Introduction
חיל-רגיש, חיישני סריג מקודדים גנטיים צמחו לאחרונה ככלי חשוב למדידת כוחות מבוסס מתיחה בתאים חיים, ומספקים תובנות איך מכני כוחות מוחלים על פני חלבוני 1, 2, 3, 4. באמצעות כלים אלה, חוקרים יכולים דימוי הלא פולשני כוחות תאיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופי פלורסנט קונבנציונליים. חיישנים אלה מורכבים-זוג סריג (פלורסנט תורם acceptor חלבונים, בתדירות הגבוהה ביותר תורם כחול acceptor הצהוב) המופרדים על ידי פפטיד אלסטי 3. בניגוד C- או N-terminal תיוג, חיישן זה מוכנס לתוך אתר פנימי של חלבון כדי למדוד את הכח המכאני ישודר החלבון, מתנהג כמו מד לחץ מולקולרי. גברת מתח מכאני על פני תוצאות החיישן בעל טווח מוגדל בין-p הסריגאוויר, דבר שגרם לפגיעה סריג 3. כתוצאה מכך, הסריג הוא ביחס הפכו כוח מתיחה.
חיישנים פלורסנט מבוסס אלו פותחו עבור חלבונים דבקים מוקדים (vinculin 3 ו תלין 4), חלבוני cytoskeletal (α-actinin 5), וחלבוני צומת תא-תא (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, ו PECAM 8). הנפוץ ביותר בשימוש היטב מאופיין ומקשר אלסטי ב חיישנים אלה נקרא TSmod והוא מורכב מרצף חוזר ונשנה של 40 חומצות אמינו, (GPGGA) 8, אשר נגזרו flagelliform חלבון משי עכביש. TSmod הוכח להתנהג כמו היענות ננו-אביב אלסטי ליניארי, עם סריג 1 עד 5 pN בכוח מתיחה 3. באורכים שונים של flagelliform יכולים לשמש כדי לשנות את r הדינמיתAnge של TSmod סריג כוח רגישות 9. בנוסף flagelliform, spectrin חוזרת 5 ו פפטיד כיסוי ראש villin (המכונה HP35) 4 שימשו כמו פפטידים אלסטי בין-זוגות סריג ב חיישנים כוח דומה 4. לבסוף, דו"ח אחרון הראה כי TSmod יכול לשמש גם כדי לזהות כוחות דחיסה 10.
אנחנו לאחרונה פיתחה חיישן כוח עבור והמקשר של-שלד התא Nucleo (LINC) חלבון מורכב Nesprin2G באמצעות TSmod מוכנס לתוך חלבון שפותחו בעבר קטועה Nesprin2G המכונה מיני-Nesprin2G (איור 2 ג), אשר מתנהג באופן דומה אנדוגניים Nesprin-2G 11. קומפלקס LINC מכיל חלבונים מרובים מפנים מבחוץ לחלק הפנימי של הגרעין, המקשר את שלד תא ציטופלסמית אל למינה הגרעיני. Nesprin-2G הוא חלבון מבני מחייב הוא אתcytoskeleton אקטין בציטופלסמה וכדי חלבונים SUN במרחב perinuclear. שימוש biosensor שלנו, הצלחנו להראות כי Nesprin-2G כפוף מתח actomyosin התלוי NIH3T3 פיברובלסטים 2. זו הייתה הפעם הראשונה בכח כי נמדד ישירות דרך חלבון במתחם LINC גרעיני, וזה עשוי להיות כלי חשוב להבין את התפקיד של כוח על הגרעין ב mechanobiology.
פרוטוקול להלן מספק מתודולוגיה מפורט של אופן השימוש בחיישן כוח Nesprin-2G, כולל את הביטוי של חיישן המתח Nesprin (Nesprin-TS) בתאי יונקים, כמו גם רכישת וניתוח של תמונות סריג של תאים המבטאים Nesprin- TS. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד בגלאי ספקטרלי, תיאור של איך למדוד פליטה רגישה סריג באמצעות unmixing רפאי הדמית סריג ratiometric מסופקת. תמונות ratiometric הפלט ניתן להשתמש כדי להפוך קואה יחסיתהשוואות כוח ntitative. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בביטוי של Nesprin-TS ב פיברובלסטים, זה ניתנת להתאמה בקלות לתאי יונקים אחרים, כולל שתי שורות תאים תאים ראשוניים. יתר על כן, פרוטוקול זה בכל קשור לרכישת תמונה וניתוח סריג ניתן להתאים בקלות חיישני כוח סריג מבוסס אחרים שפותחו עבור חלבונים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. השג Nesprin-2G חיישן דנ"א האחר פלסמיד דנ"א
- השג Nesprin-2G TS (חיישן המתח), Nesprin-2G HL (ללא ראש) מלאה, mTFP1, ונוס, ו TSmod ממקור מסחרי. הפץ כל פלסמידים DNA ולטהר אותם באמצעות זני חיידק סטנדרטיים, כגון-α DH5, כפי שתואר לעיל 12, 13.
2. תאי Transfect עם Nesprin-2G ו- DNA פלסמיד אחר
- לגדל תאי פיברובלסטים NIH 3T3 כדי מפגש 70-90% בצלחת תרבית תאי 6-היטב בתוך חממת תרבית תאים סטנדרטית עם טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) ו 2 CO (5%) תקנה. עבור מדיום צמיחת תאים, השתמש בינוני נשר Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום עגל עובר.
- במנדף תרבית תאים, להסיר את המדיום ולשטוף היטב עם כל כ 1 מ"ל של מדיום התא מופחת-סרום. הוספת 800 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום היטב כלומקום בתא 6-היטב החממה.
- פיפטה 700 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום לתוך צינור 1.5 מ"ל עם 35 μL של פתרון המוביל השומנים כדי ליצור את "lipomix". מערבבים ידי pipetting. סמן הצינור עם "ל"
- אסוף שישה 1.5 צינורות מ"ל ו לתייג אותם 1 עד 6. פיפטה 100 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום לתוך צינור אחד.
- באמצעות ריכוז פלסמיד דנ"א משלב 1, פיפטה 2 מיקרוגרם של Nesprin 2G-TS לתוך צינורות 1 ו 2. פיפטה 2 מיקרוגרם של Nesprin-HL לתוך צינורות 3 ו 4. פיפטה 1 מיקרוגרם של mTFP לתוך צינור 5. פיפטה 1 מיקרוגרם של mVenus לתוך הצינור 6. אל תשתמש שוב טיפים פיפטה כאשר pipetting סוגים שונים של דנ"א.
- פיפטה 100 μL של lipomix מהצינור "L" לתוך צינור אחד שכותרתו (1-6) ומערבבים על ידי pipetting חזר. השתמש פיפטה נקייה עבור כל צינור. דגירה של 10-20 דקות.
- הוספת 200 μL מצינור כל שכותרתו באר בתא 6-היטב עם 70-90% ומחוברותתאים. סמן בראש כל טוב עם DNA המקביל הוסיף. מניח את חדר 6-היטב באינקובטור במשך 4-6 שעות.
- לשאוב בינונית ומוסיפים 1-2 מ"ל של המדיום הסלולרי מופחת-סרום כדי לשטוף. לשאוב את המדיום הסלולרי-סרום מופחת, להוסיף 2 מ"ל של טריפסין לכל היטב, ומניחים בצלחת 6-היטב החממה (5-15 דקות).
- בעוד תאים לנתק בחממה, זכוכית התחתונה מעיל 6 לצפייה מנות עם שכבה של פיברונקטין בריכוז של 20 מיקרוגרם / מ"ל מומס מלוחים פוספט שנאגרו (PBS). אפשר את הכלים כדי מעיל השטח בשכונה תרבית תאים (כ 20 דק ').
- לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM פעם התאים מנותקים.
- מעבירים את תכולת כל מהבאר אל צינור צנטריפוגה 15 מ"ל שכותרתו ומסובב ב 90 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה הרוטור מתנדנד. לשאוב supernatant מחדש להשעות כל גלולה תא 1000 μL של DMEM ידי ערבוב פיפטה.
- לשאוב את תערובת פיברונקטין מןמנות זכוכית פיפטה 1000 μL של כל השעית תא על צלחות הזכוכית.
- אחרי התאים ליישב לתחתית של מנות זכוכית (~ 15 דקות), להוסיף 1 מ"ל של DMEM + 10% FBS + 1% פן-סטרפ היטב כל מקום בחממה התא. אפשר התאים לצרף ולהביע חיישן לפחות 18-24 h.
