Protocol
재료 및 문화 매체의 1. 준비
- SCZ의 해부와 해리를 들어, 알루미늄 호일로 뇌 매트릭스, 양날 면도날, 그리고 집게를 포장 한 다음 고압 증기 멸균하여 그들을 소독.
- 전체 마우스 뇌를 씻어 차가운 PBS 버퍼 50 ㎖를 준비합니다.
- 해부 현미경을 설정하고 뇌 (멸균 가위와 집게)의 해부에 필요한 수술 도구와 SCZ (1 ML의 주사기, 30 G 바늘, 뇌 매트릭스, 및 미세 집게)의 분리를 준비합니다.
- N2 매체의 제조 :
- F-12 / DMEM (+ L - 글루타민, + 탄산 수소 나트륨) 2 % B27, 1 % N2 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 매체를 준비합니다.
주 : 성장 배지는 N2 배지 및 성장 인자로 구성 (20 NG / ㎖의 정제 된 표피 성장 인자 (EGF), 20 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF2)).
- F-12 / DMEM (+ L - 글루타민, + 탄산 수소 나트륨) 2 % B27, 1 % N2 보충, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 매체를 준비합니다.
- 소화 버퍼를 준비합니다 (40 단위 / ml의 파파인, 2.4 단위 / ㎖ dispas전자 II, 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 PBS에서) 조직 소화.
- 코팅 플레이트 및 커버 슬립의 제조 :
- (0.01 % PLO) 및 라미닌 (DH 2 O에 용해 10 ㎍ / ㎖) 폴리 -L- 오르니 틴을 준비합니다. 단층 또는 면역 염색 18 밀리 된 커버로 SCZ-aNSCs의 유지 보수를 위해 코트 6 웰 플레이트, 4 ℃에서 하룻밤 PLO으로 그들을 품어. 그런 O.는 판과 커버 슬립 마지막 세척 후 건조하도록 허용 DH 2로 3 회 씻는다.
- 다음으로, 하룻밤 4 ℃에서 라미닌과 번호판을 품어. 그런 다음, DH 2 O.로 3 회 세척
주의 : 세포 부착에 영향을 미칠 것이다, 라미닌을 건조하지 마십시오.
주 : 코팅 용액을 3 번 재사용 될 수있다.
2. 분리 및 성인 SCZ의 해리
- 문화 준비하기 전에, 얼음에 뇌 매트릭스와 양날 면도기를 배치합니다.
참고 : 뇌 행렬을 동결 BR 때문에하지 마십시오아인은 부착 할 수있다. - CO 2 질식 또는 자궁 전위에 의해 (8 주 이전) 마우스를 희생.
- 70 % 에탄올을 분사 한 후 날카로운 가위로 머리를 잘라. 머리를 고정하기 위해 단단히 머리의 양쪽을 잡고. 꼬리 - 주동이의 방향으로 중간 선에서 가위로 피부를 잘라. 이것은 두개골에서 피부의 완전한 제거를 촉진한다.
- 지느러미 중간 선 위치에서 두개골과 뇌 사이의 집게를 삽입 먼저 두개골 (람다에 후부)의 꼬리 부분을 제거하고. 왼쪽 (또는 오른쪽) 정수리 뼈를 잡고 조심스럽게 벗겨. 다른 정수리 뼈의 제거에 대해이 절차를 반복합니다.
참고 : 시신경과 뇌의 수막 제거의 단선이 쉽게 두개골에서 뇌를 분리 할 수 있습니다. - 차가운 PBS 버퍼 (25 ㎖)에 뇌를 전송하고 여분의 혈액을 제거하기 위해 두 번 씻어.
- 얼음과 엄마의 뇌 매트릭스로 뇌를 배치KE 관상 삭감 1mm 두께의 슬라이스를 얻었다. 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 차가운 PBS로 뇌의 후방 부에 위치하는 SCZ 영역을 포함하는 뇌 조각 (1mm)으로 옮긴다.
주의 : 뇌 균열이 뇌 매트릭스의 중심선에 배치되도록, 관상 부의 평행 평면을 얻기 위해; 이 부분에서 불필요한 변형을 방지하는 것이 중요합니다.
참고 : 브레 그마에 2-3mm 후방에서 뇌 조각을 얻습니다; 이것은 SVZ에서 SCZ의 분리를 허용한다. - 저배율로 해부 현미경, 절곡 30G 바늘 6,9와 피질 및 해마의 백질 영역으로부터 SCZ를 마이크로 - 해부. 그런 다음, SCZ 위의 피질 영역을 제거합니다. 차가운 PBS없이 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 슬라이스의 해부 SCZ 영역을 배치합니다.
주 : 성숙 뉴런을 포함하는 여분의 영역의 오염 및 aNSCs neurosphere 형성 B의 생존에 영향을 미칠 수있는ecause 그들은 aNSC 배양 조건에서 세포 사멸을 겪는다. - 구부러진 30 G 바늘을 사용하여 즉시 작은 조각으로 해부 조직을 잘라.
주 : 긴 시간이 SCZ 조직을 절개 필요한 경우 초핑 전에 차가운 PBS의 해부 조직 몰입. - 다시 일시 분해 완충액 1 ㎖와 다진 조직을 분해 완충액 2 ml를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 조직을 전송하고, 37 ℃ 수조에 30 분 정도 배양한다.
참고 : 잘 혼합 튜브마다 10 분 흔들어.
3. 뇌량 밑 영역에서 파생 된 성인 신경 줄기 세포 배양
- 소화 조직을 떼어 놓다 약간 튜브를 누른 다음 5 분 동안 145 XG에 튜브를 원심 분리기. 소화 버퍼 씻어 예열 N2 배지 1 ㎖로 상등액 재현 탁 분해 된 조직을 폐기하고, 부드럽게 검액에게 P1000 피펫을 사용하여 5 회 최대 피펫.
참고 : 오버 분쇄하여 좁은로피펫 팁은 세포 생존 및 후속 성장을 감소시킬 수있다. - 5 분 동안 145 XG에서 튜브를 원심 분리기. 상청액을 폐기 한 후, N2 배지 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시.
- 비 코팅 된 6- 웰 플레이트에 N2 배지 1 ㎖를 제조하고이 용액의 최종 부피를 위해 현탁 한 세포를 가하여.
- 각 웰에 EGF (20 NG / ㎖)과의 bFGF (20 NG / ㎖)를 추가합니다. 부드럽게 도금 셀에 추가 성장 인자를 혼합하여 손으로 6 웰 배양 접시를 흔들. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 6 웰 플레이트를 유지합니다.
- 팔일 동안 매일 각 웰에 EGF (20 NG / ