Summary
Bu protokol, jelatin ve kollajen I'den oluşan bir 2D karışık matristin nasıl hazırlanacağını ve lineer invadozomaları incelemek için bir 3D kolajen I fünyesinin nasıl hazırlandığını açıklamaktadır. Bu protokoller lineer invadozom oluşumunun, matris bozulma aktivitesinin ve birincil hücrelerin ve kanser hücre çizgilerinin invazyon yeteneklerinin incelenmesine izin verir.
Abstract
Hücre yapışması, migrasyonu ve istilası birçok fizyolojik ve patolojik süreçte yer alır. Örneğin, metastaz oluşumu sırasında, tümör hücreleri, kan veya lenfatik damarlara ulaşmak için çevresindeki dokuya istila etmek ve göç etmek için anatomik engelleri aşmak zorundadır. Bu, hücreler ile ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki etkileşimi gerektirir. Hücresel seviyede, kanser hücrelerinin çoğunluğu da dahil olmak üzere pek çok hücre, ECM'yi düşürebilen F-aktin esaslı yapılar olan invadozomlar oluşturabilir. Invadozomlar, matriks metaloproteinazları (MMP'ler) işe alıp aktive eden protrusif aktin yapılardır. ECM'nin moleküler kompozisyonu, yoğunluğu, düzenlenmesi ve sertliği, invadozom oluşumunun ve aktivasyonunun düzenlenmesinde çok önemlidir. İn vitro olarak , bir jelatin testi, invadozom yıkım aktivitesini gözlemek ve ölçmek için kullanılan standart tahlildir. Bununla birlikte, denatüre kolajen I olan jelatin, fizyolojik bir matris değildir eelemanının net. Tip I kollajen fibriller kullanan yeni bir deney geliştirildi ve bu fizyolojik matrisin invadozomların güçlü bir uyarıcısı olduğunu göstermek için kullanıldı. Kollajen fibriller boyunca oluşan invadozomlar, fiberler üzerindeki lineer organizasyonu nedeniyle doğrusal invadozomlar olarak bilinirler. Dahası, lineer invadozomların moleküler analizi, diskoidin alan reseptör 1'in (DDR1) oluşumunda yer alan reseptör olduğunu gösterdi. Bu veriler, hücreler ile ECM arasındaki karmaşık etkileşimleri anlamak için fizyolojik olarak önemli bir matrisin kullanılmasının önemini açıkça göstermektedir.
Introduction
Ekstraselüler matriks (ECM) yeniden şekillenmesi, anjiyogenez ve tümör hücresi invazyonu gibi fizyolojik ve patolojik süreçler sırasında ortaya çıkar. Fizyolojik koşullarda, çoğunlukla hematopoietik soytan gelen birçok hücre türü ECM elementlerini parçalayabilir. Örneğin, makrofajlar dokulara ulaşmak için anatomik engelleri aşabilir ve osteoklastlar kalsiyum homeostazını sağlamak için kemik matriksini parçalayabilir. Daha genel olarak, vücudun tüm matrisleri fiziksel ve kimyasal özelliklerini korumak için yenilenir. Kanser dokularında tümör mikro çevre bileşimi değişir. Örneğin göğüs ve akciğer kanserinde tip I kollajen aşırı eksprese edilir ve tümörün çevresinde birikir. Üstelik bu birikim, metastaz gelişme riski 1 , 2 ile ilişkilidir. Kanser metastazı, kanser hücrelerinin ECM'yi bozma ve bitişik dokuları istila etme kabiliyetine bağlıdır.
Hücrelerin invaziv aktivitesi invadosomes olarak bilinen özel aktin bakımından zengin yapılara atfedilir. Bu terim, normal ve kanser hücrelerinde ( örn., Makrofajlar, endotel hücreleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattı gibi kanser hücreleri) bulunan podozomları ve invadopodiyi içerir. In vitro olarak , invadozomlar farklı şekillerde organize edilebilir: noktalar, agregalar veya rozetler 3 . Klasik olarak, invadozomlar, integrinler ve vinculin 4 gibi adezyon plak molekülleri ile çevrili İskele proteini Tks5 ve kortaktin gibi birkaç protein ihtiva eden bir F-aktin çekirdeğinden oluşur. Son zamanlarda, Tks5 ve RhoGTPase Cdc42'nin fonksiyonel invadozomlar için minimum bir moleküler imza olarak kullanılabileceği gösterildi 5 . Bu yapılar, MT1-MMP ve MMP-2 gibi spesifik metalloproteaz proteinlerinin işe alınması ve aktivasyonu yoluyla ECM'yi bozabilmektedir. Önceki bir çalışmada, tip I kollajen fibrillerin spesifik bir reseptörü olan diskoidin alan reseptörü 1 (DDR1) arasındaki tip I kollajen fibrilleri arasındaki etkileşimin, lineer invadozomlar olarak adlandırılan invadozomların yeni bir sınıfının oluşumuna yol açtığını bildirdik. Doğrusal invadozomlar tip I kollajen fibriller boyunca oluşur 7 . Bu yapılar MT1-MMP / MMP2 alımında ve aktivasyonuyla tip I kollajen fibrillerini bozabilmektedir. Dahası, bunların oluşumu Tks5 ve Cdc42 5'e bağlıdır. İn vitro olarak doğrusal invadozomların varlığını ve DDR1'in oluşum ve aktivitelerine 8 dahil çeşitli matris elementlerinin kombinasyonundan oluşan farklı stratejileri kullanarak gösterdiklerini göstermiştir: i) flüoresan jelatin kaplı lamelleri, ii) flüoresan tip I kollajen fibril Kaplamalı lamelleri ve iii) 3D tip I kollajen fişleri. Farklı matrislerin kullanımı nedeniyle, çalışmak ve karakterLineer invadozom oluşumu ve parçalanma aktiviteleri 7,8.
Son olarak, invaziv hücrelerin biyolojisini daha iyi anlamak için, 2D ve 3D kültür sistemlerindeki tüm ECM bileşenleri kombinasyonu kullanıldı ve tümör mikro çevre bileşiminin karmaşıklığını taklit etti. Aşağıda, 2D ve 3D kültür sistemlerinde jelatin / tip I kollajene sahip lamelleri kaplama protokolleri bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Sabitlemeden önce, tüm basamaklar steril bir laminer akış davlumbazında tamamlanır.
1. 2D matris
NOT: 2B matrisler, invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesini ve hücre başına matris bozunum alanını belirlemek için kullanılır.
Şekil 1: Protokol. Jelatin ve kollajen I matrislerini hazırlamak için kullanılan protokolün özeti. Sadece jelatin matrisi veya bir jelatin ve kollajen I karışık matris yapmak mümkündür. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Jelatin matrisi
NOT: Floresan jelatin matrisleri, matris bozunumunu nicelemek için kullanılır ve floresan olmayan jelatin, kollajen I liflerinin yapışmasını arttırmak için kullanılır. Floresan jelatinli matPirinç podozom ve invadopodia çalışmaları için de kullanılır (bkz. Şekil 1 ).- Steril bir laminer akış kaputunun altında, çalışma alanına bir parça parafilm (20 cm x 15 cm) yerleştirin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin.
- Yaklaşık 1 cm aralıklarla bir çizgi halinde, 1 mg / mL jelatin parçacıkları 20 uL'lik damlacıklar; Damlacık organizasyonu için Şekil 1'e bakın.
- Otoklavlanmış bir cam lamel (çap 12 mm) ile her 20 mcL jelatin damlacık örtün.
- Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Jelatin floresan ise ışığa karşı koruyun.
- Her biri, adım 1.1.3'teki lamellerin hattının yaklaşık 1 cm altında bir aralıkla 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde% 0.5 glutaraldehit damlalıkları 40 uL'lik damlacıklar.
DİKKAT: Glutaraldehit toksik bir sabitleyici maddedir. Eldiven kullanın ve nefes almayın. - Mücevherli forseps kullanarak, her jelatin kaplı lamel bir glutaraldehit damla aktarın.
NOT: BuParafilm üzerinde küçük bir jelatin damlasının kalması normaldir. Bunu başka bir deney için tekrar kullanmayın. - Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Floresan lamelleri için onları ışıktan koruyun.