הערה: תאים הם transfected באמצעות ריאגנטים transfection השומנים מסחרי קטיוני (ראו טבלה של חומרים). לחלופין, שורות תאים יציבות ניתן לבחור באמצעות פלסמיד עם גן המקנה עמידות רעלן (פלסמידים pcDNA עבור Nesprin-TS ו -HL זמינים באתר מאגר DNA (ראה טבלה של חומרים) לספק תאים המבטאים התנגדות geneticin ). בנוסף, שיטות זיהום ויראלי (lentivirus, רטרו-וירוס, או אדנו) יכול להיות מנוצל כדי להביע את החיישן בתאים שקשה transfect. - בנוסף Nesprin-TS, transfect תאים נוספים עם Nesprin HL אפס עבורמלא CE, כמתואר בשלבי 2.1-2.12; TSmod יכול לשמש גם כשלט אפס כוח צריך להפגין סריג דומה Nesprin-HL.
- תאים Transfect עם mTFP1 ו ונוס ליצור טביעות אצבעות ספקטרלי (ראה שלב 4).
הערה: mTFP1 ו ונוס בדרך כלל לבטא ברמות גבוהות יותר מאשר Nesprin-TS, וככזה, כמויות נמוכות של DNA ייתכן שיהיה צורך טרנספקציה להשיג רמות ביטוי דומה.
3. בדוק יעילות transfection
- בערך 18-24 שעות לאחר השלמת transfection, להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה כדי לבחון את היעילות של transfection ידי השוואת מספר התאים פלורסנט למספר הכולל של תאים לאור (בדרך כלל 5-30%).
- השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד תדר עירור ליד 462 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס) ו מסנן פליטה מרוכז ליד 492 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס).
הערה: לחלופין, מערכות סינון GFP תהיה ללכוד שילוב של mTFP1 ו veפליטת Nus ותאפשר את האישור של יעילות transfection.
- השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד תדר עירור ליד 462 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס) ו מסנן פליטה מרוכז ליד 492 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס).
- תאי תמונת חיה בתוך 48 שעות לאחר transfection.
- לחלופין, לתקן תאים paraformaldehyde 4% (ב PBS עם סידן ומגנזיום) עבור 5 דקות, חנות PBS, ולהציג לאחר 48 h 8.
הערה: Beyond 48 h, איכות האות וכוח דועך. תיקון התאים משמר המדינה שלהם, כולל סריג לידי ביטוי 8; עם זאת, תאים צריכים להיות צלמו רק ב- PBS, כמו הרכבה בינונית עשויה להשפיע 14 סריג. תאים קבועים ניתן להשוות רק לתאים קבועים אחרים, כמו ייתכנו שינוי הביטוי.
זהירות: Paraformaldehyde רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
- לחלופין, לתקן תאים paraformaldehyde 4% (ב PBS עם סידן ומגנזיום) עבור 5 דקות, חנות PBS, ולהציג לאחר 48 h 8.
4. לכידת ספקטרלי טביעות אצבעותיהם של mTFP1 ו ונוס fluorophores עבור ספקטרלי unmixing
- במנדף תרבית תאים, להחליף את המדיום הסלולרי עם mediu הדמיהמ '(HEPES שנאגר) השלים עם 10% בסרום שור עובר.
- מניחים את הכלים הצפייה באופן מבוקר טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) בשלב מיקרוסקופ confocal.
- מניח את צלחת הצצה מהזכוכית עם תאים-טרנספקציה mTFP1 מעל המטרה השמנה בהגדלה 60X עם צמצם מספרי של 1.4.
הערה: שמן משמש על מיקרוסקופ סורק לייזר על המטרה 60X להידמות מקדם השבירה מקרוב של מצע זכוכית. השמן הוא מונח על גבי העדשה האובייקטיבית שבא במגע ישיר עם coverslip הזכוכית. - אתר mTFP1 לבטא בתאים עם מקור עירור 458 ננומטר ו מסנן bandpass פליטה המרוכז ב 500 ננומטר.
