Introduction
Kraft-følsomme, har genetisk kodede FRET sensorer nylig dukket opp som et viktig verktøy for å måle strekk-krefter basert på levende celler, gir innsikt i hvordan mekaniske krefter som påføres på tvers av proteiner 1, 2, 3, 4. Med disse verktøyene, kan forskerne ikke-invasiv bilde intracellulære krefter i levende celler ved hjelp av konvensjonelle lysrør mikroskoper. Disse sensorene består av et FRET-par (donor og akseptor fluorescerende proteiner, oftest en blå donor og akseptor gul) adskilt av en elastisk peptid 3. I motsetning til C- eller N-terminal merking, innføres denne sensoren inn i et indre område av et protein for å måle den mekaniske kraft som overføres på tvers av protein, oppfører seg som en molekylær strekklapp. Økt mekanisk spenning over sensoren resulterer i en øket avstand mellom de FRET-pluft, noe som resulterer i redusert FRET 3. Som et resultat, er FRET omvendt relatert til strekkspenning.
Disse fluorescerende-baserte sensorer har blitt utviklet for fokale adhesjonsproteiner (vinculin 3 og talin 4), cytoskjelettproteiner (α-aktinin 5), og celle-celle-junction-proteiner (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, og PECAM 8). Det mest brukte og godt karakterisert elastisk linker i slike biosensorer er kjent som TSmod og består av en repeterende sekvens av 40 aminosyrer, (GPGGA) 8, som ble avledet fra spideren silke protein flagelliform. TSmod er blitt vist å oppføre seg som en lineær elastisk nano-fjær, med FRET respons på 1 til 5, pN av strekkraft tre. Forskjellige lengder av flagelliform kan brukes til å endre den dynamiske range av TSmod FRET-kraft følsomhet 9. I tillegg til flagelliform, gjentar spektrin 5 og villin headpiece peptid (kjent som HP35) 4 er blitt anvendt som de elastiske peptidene mellom FRET-par i tilsvarende kraft biosensorer 4. Endelig en fersk rapport viste at TSmod kan også brukes til å oppdage kompresjonskrefter 10.
Vi har nylig utviklet en kraftsensor for linkeren til den nucleo-cytoskjelettet (LINC) kompleks protein Nesprin2G ved hjelp TSmod innsatt i en tidligere utviklet avkortet Nesprin2G protein som kalles mini-Nesprin2G (figur 2C), som oppfører seg på samme måte som endogent Nesprin-2G 11. Den LINC Komplekset inneholder flere proteiner som fører fra utsiden til innsiden av kjernen, som forbinder den cytoplasmatiske cytoskjelettet på atom lamina. Nesprin-2G er et strukturelt protein å binde seg til bådeaktin cytoskjelettet i cytoplasma og til sol proteiner i perinukleære plass. Ved hjelp av vår biosensor, var vi i stand til å vise at Nesprin-2G er underlagt actomyosin avhengig spenning i NIH3T3 fibroblaster 2. Dette var første gang at styrken ble målt direkte over et protein i den kjernefysiske LINC komplekse, og det er sannsynlig å bli et viktig verktøy for å forstå hvilken rolle kraft på kjernen i mechanobiology.
Protokollen nedenfor gir en detaljert metodikk for hvordan man skal bruke Nesprin-2G kraftsensor, inkludert ekspresjonen av Nesprin spenningsføleren (Nesprin-TS) i pattedyrceller, samt innsamling og analyse av FRET bilder av celler som uttrykker Nesprin- TS. Ved hjelp av et invertert konfokalt mikroskop utstyrt med en spektral-detektor, gnage en beskrivelse av hvordan man skal måle sensibiliserte emisjon ved bruk av spektral unmixing og ratiometrisk FRET avbildning er gitt. Utgangs Proporsjonal Bildene kan brukes til å lage relativ quantitative kraft sammenligninger. Selv om denne protokollen er fokusert på ekspresjon av Nesprin-TS i fibroblaster, er det lett tilpasses til andre pattedyrceller, innbefattende begge cellelinjer og primære celler. Videre kan denne protokoll som det er relatert til bildeinnsamling og FRET analyse lett tilpasses andre FRET-baserte kraft biosensorer som er blitt utviklet for andre proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Få Nesprin-2G Sensor DNA og andre PlasmidDNA
- Oppnå Nesprin-2G TS (strekksensor), Nesprin-2G HL (hodeløs) kontroll, mTFP1, Venus, og TSmod fra en kommersiell kilde. Forplante alle DNA-plasmider og rense dem ved hjelp av standard E. coli-stammer, slik som DH5-α, som beskrevet tidligere 12, 13.