- 24 yuvalı bir hücre kültürü plakası alın ve steril 1x PBS 500 mcL ile her kuyu doldurun. Lamelleri, jelatin tarafı yukarıya her kuyuya yerleştirin.
- Her biri için 5 dakika boyunca iki kez 1x PBS'de yıkayın.
NOT: Bu adımda, lamelleri deneme için kullanılabilir veya 1 ° C PBS'de 4 ° C'de saklanabilir. Floresansız lamelleri bir hafta boyunca saklanabilir ve floresan lamelleri 48 saat boyunca saklanabilir.
- Fibriler kollajen tip I matris
NOT: Fibriler kollajen tip I matrisi, lineer invadozom oluşumunu ve buna bağlı matris bozunumunu incelemek için kullanılır. Florasan kollajen I ve floresan olmayan jelatin lamelleri bir kombinasyonu, invadozom belirteçlerini kollajen liflerle ( örn., F-aktin i) birlikte yerelleştirmek için kullanılırKırmızı kanala, kırmızı kanalı I kolajenine, yeşil kanalda Tks5'e ve nükleer bir leke için Hoechst boyasına). Öte yandan, floresan olmayan jelatin lamelleri ile floresan olmayan bir kolajenin I kombinasyonu lekelenmiş invadozom belirteçlerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılır ( örn., Kırmızı-kırmızı kanada F-aktin, kırmızı kanada kortaktin, Tks5'de Yeşil kanal ve bir nükleer leke için Hoechst boyası). Son olarak, floresan jelatin lamelleri ile floresan olmayan bir kollajenin bir kombinasyonu, jelatin ile ilişkili bozulmayı ölçmek için kullanılır ( örneğin, kırmızı kanada F-aktin, kırmızı kanada, yeşil kanalda Tks5 ve Hoechst boyası Nükleer bir leke için) (bakınız Şekil 1). Çekirge boyası, çekirdeği leke yapmak için kullanılır ve kullanılan hücre hatlarında düzenli olarak yapılan bir PCR testine ek olarak, mycoplasma kontaminasyonunu kontrol eder.- Floresan kollajen I
- 0.02 N asetik asitte sıçan-kuyruk tendonundan çıkarılan ticari kollajen kullanınd. 0.4 mg / mL kollajen I nihai konsantrasyonunda lamel başına 500 μL solüsyon hazırlamak için gerekli kolajen miktarını geri çekin.
- Kollajen I solüsyonunun nihai hacmi (nx 500 uL) için hesaplanan 10 ug / mL nihai konsantrasyonda 5-karboksi x rhodamin sukkinimidil esteri ilave edin.
- Pipetleme ile yukarı ve aşağı çözümü karıştırın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 1X Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum içeren Fosfat Tamponlu Tuz (DPBS) ile son hacme kadar seyreltin ve doğrudan kullanın.
- Fibrillar collagen I lamelleri
- Daha önce 1.1 adımında hazırlanan floresan veya floresan jelatin lamelleri kullanın.
- Kalsiyum ve magnezyum içeren 1X DPBS'de 0.4 mg / mL son konsantrasyonda floresan veya floresan olmayan bir kollajen I çözeltisi hazırlayın.
- Floresan veya floresan olmayan kollajen I çözeltisi başına 500 μL ekleyin.24 yuvalı bir hücre kültürü plakasındaki lamelleri.
- Kollajen I polimerizasyonu için 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, plakayı eğip matrisin zarar görmesini önlemek için kuyunun (doğrudan lamel üzeri) pipetleme yaparak aşırı kolajen I'i alın.
NOT: Bu matris saklanamaz. Fazla kolajen I çıkardıktan hemen sonra hücreleri tohumladım.
- Floresan kollajen I
2. Hücre ekimi, kültür zamanı ve fiksasyon
- Hücre türüne bağlı olarak, hücreleri uygun kültür ortamında hazırlayın ve göz başına 500 uL'lik nihai hacim için hücreler ekleyin.
- Bir hücre çizgisinin lineer invadozom oluşturabilme ve matrisi bozma kabiliyetini karakterize etmek için lineer invadozom oluşumunun kinetiğini ve bununla ilişkili parçalanma aktivitesini belirlemek için hücreleri plakaları 4 saat, 12 saat ve 24 saat boyunca kollajen I matrisi üzerine yerleştirin.
NOT: Tablo 1 , hücre hatlarının örneklerini içerirLaboratuarda test edilmiştir.
Tablo 1: Hücre tohumlama ve kuluçka süresi referans. Bu tablo, lineer invadozomaları incelemek için kullanılan hücre çizgilerinin kapsamlı olmayan bir listesini sunmaktadır. Matriste tohumlanacak hücre sayısını, doğrusal invadozomları gözlemlemek için gerekli süreyi ve ilişkili matris bozulmasını gözlemlemek için gerekli süreyi belirtir. Doğrusal invadozomların ömrü kısadır. Maksimum sayıda hücrede doğrusal invadozomları gözlemleyebilmek için, hücrelerin kısa bir süre için kollajen I matrisi ile temas halinde olması gerekir. Öte yandan, bildirilen jelatin parçalanmasını görselleştirebilmek için, hücrelerin, yukarıda listelenenlerden daha uzun süre, kollajen I matrisi ile temas halinde olması gerekir.Hücre çizgisi Lamel başına hücre sayısı Lineer invadozom nicelemesi için matriste temas süresi Lineer invadozom bozulma aktivitesinin nicelleştirilmesi için matriste temas süresi MDA MB 231 40.000 4 saat 12 saat Huh7 40.000 12 saat 24 saat HEP 3B 40.000 12 saat 24 saat SNU 398 40.000 12 saat 24 saat NIH 3T3 src 30.000 4 saat 12 saat A431 50,000 6 saat 24 saat A549 40.000 12 saat 24 saat &# 160; ÇİĞ 40.000 12 saat 12 saat PAE 40.000 12 saat 12 saat - Hücre kültür ortamının çıkarılmasından sonra,1X PBS 500 mcL% 4 paraformaldehid 10 dakika lamelleri sabitleyin.
- 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Işıktan korunarak 4 ° C'de saklayın.
3. İmmünofloresans
- Hücreleri, taze hazırlanmış bir solüsyon ile 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin 1x PBS içerisinde% 0.2 Triton X-100 ile yıkandı. Bu çözümü tekrar kullanmayın.
- Lamelleri iki kez 1x PBS ile yıkayın.
- Tezgah üzerine bir parafilm parçası (20 cm x 15 cm) yerleştirin.
- Birinci antikoru, Malzeme Tablosunda açıklandığı gibi 1x PBS içinde% 4 sığır serum albümininde (BSA) seyreltin .
- Herbiri yaklaşık 1 cm aralıklarla birer birer birincil antikor çözeltisinin 50 uL damlacıkları.
- Her lamel bir damla yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun.
- Kuluçka döneminden sonra, iki kez 1x PBS ile yıkayın.
- İkincil antikor, phalloidin ve Hoechst boyasını% 1 BSA içinde 1x'de seyreltinPBS.
- Karışımın 50 uL'lik damlaları, her biri daha önce yapıldığı gibi lamellerin birinci satırının yaklaşık 1 cm altında aralıklarla yerleştirildi.
- Her lamel bir damla yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun.
- Kuluçkadan sonra, iki kez 1x PBS ile yıkayın.
- Tuzları çıkarmak için bir kez distile su ile yıkayın.
- Lamelleri, polimerize edici montaj ortamı olan bir cam slayt üzerine monte edin.
- Lamelleri gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın, mikroskopi öncesi ışıktan koruyun.
