As linhas de laser de excitação PI e anexina V-FITC são 488 nm e 635 nm, respectivamente. Medir a emissão de fluorescência de PI e anexina V-FITC a 610 ± 20 nm e 660 ± 20 nm, respectivamente. Recolher as células adquiridas no citômetro de fluxo por 10.000 eventos.
4. eficácia anticancerígena in vivo In em ratos portadores de tumores
- modelo do rato induzida por câncer de pulmão
- Prepare 1 × 10 6 células A549 em 0,1 ml de meio RPMI-1640; mantê-lo em gelo.
- Anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências. - Injectar as células subcutaneamente nos flancos de ratinhos BALB restantes ratinhos nu / C macho (6 - 7 semanas de idade, 20-22 g).
- Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola.
NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. Mantenha os ratos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos (SPF). - Medir o tamanho do tumor com compassos de calibre de cada dia. Calcular o volume do tumor (mm 3) como (comprimento x largura 2) / 2. Quando o tamanho do tumor atingir cerca de 200 mm 3 em volume, a iniciar a experiência.
- estudo de eficácia Anticancer
- Aleatoriamente dividir os ratos em 4 grupos (n = 10 para cada grupo).
- Anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências. - Dissolve-se as nanopartículas em PBS para uma concentração final de 2 mg / ml HB. Injectar PBS, livre HB, HB-NPs, ou HB-P-PN através da veia caudal (2 mg / kg como HB) duas vezes nos dias 0 e 7.
- Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola.
NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmenterecuperado. Mantenha as gaiolas escuro e em condições SPF específicos. - 24 h após cada injecção, anestesiar os ratos com uma injecção IP de xilazina e uma uma mistura de tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Confirmar anesthetization adequada por beliscar suavemente uma pequena dobra de pele mouse. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
NOTA: Se não se observa qualquer movimento, o animal é anestesiado suficientemente para iniciar as experiências. - Colocar o sítio do tumor sob a fibra PDT (com 1 cm de distância a partir da fibra de PDT para o tumor). Use óculos de segurança laser, desligar o interruptor, e iluminar o tumor com um laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) para 500 segundos (200 J / cm 2) duas vezes nos dias 1 e 8.
- Mantenha observando os ratos até que eles começam a se mover ao redor da gaiola. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tem undergone cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Mantenha as gaiolas em condições SPF. Manter as gaiolas no escuro durante 24 horas após o tratamento a laser.
- Monitorizar visualmente o volume do tumor e as alterações no local do tumor a cada dia. Medir o tamanho do tumor com compassos de calibre, e calcular o volume como (comprimento x largura 2) / 2 (mm 3). Tirar fotos dos locais de tumor todos os dias para verificar se há alterações de superfície do tumor após PDT.
- No dia 16, sacrifica cinco ratinhos por grupo por anestesia terminal usando isoflurano.
- Com uma pinça e tesouras, corte a pele exterior e expor os tumores 15. Cuidadosamente colhê-las. Corrigi-los em formol 10%, incorporá-los em parafina e manchá-las com hematoxilina e eosina (H & E) para a análise histológica 16.
- Após 45 dias de monitoramento, sacrificar os ratinhos restantes pela anestesia terminal usando isoflurano.
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Representative Results
Nós preparamos tanto HB-NPs e HB-P-NPs com as técnicas acima mencionadas. Os diâmetros médios de HB-NPs e HB-P-NPs foram 220,9 ± 3,2 nm e 211,9 ± 1,6 nm, respectivamente.
A viabilidade celular das células A549 após 4 h de incubação com PBS, o NPS vazios, HB-PN, e HB-P-NPs seguido por irradiação de luz (0-16 J / cm 2) é mostrada na Figura 1. Sem luz, o grupo de tratamento HB-NP mostrou nenhuma citotoxicidade em tudo, enquanto que as células tratadas com HB-P-NP mostrou a viabilidade celular 81,28 ± 0,14%. Isto pode ser devido ao efeito anti-cancro de paclitaxel, que foi libertado a partir das nanopartículas. De acordo com a TFD, a viabilidade celular foi diminuída de acordo com o tempo de exposição à luz em ambos HB-NP e as células tratadas com HB-P-NP. As células tratadas com HB-P-NP mostraram aumento da fototoxicidade do que o grupo HB-NPs sob as mesmas condições de irradiação. Quando 16 J / cm 2 de irradiação foi indicado, apenas 7,52 ± 0,38% das células sobreviveram no grupo de tratamento HB-P-NP.
Os resultados consistentes foram visualizados com coloração de anexina V-FITC (Figura 2). As células em apoptose induzida por PDT foram coradas com anexina V-FITC, expressando fluorescência verde. O sinal de fluorescência verde mais forte foi detectada nas células tratadas com HB-P-NP sob as mesmas condições de irradiação.