2. transfektere celler med Nesprin-2G og andre Plasmid DNA
- Vokse NIH 3T3 fibroblaster celler til 70-90% konfluens i en 6-brønners cellekulturskåler i en standard cellekulturinkubator med temperatur (37 ° C) og CO2 (5%) regulering. For cellevekstmedium, bruk Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt kalveserum.
- I en cellekultur hette, fjern mediet og skylle hver brønn med ca. 1 ml av en redusert serumcellemediet. Legg 800 ul av redusert serumcellemedium til hver brønnog plasser 6-brønn kammer i inkubatoren.
- Pipetter 700 ul av redusert serumcellemedium inn i et 1,5 ml rør med 35 pl av lipidbærer løsning for å danne den "lipomix". Bland ved pipettering. Merke røret med en "L."
- Samle seks 1,5 ml rør og merke dem fra 1 til 6. Pipetter 100 ul serumreduserte cellemedium inn i hvert rør.
- Bruk av plasmid-DNA-konsentrasjonen fra trinn 1, pipette 2 ug av Nesprin 2G-TS inn i rørene 1 og 2. Pipetter ble 2 ug Nesprin-HL inn i rørene 3 og 4. Pipette 1 pg mTFP inn i røret 5. Pipetter 1 pg mVenus inn i røret 6. ikke gjenbruk pipettespisser ved pipettering forskjellige typer av DNA.
- Pipetter 100 mL av lipomix fra "L" tube inn i hver merket rør (1-6) og blandes ved gjentatt pipettering. Bruk en ren pipette for hvert rør. Inkuber i 10-20 min.
- Tilsett 200 ul av hver merket rør til en brønn i en 6-brønn kammer med 70-90% sammenflytendeceller. Etiketten toppen av hver brønn med det tilsvarende DNA tilsatt. Plasser 6-brønn kammer i en inkubator i 4-6 timer.
- Aspirer medium og tilsett 1-2 ml av redusert serumcellemedium for å skylle. Aspirer redusert serum celle medium, tilsett 2 ml trypsin til hver brønn, og plasser 6-brønners skål i inkubator (5-15 min).
- Mens cellene løsner i inkubatoren, frakk 6 glassbunn visning retter med et lag av fibronektin ved en konsentrasjon på 20 mikrogram / ml oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS). La det derfor et belegg på overflaten i cellekultur hette (ca. 20 min).
- Nøytraliser den trypsin ved å tilsette 2 ml DMEM når cellene er frittliggende.
- Overfør innholdet i hver brønn til en merket 15 ml sentrifugerør og spinne ned ved 90 xg i 5 minutter i en svingende rotorsentrifuge. Aspirer supernatanten og re-suspendere hver celle pellet i 1000 ul DMEM med pipette blanding.
- Aspirer fibronektin blandingen fraglass retter og pipette 1.000 pl av hver cellesuspensjon på glass retter.
- Etter at cellene faller til bunnen av glassskåler (~ 15 min), tilsett ytterligere 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep til hver brønn og plass i celleinkubator. Tillate at cellene festet og uttrykke sensoren i minst 18-24 timer.
MERK: Celler transfektert ved anvendelse av kommersielle kationiske lipid transfeksjonsreagenser (se tabell of Materials). Alternativt kan stabile cellelinjer bli valgt ved anvendelse av et plasmid med et gen som gir resistens mot et toksin (pcDNA plasmider for Nesprin-TS og -HL er tilgjengelige på en DNA-depot nettsted (se tabell of Materials) tilveiebringe celler som uttrykker geneticin motstand ). I tillegg kan virusinfeksjon-metoder (lentivirus, retrovirus eller adenovirus) bli anvendt for å uttrykke sensoren i celler som er vanskelig å transfektere. - I tillegg til Nesprin-TS, transfektere flere celler med den Nesprin HL null force kontroll, som beskrevet i trinnene 2.1-2.12; TSmod kan også brukes som et null-kraftstyring og bør oppvise lignende FRET til Nesprin-HL.