4. Nicelikler
Şekil 2: Doğrusal invadozom nicelemesi. Makro, F-aktin ve Tks5 boyanmasının konform görüntülerini gerektirir (format: 1,024 x 1,024). ( A ) Önce, F-aktin resmini açın ve bir maske yapın. ( B ) Daha sonra açıkTks5 resmi ve eşik. Makroyu uygulayın. ( C ) Analiz edilen sonuçlar iki tabloda görünecektir. Hücre başına doğrusal invadozom sayısı ve hücredeki doğrusal invadozomlar tarafından kullanılan yüzdelik alan gibi diğer bilgiler, Özet tablosunda yer alır. Her doğrusal invadozomun boyutu Sonuçlar tablosunda olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Lineer invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesi
- Lineer invadozom oluşturan hücreleri sayın, lamel başına yaklaşık 100 hücre (teknik triplit kullan). N = 3 ile n başına en az 300 hücrenin nicelendirilmesi.
- Üç bağımsız deneyin ortalaması alınarak doğrusal invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesini hesaplayarak, 900 sayılı hücre elde edin.
- Doğrusal invadozom boyutu ve hücre başına sayısı
- Ek makro ile ImageJ'yi kullanın.
- Her durum için üç lamel kullanın.
- Floresan jelatin ve Hoechst lekeli çekirdek lamelleri başına 30 görüntüleri alın.
- ImageJ yazılımını Martin KH ve ark. 9 .
5. 3D Kollajen İşgali Testi
Şekil 3: Invasion assay şeması. İstilâsyon tahlil protokolünün özeti. Kollajen I sukkinimidil ester boya ile çapraz bağlanır ve 1 saat boyunca 37 ° C'de polimerleştirilir. Hücreler serum içermeyen besiyerinde kolajen I eklenir. Ek parça orta ağırlıkta% 10 FBS. Kollajen I fişleri, hücre tohumlamasından 1 saat sonra ve hücre ekiminden 3 gün sonra hücrelerin işgal kapasitesini belirlemek için deneye tabi tutulur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Collagen I fiş hazırlığı
- Hücre türüne göre jel içine işgali kinetiğini belirlemek için ilk deney için 4 saat, 12 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saatlik bir zaman rotası yapın. Her deney için, bir istila olmadığında bir referans zaman noktası olarak 1 saat zaman noktası ekleyin.
- Kollajen I solüsyonunu steril bir laminar akış kaputunun altına hazırlayın. 3 Boyden oda ekleri için 500 μL solüsyon hazırlayın.
- 2 mg / mL kollajen I'in son konsantrasyonu ile bir çözelti hazırlamak için 1 mg ticari rat-kuyruk kollajeni I aspire edin.
- 5-karboksi x Rhodamine suksinimidil esteri,Kollajen I çözeltisinin nihai hacmi için hesaplanan nihai konsantrasyon 1 μg / mL (bu durumda, 500 uL).
- Iyi bir şekilde karıştırın ve ışığa karşı korunmuş steril laminer akış kaputunun altında buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
- Buzla soğutulmuş 50 μL, süzülmüş 10X PBS ve buz soğukluğunda 1 M sodyum hidroksit (NaOH) 6.25 μL ekleyin.
- 443.75 - x mcL kollajen I formülüne göre steril su ekleyin.
- Boyden oda girişi başına 100 μL çözelti ekleyin.
- Polimerizasyona izin vermek için 1 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
- Yeni kuyucuklara fetüs sığır serumu (FBS) ile zenginleştirilmiş hücre kültürü ortamı ekleyin; Ek yerleri bu kuyulara yerleştirin.
- FBS içermeyen ortamda kolajen I'in üzerine 30.000 hücre tohum ekti.
- Hücreleri 37 ° C'de kültürledikten sonra, kollajen I fişi, 1x PBS içerisinde% 4 paraformaldehit içinde 30 dakika sabitleyin.
- Aşama 3'de olduğu gibi komple immünofloresans, aşağıdaki adımlar haricinde: permeabiliZe 10 dakika değil 30 dakika için 1x PBS içerisinde% 0.2 Triton X-100 ile; Primer ve sekonder antikor çözeltileriyle sırasıyla 40 dakika ve 30 dakika yerine 1.5 saat inkübe edin. F-aktin veya hücreleri lokalize etmek için çekirdekler lekeli.
- İmmün floresans sonrasında, eklentinin membranını kesmek için bir neşter kullanın ve kollajen I fişini bir cam altı tabağa aktarın. Kolajen I fişinin üst kısmının camla temas ettiğinden emin olun. Tapanın bütünlüğünü korumak için insert membranı kolajen I tıpasının altına tutun.