- עם תא פלורסנט בתחום הראייה, לבחור את מצב זיהוי ספקטרלי ( "מצב למבדא" בתוכנה המשמשת כאן) ו ללכוד את התמונה ספקטרלי (איור 3-1); כל החדרים כוללים תדרים מעבר 458 ננומטר באמצעות 10 במרווחים ננומטר (איור 3-3). בחר fluoresc בהירבאזור אף אוזן גרון (ROI) על התא (רדיוס 20-פיקסל).
הערה: צורת הספקטרלית של ROI mTFP1 להביע צריכה להישאר קבועה יחסית על פני התא. אם הצורה משתנית במידה ניכרת, מחדש ולהתאים את הליזר ולהשיג הגדרות כדי לשפר את יחס אות לרעש. - מוסיפים את ההחזר על ההשקעה פלורסנט אומר, עוצמת מנורמל למסד הנתונים ספקטרלי על ידי לחיצה על "שמור ספקטרום למסד הנתונים."
- ייעל את כוח הליזר ולהשיג כזה כי מושגת יחס אות לרעש טוב. הגדרות תשתנינה עבור ציוד שונה. השימוש הלא-ניאון, תאים untransfected כהפניה רקע, להגדיל את הרווח ואת הכוח עד תאים בהירים, אך לא מעבר לטווח הדינמי של גלאי (נקודת הרוויה). תאי רקע לא צריכים קרינה לזיהוי לאחר החישוב ממוצע.
- חזור על התהליך עבור תאי ונוס-טרנספקציה עם החריגים הבאים:
- ודא כי תדירות העירור היא 515 ננומטר וכי מסנן bandpass הוא CEntered ליד 530 ננומטר כאשר איתור תאי-להביע ונוס.
- "מצב ספקטרלית," להשתמש בתדירות עירור של 515 ננומטר במקום 458 ננומטר.
5. לכידת תמונות צרופות
- לעבור את המצב הלכיד "ספקטרלי unmixing."
- מוסיפים את טביעות האצבעות ספקטרלי של ונוס mTFP1 לתוך ערוצי unmixing (איור 3, חץ-2).
- הגדר את הלייזר עירור בחזרה למקור ארגון 458 ננומטר.
- מניחים את צלחת לצפייה Nesprin-TS מעל המטרה שמן 60X.
- לאחר התמקדות תא פלורסנט עם ביטוי בהיר מספיק, להתאים את הכוח רווח לייזר כדי לייעל את יחס אות לרעש.
הערה: מאז הסריג היעיל של Nesprin-TS הוא ליד 20%, התמונה ונוס הצרופה צריכה להיות דימר משמעותי יותר מתדמית mTFP1 הצרופה. לאחר הגדרת כוח ורווח מקובל נקבעה באופן איטרטיבי, פרמטרים אלה חייבים להישאר קבועים עבור כל סרן התמונותured. - לכידת מינימום של 15-20 תמונות של תאי Nesprin-TS עם בהירות דומה יחסית ולהימנע הרוויה פיקסל מוגזמת (כל פיקסלים הרוויים מוסרים במהלך עיבוד תמונה).
- חזור על התהליך לכיד תמונה עם תאי Nesprin-HL באמצעות פרמטרי הדמיה זהים.
6. עיבוד תמונה וניתוח תמונה רציו
- שימוש בתוכנות קוד פתוח ImageJ (פיג'י) (http://fiji.sc/), תמונות בפורמט טבעיות פתוחות באמצעות קורא BioFormats.
- בתהליך קדם התמונות ולחשב את התמונות יחס באמצעות פרוטוקולים הוקמו בעבר 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות בפרוטוקול לעיל, פלסמיד דנ"א נרכשה מהמאגר דנ"א להפוך לתאי חיידק. E. coli להביע הדנ"א חיישן נבחרו מתוך LB / צלחות אמפיצילין ו מוגבר במרק LB נוזלי. בעקבות ההגברה של הווקטורים, פלסמידים DNA היו מטוהרים לתוך חיץ טריס-EDTA באמצעות תקן, ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי. באמצעות ספקטרופוטומטר, DNA מטוהרים היה לכמת לתוך ריכוז רמת מיקרוגרם / מ"ל (איור 1A, ימים 1-2).