- Transfektere celler med mTFP1 og Venus å generere spektral fingeravtrykk (se punkt 4).
MERK: mTFP1 og Venus vanligvis uttrykker på høyere nivåer enn Nesprin-TS, og som sådan kan lavere mengder av DNA som trenger å bli transfektert for å oppnå lignende ekspresjonsnivåer.
3. Kontroller Transfeksjon Effektivitet
- Omtrent 18 til 24 timer etter fullført transfeksjon, bruke en invertert fluorescerende mikroskop for å undersøke effektiviteten av transfeksjon ved å sammenligne antallet fluorescerende celler til det totale antall celler i lys (vanligvis 5-30%).
- Bruke et fluorescerende mikroskop utstyrt med en eksiteringsfrekvens nær 462 nm (mTFP1) eller 525 nm (venus) og en emisjonsfilter sentrert nær 492 nm (mTFP1) eller 525 nm (Venus).
MERK: Alternativt vil GFP filtersett fange en kombinasjon av mTFP1 og veNus utslipp og vil tillate bekreftelse av transfeksjon effektivitet.
- Bruke et fluorescerende mikroskop utstyrt med en eksiteringsfrekvens nær 462 nm (mTFP1) eller 525 nm (venus) og en emisjonsfilter sentrert nær 492 nm (mTFP1) eller 525 nm (Venus).
- Bilde levende celler innen 48 timer etter transfeksjon.
- Alternativt kan løse celler i 4% paraformaldehyd (i PBS med kalsium og magnesium) i 5 minutter, oppbevares i PBS, og visning etter 48 timer 8.
MERK: Utover 48 t, signalkvalitet og styrke avtar. Fiksering av cellene bevarer sin tilstand, herunder FRET blir uttrykt 8; imidlertid bør cellene bare avbildes i PBS, som monteringsmedium kan påvirke FRET 14. Fikserte celler kan bare sammenlignes med andre fikserte celler, ettersom det kan være en forandring i ekspresjon.
Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr (PVU).
- Alternativt kan løse celler i 4% paraformaldehyd (i PBS med kalsium og magnesium) i 5 minutter, oppbevares i PBS, og visning etter 48 timer 8.
4. Capture Spectral Fingeravtrykk av mTFP1 og Venus fluorophorer for Spectral Unmixing
- I en cellekultur hette, erstatte cellemediet med bildebehandling medium (HEPES-bufret) supplert med 10% føtalt bovint serum.
- Plasser betraktnings retter i en temperaturstyrt (37 ° C) konfokalt mikroskop trinn.
- Sett glass visnings fatet med mTFP1-transfekterte celler over oljeobjektivet ved 60x forstørrelse med en numerisk apertur på 1,4.
MERK: Oljen brukes på en laser scanning mikroskop på 60X objektiv skal ligne brytningsindeksen for glass-substratet. Oljen ble plassert på toppen av objektivlinsen og kommer i direkte kontakt med dekkglass. - Lokal mTFP1 uttrykkende celler med et 458 nm eksitasjon kilde og en emisjonsbåndpassfilter sentrert på 500 nm.
- Med et fluorescent celle i synsfeltet, velger den spektrale deteksjonsmodus ( "Lambda Mode" i den programvare som brukes her), og ta den spektrale bilde (figur 3-1); inkludere alle frekvenser enn 458 nm ved hjelp av trinn på 10 nm (se figur 3-3). Velg en lys fluorescerendeent region (ROI) på cellen (20-piksel radius).
MERK: spektrale formen på mTFP1-uttrykk ROI skal forbli forholdsvis konstant over cellen. Dersom formen varierer betydelig, etterjustere laser og nytteinnstillinger til å forbedre signal-til-støy-forhold. - Tilsett fluorescerende ROI mener, normalisert intensitet til den spektrale databasen ved å klikke på "lagre spektra til databasen."