NOT: Cam tabağında kolajen I fişi kalır. Cam tabanı ve cam tabanı çevreleyen plastik arasındaki derinlik, tapanın kalınlığına eşdeğerdir. - Takılan kollajene lamel yerleştirin ve tıpanın kurumasını önlemek için polimerize edici montaj ortamı ile monte edin.
- Taktığım kolajeni imgelemek için ters konfokal mikroskop kullanın; Üst kısmıTıpa tabağın cam altıyla temas halindedir.
- Hücrenin istilasını görselleştirmek için üstten alttan kollajen I fişine bir z-yığıtı bulun. Hücrelerin görüntüleme alanını ne kadar derine işgal ettiğini inceleyerek z-yığınının kalınlığını belirleyin. Z-adım boyutu 0.25 μm olan 512 x 512 formatında 40X yağ hedefi ile satın almalar yapın.
NOT: Referans için, tohumlamadan 3 gün sonra MDA-MB-231 hücreleri için ortalama z-yığını 30 μm'dir.
- Hücrenin istilasını görselleştirmek için üstten alttan kollajen I fişine bir z-yığıtı bulun. Hücrelerin görüntüleme alanını ne kadar derine işgal ettiğini inceleyerek z-yığınının kalınlığını belirleyin. Z-adım boyutu 0.25 μm olan 512 x 512 formatında 40X yağ hedefi ile satın almalar yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki tip matris, jelatin ve tip I kollajen kombinasyonunu kullanarak ( Şekil 1 ve 4 ) doğrusal invadozomlar olarak bilinen yeni bir invadozom türüne dikkat çektik. Bu matrislerin etiketlenmesi, kollajen I lifleri boyunca doğrusal invadozom oluşumunun gözlemlenmesine ve bozunma kabiliyetlerine izin verir ( Şekil 5 ). Daha sonra invazif yapıların sayısı, daha önce açıklanan makro (adım 4.2) ile nicelleştirilebilir ve degradasyon aktivitesi, Martin ve ark. Tarafından tarif edildiği gibi ImageJ yazılımı kullanılarak da belirlenebilir . Ve Diaz ve diğ. 9 , 10 . Karışık matris, doğrusal invadozom oluşum ve işlevselliği için gerekli olan reseptör olarak DDR1'i tanımlayarak doğrusal invadozomların karakterize edilmesine olanak tanır ( Şekil 6 ).
Şekil 3 ve 7 ). Bu tahlil, z-yığını rekonstrüksiyonlarını kullanarak, kollajen I fişine işgal eden hücrelerin sayısını ve seyahat edilen mesafeyi belirlememizi sağlıyor.
Şekil 4: Konfokal mikroskopi kullanılarak jelatin ve jelatin-kollajen I karışık matrislerin karşılaştırılması. Şematik olarak, üst paneldeki floresan jelatin lamelleri organizasyonunu gösterir. ( A ) Konfokal z-yığını yeniden yapılandırması, flüoresan jelatin matrisinin lamelin tüm yüzeyini kaplayan ince, tek biçimli bir tabaka oluşturduğunu gösterir. ( B ) Karışık matriste, lamelleri üzerinde flüoresan jelatin biriktirdikten sonra, tip I kollajen fibrillerÜstte polimerize edin. I fibriller kollajeni kırmızı renkte boyanmıştır. Kolajen I matrisi lamel üzerinde kalın ve heterojen. Kollajen I liflerinin dağılımı kolajen Iα zincirlerinin polimerizasyonuna bağlıdır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Jelatin ve jelatin-kollajen I matrislerinin invadozom oluşumu ve aktivitesi üzerindeki etkisi. Bu testler için kullanılan hücreler MDA-MB-231 meme kanseri hücreleridir. ( A ) Bir şematik gösterim, üst paneldeki floresan jelatin lamelleri üzerine ekilen hücreleri göstermektedir. Bozulma alanları flüoresan azalması nedeniyle siyah renkte görüntülenir. Tks5 