שימוש פיברובלסטים NIH3T3, תאים גדלו ל מפגש 70-90% בצלחת תרבית תאי פלסטיק 6-היטב. כדי להכניס פלסמיד דנ"א לתוך תאי NIH3T3, A transfection פלסמיד בתיווך שומנים בוצע. מסחרית מגיב transfection זמין (ראו טבלה של חומרים) שימש ככלי השומנים עבור DNA. שני משכפלחיישני Nesprin-TS ו Nesprin-HL היו transfected לתוך 4 בארות תא (איור 1B). כהכנה הדמיה סריג, בונה fluorophore יחיד של mTFP1 ונוגה היו transfected לתאי NIH3T3 (איור 1B). בעקבות transfection, תאים הועברו זכוכית תחתונה צופים מנות תואמות עם גדלה גבוהה, מיקרוסקופי confocal הפוכים.
לפני שתמשיך הדמיה confocal, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה רחב בתחום פשוט שימש כדי לוודא את יעילות transfection. באמצעות מטרת 10x עם צמצם מספרי של 0.25, תאים רבים בתחום של נוף טיפוסי הביע את Nesprin-TS (איור 2). באופן כללי, החיישן מקומי סביב מעטפת הגרעין, עולה בקנה אחד עם הלוקליזציה אנדוגניים של Nesprin-2G 2. חיישן השלט לא-כוח, Nesprin-HL, פעל בתבנית ביטוי דומה 2.
לבסוף, ערימות תמונה נפתרה ספקטרלית יובאו לתוך תוכנת קוד פתוח ImageJ לעיבוד. התמונות היו מראש מעובד, ותמונות יחס חושבו בעזרת נהלים שנקבעו 15.
class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> מאחר ויחס הסריג הוא מדידה יחסית, כל ניסוי חייב להשוות בין שני או יותר תנאים. בנוסף, בגלל הגדרות גלאי ליזר ומצלמה יכולות להשפיע סריג, כל התנאים צריכים להיות רכשו באותה פגישת הדמיה. לעתים קרובות, אנו משתמשים בשלט בלי ראש או זנב וחסר כוח-רגיש, מייצג שליטת אפס כוח, כמו-קו בסיס לניסויים שלנו. מכיוון שתמונות יחס סריג יכולות להיות רועשות, זה לעתים קרובות יש צורך לקחת מספר תמונות (5-20) עבור כל תנאי. על התנאים שבהם יש הבדלים גדולים סריג, זה יהיה להבחין ויזואלית בתמונות יחס סריג. ההבדל הדרמטי ביותר סריג עבור חיישן מתח Nesprin היה בין תאי unpatterned ומאורך (איור 5). למרות שיש שוני בין תאים, שינוי הסריג בין שני התנאים הוא דראמטי, כך ניתוח נוסף לא ייתכן שיידרש. עם זאת, תנאים אחרים יש לעתים קרובות מיניmal שינויי סריג; יכול להיות שהם לא ניתן להבחין חזותית בין תמונות בודדות, אלא דורשים את הנתונים ינותחו במצטבר. כדי לקבוע אם שינויים אלה הם משמעותיים, יחס הסריג החציוני עבור כל תמונה מחושב והביע חזותית כמערכת של היסטוגרמות. על ידי השוואת היסטוגרמות בין תנאים, הוא הופך להיות יותר קל לראות שינויים מעודנים ב סריג בין קבוצות ניסוי. באיור 6 א ו 6B, היסטוגרמות הסריג של כל תא יחיד מיוצגות על ידי צבע בהיסטוגרמה המוערם. Calyculin A-תאים שטופלו (איור 6) מציגים יחסי היסטוגרמה שמאלה שהוסטו סריג לתאים שטופלו ML7 מעכב שרירן (איור 6 א).