- Optimallasereffekten og få slik at et godt signal-til-støyforhold er oppnådd. Innstillingene vil variere for forskjellig utstyr. Bruk av ikke-fluoriserende, ikke-transfekterte celler som en bakgrunnsreferanse, øker forsterkningen og effekt inntil cellene er lyse, men ikke utover den dynamiske område for detektoren (metning). Bakgrunns cellene bør ikke ha påvisbar fluorescens etter snitt.
- Gjenta prosessen for venus-transfekterte celler med følgende unntak:
- Sikre at eksiteringsfrekvensen er ved 515 nm, og at båndpassfilteret er centered i nærheten av 530 nm, ved anbringelse venus-uttrykkende celler.
- I "Spectral Mode", bruker en eksitasjon frekvens på 515 nm i stedet for 458 nm.
5. Ta ublandet Images
- Slå fange modus til "Spectral Unmixing."
- Tilsett spektrale fingeravtrykk av venus og mTFP1 inn i unmixing kanaler (figur 3, Pil-2).
- Sett eksitasjon laseren tilbake til en 458 nm argon kilde.
- Plasser Nesprin-TS visning tallerken over 60X olje målet.
- Etter å fokusere på en fluoriserende celle med tilstrekkelig lys uttrykk, justere styrken og lasereffekt å optimalisere signal-til-støy-forhold.
MERK: Siden FRET effektivitet Nesprin-TS er nær 20%, bør ublandet venus bildet være vesentlig svakere enn ublandet mTFP1 bildet. Når et akseptabelt effekt og forsterkningsinnstilling er bestemt iterativt, må disse parametrene holdes konstant for alle bilder fascinerendforklaret. - Fang et minimum på 15-20 bilder av Nesprin-TS-celler med forholdsvis lik lysstyrke og unngå overdreven pixel metning (alle mettede piksler blir fjernet i løpet av bildebehandlingen).
- Gjenta bildeopptaksprosessen med Nesprin-HL-celler ved bruk av identiske avbildningsparametre.
6. Bildebehandling og Ratio bildeanalyse
- Ved hjelp av open-source ImageJ (FIJI) programvare (http://fiji.sc/), åpne opprinnelige format bilder med BioFormats Reader.
- Pre-prosess bildene og beregne forholdet bildene ved hjelp av tidligere etablerte protokoller 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å følge protokollen ovenfor, ble plasmid-DNA anskaffet fra DNA-arkivet og transformert inn i E. coli-celler. E. coli som uttrykker sensoren DNA ble valgt fra LB / ampicillinplater og forsterkes i en flytende LB-medium. Etter forsterkning av vektorene, ble DNA-plasmider renset inn i Tris-EDTA-buffer ved bruk av en standard, kommersielt tilgjengelig DNA isolasjonskit. Ved hjelp av et spektrofotometer, ble resten renset DNA kvantifisert i en standard konsentrasjon på mikrogram / ml (figur 1A, dager 1-2).
Ved hjelp av NIH3T3-fibroblaster ble cellene dyrket til 70-90% konfluens i en 6-brønn plastcelledyrkningsskål. For å sette inn plasmid-DNA inn i NIH3T3-celler, ble en lipidformidlet plasmid transfeksjon utført. Kommersielt tilgjengelig transfeksjon reagens (se tabell of Materials) ble anvendt som lipid fartøyet for DNA. To gjentak avde Nesprin-TS og Nesprin-HL sensorer ble transfektert inn i 4 cellebrønner (figur 1B). Som forberedelse for FRET avbildning ble enkelt fluoroforen konstruksjonene ifølge mTFP1 og Venus transfektert inn i NIH3T3 celler (figur 1B). Etter transfeksjon ble cellene overført til glassbunn visning retter som er kompatible med høy forstørrelse, invertert confocal mikroskoper.