boyaması bir invadozom markörü olarak kullanıldı. Jelatin üzerinde, invBu biçimdeki adosomlar noktalı olarak düzenlenmiştir. ( B ) Şematik bir gösterim, jelatin ve kollajen I'in karışık bir matrisine ekilen hücreleri gösterir. Kolajen I kırmızı renkte etiketlenmiştir; Tip I kollajen fibriller ilavesi, hücrenin jelatin parçalanma yeteneğini arttırır. İlginç olarak invadozom belirteç Tks5 yeniden düzenlenir ve noktalar lineer invadozomları temsil eden lineer yapılarla değiştirilir. Bozulma alanları flüoresan azalması nedeniyle siyah renkte görüntülenir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Jelatin ve karışık matris koşullarında moleküler kompozisyon ve invadozom organizasyonunun konfokal mikroskopik analizi. ( A ) gElatin durumu, invadozomlar noktalar halinde düzenlenir ve F-aktin (kırmızı) Tks5 (yeşil, alt panel) ile birlikte bulunur, ancak DDR1 (yeşil, üst panel) ile birlikte lokalize olmaz. Bunlar klasik invadozomlar. Ölçek çubukları = 5 μm. ( B ) Jelatin-kollajen I karma-matriks koşulunda DDR1 (yeşil, üst panel) kollajen I fibrilleri (kırmızı, üst panel), Tks5 (yeşil, alt panel) ve F-aktin (kırmızı, alt) ile kolokalize olur panel). Tip I kollajen fibriller doğrusal invadozomların oluşumuna neden olur. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Bir kollajen I fişinde MDA-MB-231 hücrelerinin hücre invazyon testi. Hücreleri tohumladıktan 1 saat sonra, kontrol ekleri sabitlenir ve boyanır. ( A ) z-stack aKonjokal mikroskopi kullanılarak kolajen I fişinin kazanılması gerçekleştirilir. Hücreler, bu noktada kollajen I'i tıkamıyor; Aksine, taktığım kolajenin üstünde kalırlar. Böylece, bu, herhangi bir istila oluşmadığında kontrol noktası olarak kullanılır. MMP aktivasyonu, hücrelerin bu yoğunlukta bir kollajen I fişini istila etmeleri için gereklidir. ( B ) Ekimden üç gün sonra, bazı hücreler, fişi takılan kollajen I'i istila eder. Bu test hücre invazyonunun gözlemlenmesi ve miktarının belirlenmesine izin verir. Buna ek olarak, örneğin, çeşitli ilaçların veya siRNA'ların etkisini incelemek için kullanılabilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klasik olarak, invadozomlar, mikro ortam ve hücrelerin kaplandığı matrise bakılmaksızın in vitro olarak incelenir. Şu anda, jelatin, fibronektin, vitronektin veya yüksek yoğunluklu fibriler kollajen (HDFC) 7 , 11 dahil çeşitli matris türleri kullanılmaktadır; Bununla birlikte, bunlar genellikle hücrelerin bulunduğu mikro çevreyi temsil etmez ve fizyolojik olarak uygun değildir. Burada, jelatin ile fibriler tip I kollajen arasındaki ilişkiden oluşan yeni bir matris tipi kullanıldı. I tipi kollajen fibrillerinin kullanımı, lineer invadozomlar olarak bilinen, özellikle fizyolojik mimarisinde 7 kolajeni oluşturan invadozomların yeni bir sınıfını vurgulamamızı sağlar. Kolajenin etiketlenmesi, lifler boyunca doğrusal invadozomaları gözlemlememize ve Tks5 ve kortaktin gibi hücresel belirteçleri kullanarak bunların oluşumunu nicelleştirmemize izin verir. Mi'yi kullanmaXed matriksinde doğrusal invadozomların oluşumunda rol alan diskoidin alan reseptörü 1 (DDR1) yeni bir reseptör tespit ettik.