איור 1: ניסיוני מבוסס-שעה תרשים זרימה. (א) החל sens רכשאו פלסמיד דנ"א, וקטורים החיידק הופכים עם DNA, שנבחרו, ו מוגבר (ימים 1-2). מאת מרק E. coli LB מרוכזים, פלסמיד דנ"א מבודד לכמת (יום 3). באמצעות פלסמידים DNA מטוהרים, פיברובלסטים NIH3T3 הם transfected במתכונת שש היטב (ב ') מועברים על גבי צלחות זכוכית תחתונה תואמות מיקרוסקופ confocal הפוכה (יום 3). כדי לוודא את הצלחת transfection, תאים נתפסים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield מצויד מערכות הסינון המתאים (יום 4). מותנה transfection מוצלח, התאים הם צילמו על מיקרוסקופ confocal מצויד בגלאי רפאים. שימוש unmixing ספקטרלי, ערוצי mTFP1 ו ונוס מופרדים במהלך הרכישה ונשמר כמו ערימות התמונה נפתרה ספקטרלית (ימים 4-5). לבסוף, תמונות מעובדות ב ImageJ, ואת-תמונות היחס מחושבות. pleASE לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונה מייצגת של טרנספקציה NIH3T3 פיברובלסטים. (א) הגדלה 10X של פיברובלסטים NIH3T3 transfected להביע Nesprin-TS באמצעות filterset GFP. (ב) במתואר של התיבה התוחמת מן הביטוי חיישן חלק א מלווה את מעטפת הגרעין ולעתים קרובות מרחיב לתוך הציטופלסמה. (ג) Nesprin-TS ו -HL בקרה ואיך הם נקשרים אל תקטינו תחומי מחייב שמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Spectral הדרכת טביעת אצבעות באמצעות תוכנת Confocal. ספקטרום פליטה מנורמל המתקבל רדיוס 20-פיקסל באזורים-של-עניין הדגיש שמתווית כוונת צבעוניות. (חץ-1) מצב זיהוי ספקטרלי כדי ללכוד את התמונה. (חץ-2) "ספקטרלי unmixing" ההגדרה להוספת ספקטרה מנורמל למסד הנתונים רפאים. (חץ-3) תדירות העירור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: חיה ספקטרלי unmixing ו פלט של תוכנה Confocal. (א) פרמטרי הדמיה קריטיים כדי לשחזר תמונות חיות, לא מעורבבות. (חץ-1) תדירות העירור. (חץ-2) בשידור חי במצב unmixing רפאים. (ב) תמונת גרעיני ערוץ ונוס צרוף. (
איור 5: Nesprin-TS סריג תמונות יחס בכליה בדוגמת unpatterned מדין-דארבי כלב (MDCK) תאים. תאים MDCK כי ביציבות להביע Nesprin-TS הם צילמו על 10 קווים פיברונקטין מיקרומטר רחב (א) או polydimethylsiloxane unpatterned (PDMS) ממברנות (B). ממברנות גרעין היו רעולות פנים ויזואלית ומעובדות לתוך יחסי סריג. סרגל סולם בצבע מייצג את משרעת יחס סריג עבור גרעינים unpatterned בדוגמת.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: עיבוד תמונות ratiometric סריג מ Nesprin-TS-לבטא בתאי ו היסטוגרמה ניתוח של נתונים מצטברים. (א) נציג, היסטוגרמה מוערם מנורמל של תמונות יחס סריג של Nesprin-TS שטופלו במעכבי שרירן ML7, בצבעים ידי גרעין תא פרט. (ב) נציג, היסטוגרמה מוערמים מנורמל של תמונות יחס סריג של Nesprin-TS שטופלו Calyculin, activator של התכווצות התא. האגדה וקושרת לכל גרעין נתח מיקומו על ההיסטוגרמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה והדגמה של הדמיה תא חי של מתח מכני על פני Nesprin-2G, חלבון במתחם LINC גרעיני, היה שתוארו לעיל. לפני עבודה זו, טכניקות שונות, כגון שאיפת micropipette, מגנט חרוז cytometry, ליזר-אבלציה מיקרוסקופי, שמשו ליישם עומס על גרעין התא כדי למדוד תכונות החומר בתפזורת שלה 16, 17, 18. עם זאת, עד העבודה האחרונה שלנו, אין מחקרים הראו ישירות כי כוחות מתיחה מועברים ישירות על חלבון מורכב LINC בתאים חיים 2.