Før man konfokalt avbildnings, ble en enkel omvendt bred-felt fluorescerende mikroskop benyttet for å bekrefte transfeksjonseffektiviteten. Ved hjelp av et 10X objektiv med en numerisk apertur på 0,25, mange celler i en typisk felt-of-view uttrykte Nesprin-TS (figur 2). Vanligvis sensoren lokalisert rundt kjerneomslaget, i samsvar med den endogene lokalisering av Nesprin-2G 2. Den ikke-kraftstyring sensor, Nesprin-HL, fulgte et lignende mønster uttrykk 2.
Til slutt ble spektralt løst bildestakker importeres til ImageJ open-source programvare for prosessering. Bildene ble pre-behandlet, og forholdet bilder ble beregnet ved anvendelse av etablerte prosedyrer 15.
Figur 1: Eksperimentell Tidsbasert Flow Chart. (A): Man starter med ervervet senseller plasmid-DNA, blir vektorer E. coli transformert med DNA, valgt, og amplifisert (dager 1-2). Fra konsentrert E. coli LB-medium, plasmid DNA isolert og kvantifisert (dag 3). Ved hjelp av rensede DNA-plasmider, blir NIH3T3 fibroblaster transfektert i en seks-brønns format (B) og overført til glassbunn retter som er kompatible med et invertert konfokalt mikroskop (dag 3). For å kontrollere at en transfeksjon blir cellene sett under et vidfelt fluorescent mikroskop utstyrt med det nødvendige filtersett (dag 4). Betinget av en vellykket transfeksjon, blir cellene avbildes på et konfokalt mikroskop utstyrt med en spektral detektor. Ved hjelp av spektral unmixing, blir mTFP1 og venus kanaler adskilt under innhentingen og lagret som spektralt oppløste bildestakker (dager 4-5). Endelig er bildene forhåndsbehandlet i ImageJ, og forholdet-bilder blir beregnet. please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En representant Bilde av transfekterte NIH3T3 fibroblaster. (A) 10X forstørrelse av transfekterte NIH3T3-fibroblaster som uttrykker Nesprin-TS ved hjelp av en GFP filterset. (B) en splittegning av den omgivende boks fra del A. Sensor uttrykk følger kjerneomslaget og ofte strekker seg inn i cytoplasma. (C) Nesprin-TS og -HL Kontroll og hvordan de bindes til aktin og SUN bindende domener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Spectral Fingeravtrykk Veiledning Bruk Confocal Software. Normalisert emisjonsspektra oppnådd fra 20-piksel radier i de markerte områdene Interesse avgrenset av fargede trådkors. (Pil 1) Spectral deteksjonsmodus for å ta bildet. (Pil-2) "Spectral Unmixing" -innstillingen for å legge normalisert spektra i spekterdatabasen. (Pil-3) eksitasjonsfrekvensen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Levende Spectral Unmixing og utgang av Confocal Software. (A) Kritiske avbildningsparametre for å gjengi levende, ublandede bilder. (Pil 1) eksiteringsfrekvensen. (Pil-2) Lever spektral unmixing modus. (B) Cellekjernene bilde i ublandet venus kanal. (
Figur 5: Nesprin-TS FRET forhold bilder i mønstret og umønstret Madin-Darby-hundenyre (MDCK) celler. MDCK-celler som stabilt uttrykker Nesprin-TS ble avbildes på 10 um brede fibronektin linjer (A) eller umønstret polydimetylsiloksan (PDMS) membraner (B). Kjernefysiske membraner ble visuelt maskert og bearbeides til FRET-forhold. Det fargede målestokk søyle representerer FRET forholdet amplitude for umønstrede og mønstrede kjerner.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Behandlet Proporsjonal FRET av bilder fra Nesprin-TS-uttrykkende celler og histogrammet Analyse av Aggregert data. (A) En representativ, normalisert stablet histogram av FRET forholds bilder av Nesprin-TS behandlet med ML7 myosin-inhibitor, fargekodet av enkeltcellekjerner. (B) En representativ, normalisert stablet histogram av FRET forholds bilder av Nesprin-TS behandlet med Calyculin A, en aktivator av celle kontraktilitet. Den legende korrelerer alle analyseres med kjerne til dens plassering på histogrammet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fremgangsmåte og demonstrasjon av levende celle avbildning av mekanisk spenning over Nesprin-2G, et protein som i det kjernefysiske LINC-komplekset, ble beskrevet ovenfor. Forut for dette arbeidet, forskjellige teknikker, for eksempel mikropipette aspirasjon, magnetisk-perle-cytometri, og mikroskopisk laser-ablasjon, er blitt benyttet for å påføre belastning på cellekjernen og for å måle dens bulkmaterialegenskaper 16, 17, 18. Men inntil vår siste arbeid, ingen studier hadde direkte vist at strekkreftene overføres direkte på en LINC kompleks protein i levende celler 2.
Tidligere vårt laboratorium har vist at en modifisert versjon av Nesprin2G, kjent som mini-Nesprin2G, kan konstrueres til å uttrykke et FRET-kraft sonde kjent som TSmod (figur 2C) 2. TSmod ble tidligere vist å måle dynamisk strekk forces i levende celler og i ulike lastbærende proteiner 3, 4, 6, 8. Det ble videre vist at mini-Nesprin-2G kunne ikke skjelnes fra endogen Nesprin-2G med hensyn til dens lokalisering, for å kjente effekt på celleskjelettet, og evnen til å redde atom posisjonering 11, 19. Ved hjelp av den mini Nesprin-2G protein med TSmod (Nesprin-TS), ble det vist at NIH3T3-fibroblaster som uttrykker sensoren ha en baseline spenningsnivå i forhold til Nesprin-HL, som ikke kan bindes til aktin 2. Videre kan modulering av cellulær sammentrekningsevne ved bruk av inhibitorer eller aktivatorer av myosin påvises ved Nesprin-TS 2.
Det finnes en rekke kritiske trinn i denne protokollen. Forvirrende Nesprin-TS med Nesprin-HL (DNA eller uttrykkende celler) er ikke lesingenly detektert, som begge på samme måte lokalisere til kjernemembranen, og vil føre til forvirrende resultater. Siden Nesprin-HL er en no-force kontroll, bør det måles FRET være høyere enn Nesprin-TS i gjennomsnitt. Å være forsiktig, er sekvense isolert DNA konstruksjoner og nøye merking celler anbefales. For det andre er det viktig å nøye optimalisere detektoren forsterkning og lasereffekt på det konfokale mikroskop for å forbedre signal-til-støy-forholdet og for å minimalisere bleking. For korrekt å måle FRET, må disse parametrene forblir konstant under bildeinnlastingen. Videre optimalisere detektoren gevinst eller kraft for svakt eller meget lyse uttrykkende celler ikke er optimal, fordi median uttrykkende celler vil ha en tendens til å falle ut av det dynamiske området for detektoren. Visse celler som uttrykker en høy konsentrasjon av sensoren har en tendens til å fluorescere i nukleoplasma og endoplasmatiske retikulum, noe som gjør det vanskelig å løse kjernemembranen, som er antagelig den mer interessant region med hensyn til FORCE. Merke cellene med litt lavere ekspresjonsnivåer har en tendens til å løse dette problemet på sensoren lokalisering.
Ratiometrisk mens spektral avbildning er en forholdsvis enkel og hurtig måte å måle FRET, gjør det ikke utgangsenheter av FRET effektivitet på grunn av akseptor signal gjennomblødning 20. Uten enheter av FRET effektivitet, er det ikke mulig å omdanne den FRET forholdet indeksen inn en kalibrert kraft måling. På grunn av denne begrensningen, kan bare relative kvantitative force sammenligninger gjøres. FRET effektivitet kan fastslås ved mer kompliserte metoder, for eksempel fluorescens-levetiden avbildningsmikroskopi (FLIM) eller akseptor fotobleking. Absolutt kraft (ved pN-nivå) kan estimeres fra FRET effektivitet, som tidligere beskrevet 3, 8.