Os estágios de células apoptóticas induzidas por PDT foram classificadas por citometria de fluxo. Fazendo duplo coloração com anexina V-FITC e PI, os primeiros células em apoptose (somente anexina V-FITC positivo), tarde apoptótica células (tanto anexina-V e PI positivo) e células necróticas (somente PI positiva) foram distinguidos. Sob as mesmas condições PDT, a porção de células apoptóticas tardias foi aumentada no grupo tratado com MP-P-NP (Figura 3).
"FO: manter-together.within-page =" 1 "> in vivo o crescimento tumoral em ratinhos portadores do tumor do pulmão após injecção intravenosa de PBS duas vezes, HB livre, HB-PN, e HB-P-NPs seguido de irradiação de luz é mostrado na Figura 4. as superfícies dos locais do tumor foram também examinados (Figura 5). os ratinhos tratados com HB-P-NP mostrou as reacções mais rápidas, incluindo hemorragia e necrose, e o crescimento mais lento de tumores. Além disso, a análise histológica confirmou a a maioria das células tumorais foram severamente danificadas no grupo de tratamento HB-P-NP (Figura 6).
Figura 1:. In vitro Fototoxicidade de células A549 As células A549 foram tratados com PBS, o NPS vazios, HB-NPs, ou HB-P-PN, e irradiação de luz foi determinada por 0, 5, 10, 20, 30, ou 40 seg (0, 2, 4, 8, 12, ou 16 J / cm 2). sob tele mesmo tempo de irradiação, o grupo de tratamento HB-P-NP apresentaram fototoxicidade mais elevado do que o grupo de tratamento HB-NP. Os valores são expressos em média ± desvio padrão (SD; n = 3). *** P <0,001, comparado com o grupo tratado com PBS. ## P <0,01, ### p <0,001, comparado com o grupo de tratamento HB-NP. Adaptado de Chang et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As células A549. A análise microscópica de células A549 apoptóticas foram tratados com PBS, HB-NPs ou HB-P-PN, e irradiação de luz foi determinada para 0, 2 ou 4 J / cm 2. A dupla mancha de DAPI (azul, primeira coluna) e anexina V-FITC (verde, segunda coluna) indicam núcleose células apoptóticas, respectivamente. As células-NP-tratadas com HB P mostrou sinais de fluorescência verde mais fortes do que as células tratadas com HB-NP sob as mesmas condições de irradiação, indicando uma fototoxicidade muito maior. Barra de escala = 200 mm, ampliação = 100X. Adaptado de Chang et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As células A549. Análise FACS de células A549 apoptóticas foram tratados com PBS, HB-NPs, ou HB-P-PN, e irradiação de luz foi determinada para 0, 2 ou 4 J / cm 2. As células foram divididas em quatro grupos. I), quer anexina V-FITC e células PI-negativas são considerados ii) células intactas, anexina V-FITC e PI-positivos-negativossão apoptótica cedo, iii) ambos anexina células PI-positivas V-FITC e está atrasado por apoptose, e iv) células anexina V-FITC-negativos e PI-positivas são ou tarde apoptótica ou necrótica. De acordo com a análise microscópica, sob as mesmas condições de irradiação, as células-NP-tratadas com HB P apresentaram fototoxicidade mais elevada do que as células tratadas com HB-NP, e os níveis de células apoptóticas tardias estavam aumentados. Adaptado de Chang et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Tumor Monitoring Volume de A549 ratos portadores de tumores nos dias 0 e 7, as injeções duplas de PBS, livre HB, HB-NPS e HB-P-NPs foram realizadas. A PDT (200 J / cm 2) foi desemMed 1 dia após cada injecção, nos dias 1 e 8. Os tratamentos mostraram diferentes níveis de efeito terapêutico, com HB <HB-PN <HB-P-PN. No dia 45, o grupo de tratamento HB-P-NPs mostrou uma diminuição significativa do volume do tumor em comparação com os outros grupos. Os valores são apresentados como médias ± desvios-padrão (SD; n = 4). O volume do tumor (mm 3) foi definido como (comprimento x largura 2) / 2. Adaptado de Chang et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. As alterações de superfície no local do tumor de A549 ratos portadores de tumores Os locais de tumor foram monitorados após injeções intravenosas duplas (nos dias 0 e 7) da PBS, HB livre, HB-NPS e HB-P-NPs com 200 J / cm2 de luz de irradiação um dia depois de cada injecção (nos dias 1 e 8). Ambos os grupos de tratamento HB-P-PN HB-NPs e começou a mostrar reações do dia após o primeiro PDT. O grupo de tratamento HB-P-NPs mostrou severa hemorragia e o desenvolvimento mais rápido de necrose. Adaptado de Chang et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:. Análise histológica dos tecidos tumorais A549 em ratinhos portadores de tumor no dia 16, a confirmação histológica foi realizada por uma mancha de H & E de tecidos de tumor excisadas. O grupo de tratamento HB-P-NPs demonstraram a morte de células de tumor mais completo. Barra de escala = 500 pm, ampliação = 40X. Adaptado de Chang et al. 10 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais crítico neste estudo é selecionar as condições de laser adequados: comprimento de onda, poder e tempo de irradiação. O comprimento de onda de luz apropriado adequado para o fotossensibilizador específico é necessário para o PDT. Nós usamos um laser de 630 nm, que era apropriado para hipocrelina B. A potência de saída foi outro fator importante, que foi fixado em 400 mW / cm 2 com base em vários estudos-piloto. Potências de saída superior a 400 mW / cm 2 danificado as células ou a superfície da pele dos animais, devido à própria irradiação, enquanto as potências de saída abaixo de 400 mW / cm 2 eram demasiado fracos para mostrar qualquer efeito terapêutico. Os tempos de irradiação adequados para o in vitro e em estudos in vivo foram 40 seg (16 J / cm 2) e 500 segundos (200 J / cm 2), respectivamente. A distância a partir da fibra de PDT para as células ou os tecidos de tumor dos modelos animais foi também um factor crítico neste estudo. Para cobrir toda a superfície de células ou tumores com oluz, de 1 cm foi encontrado para ser a distância óptima.
Se um fotossensibilizador diferente é aplicada, a utilização do comprimento de onda de luz apropriado pode maximizar a eficácia de PDT. O tempo de potência de saída e irradiação deve ser fixado através de tentativa e erro. Quando a superfície da pele começa a queimar durante a irradiação de luz, a potência de saída deve ser definido mais baixo. Quando a superfície do tumor mostra nenhuma mudança em todo o dia após a TFD, que pode indicar a necessidade de aumentar a potência de saída.
Este método tem algumas limitações. Em primeiro lugar, apesar de a distância a partir da fibra de PDT para o alvo é um factor importante no presente estudo, é difícil assegurar a uniformidade. A distância pode variar um pouco, porque é controlado por seres humanos. Em segundo lugar, para o modelo animal com tumores em órgãos tais como o pulmão, este protocolo é difícil de aplicar uma vez que a endoscopia é necessário e movimento respiratório inevitável.
Embora a ressecção cirúrgica é o primeiroopção para o tratamento de cancro do pulmão, o PDT tem várias vantagens como um tratamento alternativo não invasivo e não-cirúrgico. Quando a operação não é apropriada, tal como em casos de lesões múltiplas, a TFD pode ser uma opção válida. Além disso, pré-operatório PDT pode reduzir o tamanho do tumor e diminuir o grau de cirurgia 17. PDT tem menos efeitos colaterais quando em comparação com a cirurgia, terapia de radiação, ou braquiterapia. Além disso, a TFD é irrelevante para as mutações que conferem resistência à terapia de radiação ou quimioterapia 18.
Neste estudo, sugerimos duas nanopartículas alvo de câncer photosensitizer- e anticancerígenos-encapsulada de drogas pulmonares como um sistema de entrega fotossensibilizador da novela para PDT. Este conceito pode ser aplicado a outros fotossensibilizadores e fármacos anti-cancerígenos.
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Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por nenhuma subvenção. 14-2014-017 do Fundo de Investigação SNUBH.
Os autores agradecem a J. Patrick Barron, professor emérito da Universidade de Tóquio Médico e Professor Adjunto, Seoul National Bundang Hospital Universitário para a sua edição pro bono deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oligo hyaluronic acid | Bioland Co., Ltd. | _ | |
| DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. | _ | |
| adipic acid dihydrazide | Sigma Aldrich | A0638 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 39391 | |
| 4-(chloromethyl)benzoyl chloride | Sigma Aldrich | 270784 | |
| Tween 80 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | T0546 | |
| syringe filter | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 17762 | 15 mm, RC, PP, 0.45 µm |
| triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Mini-GeBAflex tubes | Gene Bio-Application Ltd. | D070-12-100 | |
| Paclitaxel | Taihua Corporations | _ | |
| RPMI-1640 | Gibco Life Technologies, Inc. | 11875 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco Life Technologies, Inc. | 15070 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Inc. | 16140071 | |
| Celite (Filter agent) | Sigma Aldrich | 6858 | See step 1.4 |
References
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