בעבר, במעבדה שלנו הוכיחה כי גרסה שונה של Nesprin2G, המכונה מיני-Nesprin2G, יכולה להיות שהונדסה בדיקת סריג כוח המכונית TSmod (איור 2C) 2. TSmod הוצגה בעבר למדוד מתיחה דינמית עבורCES בתאים חיים וב חלבונים שונים הנושא עומס 3, 4, 6, 8. כמו כן הוצג כי המיני-Nesprin-2G היה נבדל אנדוגניים Nesprin-2G ביחס הלוקליזציה שלה, תופעות ידועות על שלד התא, ואת היכולת להציל מיצוב גרעיני 11, 19. באמצעות חלבון מיני Nesprin-2G עם TSmod (Nesprin-TS), הודגם כי פיברובלסטים NIH3T3 להביע את החיישן יש רמה בסיסית של יחסי מתיחות כדי Nesprin-HL, אשר לא יכול להיקשר אקטין 2. יתר על כן, האפנון של התכווצות הסלולר באמצעות מעכבים או ממריצי עשיית השרירן ניתן לאתר על ידי Nesprin-TS 2.
ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. מבלבל Nesprin-TS עם Nesprin-HL (דנ"א או תאים המבטאים) אינו readily שזוהה כאחד דומה למקם את קרום הגרעין, וכן יוביל לתוצאות מבלבלות. מאז Nesprin-HL הוא פקד שום כוח, לדאוג הנמדד צריך להיות גבוה יותר מאשר Nesprin-TS בממוצע. כדי להיות זהיר, בונת DNA מבודדת רצף תאי תיוג בזהירות מומלצת. שנית, חשוב לייעל את רווח הגלאי וכוח הליזר בקפידה על מיקרוסקופ confocal כדי לשפר את יחס אות לרעש וכדי למזער הלבנה. כדי למדוד סריג כראוי, פרמטרים אלה חייבים להישאר קבועים במהלך רכישת התמונה. יתר על כן, אופטימיזציה של רווח הגלאי או כוח עבור תאי מבטאים עמומים או בהירים מאוד הוא הכי מוצלחת, כי תאי מבטאים החציוני יטו נפולת של הטווח הדינמי של הגלאי. תאים מסוימים המבטאים ריכוז גבוה של חיישן נוטים לזרוח ב nucleoplasm ואת reticulum endoplasmic, ולכן קשה לפתור את קרום הגרעין, אשר ככל הנראה באזור מעניין יותר לגבי FORCE. בחירת תאים עם רמות ביטוי נמוכות מעט נוטה לפתור בעיה זו של לוקליזציה חיישן.
בעוד הדמיה ספקטרלית ratiometric היא דרך פשוטה ומהירה יחסית למדוד סריג, זה לא יחידות פלט של סריג יעילות בשל לדמם דרך אות acceptor 20. ללא יחידות של סריג יעיל, לא ניתן להמיר את מדד יחס סריג לתוך מדידת כוח מכוילת. בשל מגבלה זו, ניתן לבצע השוואות כוח כמותי ביחס בלבד. סריג יעילות יכול להיקבע על ידי שיטות מסובכות יותר, כגון מיקרוסקופיה הדמיה בחי קרינה (FLIM) או photobleaching acceptor. כוח מוחלט (ברמת PN) ניתן לאמוד מתוך סריג יעיל, כפי שתוארו לעיל 3, 8.
בניגוד לשיטות קודמות כדי למדוד את התכונות המכאניות של הגרעין או העקירה של o מבוסס הגרעיןn חיצוני להחיל כוחות, מדידת סריג מ Nesprin-TS יש את היתרון של מתיחות חיטוט פולשני על מרכיב של קרום הגרעין 16, 17, 18. חיישן פלט אות ניאון כי הוא מתואם עם העומס על מולקולות Nesprin-2G פרט. לעומת זאת, השאיפה micropipette דורשת שימוש בכלים עדינים בעבודה עם תאים חיים. אבלציה לייזר Confocal גורמת נזק הסלולר המקומיות ומחייבת מקור לייזר פעמו. מתפתל מגנטי cytometry כוחות העברות על הממברנה הגרעינית באמצעות שלד התא ולא יכול לשמש למדידת כוחות על חלבונים ספציפיים, אלא אם כן היו להיות בשילוב עם חיישן המתח Nesprin-2G.