I motsetning til tidligere metoder for å måle de mekaniske egenskapene til kjernen eller forskyvning av kjernen baserte on utvendig påførte krefter, som måler den FRET fra Nesprin-TS har fordelen av uten inngrep sentret spenning på en komponent av kjernemembranen 16, 17, 18. Sensoren sender ut et fluorescerende signal som er korrelert med belastningen på de enkelte Nesprin-2G-molekyler. I kontrast, krever mikropipette aspirasjon bruk av delikate verktøy når man jobber med levende celler. Konfokale laserfjerning forårsaker lokal cellulær skade og krever en pulset laserkilde. Magnetisk vridning cytometri overfører krefter på kjernemembranen via celleskjelettet og kan ikke brukes til å måle krefter på spesifikke proteiner, hvis ikke det var for å være kombinert med den Nesprin-2G strekksensor.
Mens det har blitt vist at actin-baserte strekkrefter overføres til Nesprin-2G, en komponent av komplekset LINC, er det fortsatt ukjent hvor mye strekk- eller trykkrefter utøvestil andre strukturelle proteiner LINC, slik SUN-1 eller SUN-2. Det videre arbeidet vil bli rettet mot kloning av FRET-kraft sonder inn i disse antatte bærende LINC proteiner for ytterligere å belyse atom mekanikk med protein-nivå oppløsning. Et annet problem som presenterer seg selv er at endringer i FRET kan være relatert til forandringer i spenning, men snarere gjenspeiler av enten forandringer i Nesprin-2G oligomerisering eller konformasjonsendringer av Nesprin-2G. Forandringer i cellulær pH kan påvirke fluorescensen av sensoren og endre den målte FRET. Den Nesprin-2G HL sensor representerer en god kontroll for noen av disse forandringene (som FRET endringer observert med denne sensoren er mest sannsynlig ikke er relatert til å tvinge), og intramolekylære FRET kontroll-konstruksjoner kan bli utviklet for å vurdere oligomerisering (se nedenfor). I tillegg er ekspresjonen av nesprin-2G TS drevet av en CMV-promoter, noe som resulterer i overekspresjon, og dette høye nivået av ekspresjon kan potensielt forårsake biologiske gjenstander. Nylige fremskritt med clustered regelmessig avstandsplasserte korte palindromiske gjentagelser (CRISPR) har tillatt for homologi rettet reparasjon (HDR) tilnærminger for å sette større DNA-sekvenser inn i genomet 21. Denne tilnærmingen kan brukes for å modifisere endogene Nesprin-2G (eller andre proteiner) for å inkludere TSmod. Dette vil gi ekspresjon av kraftsensoren ved hjelp av passende endogene promoter, noe som reduserer potensialet for høyekspresjonsystemer gjenstander.
TSmod og andre elastisk FRET prober kan også anvendes for å utvikle nye sensorer for andre proteiner, som deretter kan brukes på en lignende protokoll som den som er beskrevet i denne artikkelen. Et stort problem med utviklingen av en ny kraftføler er å bestemme den innvendige innføringsstedet for den FRET sensoren. Først må insersjonsstedet være i en region av proteinet utsettes for mekanisk belastning. Disse områder kan identifiseres ved å kontrollere hvor cytoskeletale forbundet proteiner samvirke med proteinet. For det andre innsettav det store (~ 50 kDa) TSmod må ikke forstyrre den biologiske funksjonen av proteinet som studeres. En tidligere utviklet "mini" form av Nesprin-2G viste at actinbindende CH-områdene broslåtte til sol-bindende KASH domene var tilstrekkelig for Nesprin-2G atombevegelsen i såret monolagene 11, 19, noe som antyder at innføringen av TSmod ville sannsynligvis ikke forstyrre proteinfunksjon. Bekreftelse av den biologiske funksjon av følerens krever et funksjonelt assay for proteinfunksjonen (i, som kan vises kraftsensoren for å redde en spesifikk funksjon i celler tømt for endogent protein). For det tredje, kan endringer i protein oligomerisering forandre FRET mellom proteiner (betegnet intermolekylær FRET 22), noe som ville resultere i FRET endringer som ikke er relatert til å tvinge. En grundig analyse av dette krever ofte spesialiserte inter FRET konstruksjoner som spesifikt rapporterer oligomeriseringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeid ble støttet av Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) og NIH gi R35GM119617 (DEC). Det konfokale mikroskop avbildning ble utført ved VCU nano Karakterisering Kjerne (NCC) Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A.
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