2D karışık matris, doğrusal invadozomların matriks bozunum aktivitesini zimografi in situ tahlil yoluyla nicelleştirmemizi sağlar . Bu analiz flüoresan jelatin katmandaki kara deliklerin varlığını analiz ederek MMP'lerin proteoliz aktivitesini bildirir. İlginç olarak, doğrusal invadozomlara F-aktininin düzenlenmesi, jelatin-sadece 7'ye kıyasla matris bozunum aktivitesini arttırmaktadır. Bu deneyin bir kısıtlaması, jelatinin fizyolojik olmayan bir matristir ve daha fizyolojik bir matrisin, mikro çevreye verilen hücresel tepkiyi değiştirdiğini göstermiştir. MMP aktivitesinin jelatin-kollajen I karışık matrislerinde nicelleştirilmesi yolunda ek bir sınırlama vardır. Sadece kollajen I fi'nin altında lokalize olan jelatin parçalanmasıParlak katman sayılabilir; Bu nedenle, bu, kollajen I matris bozunmasını niceleştirmek için dolaylı bir yöntemdir. Lineer invadozomların bozunma aktivitesini görselleştirmek için alternatif bir yöntem, kollajen I liflerinin kolajen bölünme bölgelerine (Col1-3 / 4 C immünoglobulin) karşı spesifik bir antikorla etiketlenmesidir. Bu, parçalanmış liflerin immünofloresan ile görselleştirilmesine olanak tanır. Bununla birlikte, hücre göçü nedeniyle, bu antikor 2B'de lineer invadozom oluşumu nedeniyle parçalanma için çok spesifik değildir. Kollajen I liflerinin bozunma aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için başka bir yol, çok ışıklı mikroskopi ve ikinci harmonik nesil kullanmaktır. Bu yöntem, herhangi bir boyama olmadan kollajen I liflerinin görüntülenmesine izin verir.
Tip I kollajeni polimerize etme yöntemimiz, literatürde kullanılan diğer yöntemlere kıyasla farklıdır 12,13. Örneğin, Artym Hücrenin invazyonunda doğrusal invadozomların katılımını incelemek için 3D kollajen I fişi testi kullanıldı. 3D kollajen I fişi, invaziv yapıları veya metalloproteinazların invazyon sürecine katılımını incelemek için bilim camiasında zaten kullanılmıştır 14 , 15 , 16 . Bu tür 3D matrisler,R sertliği-örneğin 3D kolajen I fişi 2D matristen daha katıdır. Dahası, kollajen I'in tipi ve kökeni, in vivo kollajen liflerinin farklı organizasyonu ile ilgili olarak da önemlidir 17 . Son olarak, in vivo mikro çevre kompozisyonu ile ilgili olarak, hücre dışı matriksin sadece bir elemanı, tip I kollajen üzerinde durulmuştur. İn vivo doğrusal invadozomların önemini belirlemek için ileri çalışmalar gereklidir. Lineer invadozomların çalışmasına ek olarak, burada açıklanan karışık matris, fibronektin, vitronektin ve diğer kolajenler tipleri ( örn., Tip IV kolajen) gibi diğer matris bileşenleri tipleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, ilgilenilen matris elemanlarının tiplerine ve incelenecek proseslere bağlı olarak uyarlanabilir. Bununla birlikte, karmaşık ve fizyolojik matrislerin üretilmesinin,Hücre tutunması, göç ve istila ile ilgili yollar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
JDM, INSERM / Région Aquitaine'den bir doktora bursuyla desteklendi ve artık doktora sonrası ARC bursu ve Mount Sinai Tıp Fakültesi'ndeki Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. EH, Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche'den bir doktora tarafından desteklenmektedir. ZE, Agence Nationale de la Recherche'den (ANR) doktora sonrası bir burs tarafından desteklenmektedir. CM, Mount Sinai Tıp Fakültesi'ndeki Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir ve JJBC, NIH / NCI hibe K22CA196750, TCI Genç Bilim İnsanı Kanseri Araştırma Ödülü JJR Fonu ve Mount Sinai Tıp Fakültesi'nde Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, ANR-13-JJC-JSV1-0005'den bir hibe ile desteklendi. FS, "Ligue nationale contre le cancer" tarafından desteklenmektedir. VM ve FS, "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" ve Institut National du Cancer, INCA_8036 ve PLBio2012 fonlarıyla desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