למרות שזה הוכח כי כוחות מתיחים מבוסס יקטינו מועברים Nesprin-2G, מרכיב של מתחם הלינק, הוא נשאר לא ידוע איך מתיחה הרבה או כוחות דחיסה הם הפעילועל חלבונים LINC מבניים אחרים, SUN-1 או SUN-2 כאלה. עבודה עתידית תופנה כלפי שיבוט בדיקות-כוח סריג לחלבוני LINC נושא עומס משוערים אלו כדי להבהיר מכניקה גרעינית עם רזולוצית חלבון ברמה. נושא נוסף אשר מציג את עצמו הוא כי שינויי הסריג עשויים להיות קשורים לשינויים במתח אלא לשקף או שינויי oligomerization Nesprin-2G או שינויים מרחביים של Nesprin-2G. שינויים ב- pH הסלולר יכולים להשפיע על הקרינה של החיישן ולשנות את הסריג הנמדד. חיישן Nesprin-2G HL מייצג שליטה טובה עבור חלק מהשינויים הללו (כמו שינויי הסריג שנצפו עם חיישן זה הם ככל הנראה לא קשור לכפות), ובונה מלאת סריג מולקולאריים ניתן לפתח להעריך oligomerization (ראה להלן). בנוסף, הביטוי של nesprin-2G TS הוא מונע על ידי אמרגן CMV, שתוצאתה ביטוי יתר, רמה גבוהה זו של ביטוי פוטנציאלי עלולה לגרום חפצים ביולוגיים. ההתקדמות שחלה באחרונה עם גlustered בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (קריספר) אפשרו לתיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) מתקרב להכניס רצפי דנ"א גדולים לתוך הגנום 21. גישה זו יכולה לשמש כדי לשנות Nesprin-2G אנדוגני (או חלבונים אחרים) לכלול TSmod. זה יספק ביטוי של חיישן כוח באמצעות promotor אנדוגניים המתאים, צמצום פוטנציאל חפצים ביטוי יתר.
TSmod ו בדיקות סריג אלסטי אחרות יכולים לשמש גם כדי לפתח חיישנים חדשים עבור חלבונים אחרים, דבר עלול לשמש פרוטוקול דומה לזו המתוארת במאמר זה. אחת בעיות מרכזיות עם הפיתוח של כל חיישן כוח חדש היא קביעת ההחדרה הפנימית עבור חיישן הסריג. ראשית, האתר של החדרה חייב להיות באזור של החלבון נתון עומס מכאני. אזורים אלה יכולים להיות מזוהים על ידי בחינה שבו חלבונים המחוברים cytoskeletal אינטראקציה עם החלבון. ההחדרה שנית, של גדול (~ 50 KDA) TSmod אסור לשבש את התפקוד הביולוגי של החלבון נלמד. מפותח בעבר "מיני" בצורת Nesprin-2G הראה כי תחומים CH-מחייב אקטין לגישור לתחום SUN מחייב KASH היו מספיק תנועה גרעיני Nesprin-2G ב monolayers פצוע 11, 19, דבר המצביע על כך החדרת TSmod היה לא סביר לשבש את תפקוד החלבון. אישור של הפונקציה הביולוגית של החיישן דורש assay תפקודית עבור תפקוד חלבון (בו חיישן הכח יכול לראות להציל תפקיד ספציפי בתאים המדולדלים של חלבון אנדוגני). שלישית, שינויי oligomerization חלבון יכולים לשנות את הסריג בין חלבונים (כינת מולקולאריים סריג 22), אשר שיוביל לשינויי סריג שאינם קשורים לכפות. ניתוח זהיר של זה דורש לעתים קרובות מבני סריג מולקולאריים מיוחדים במיוחד לדווח oligomerization.
נַעֲרָה = "jove_content"> מבוססי סריג חיישני כוח אפשרו ניתוח בזמן ובמרחב של כוחות מכניים עם רזולוציה חלבון ספציפי. למרות פרוטוקול זה מפרט את השימוש בחיישן מתח Nesprin-2G, הוא החלים מספר חיישנים קיימים זמינים עבור חלבוני הידבקויות מוקד וצומת תא-תא. שימוש חיישנים אלה Nesprin-2G וחלבוני נושא בעול אחרים יספק תובנה משמעותית מכניקת תא mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תומאס פ וקייט מילר Jeffress Memoria Trust (עד דצמבר) ו- NIH להעניק R35GM119617 (עד דצמבר). הדמית מיקרוסקופ confocal בוצעה לעבר Core אפיון ננו VCU (NCC) המתקן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A.
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
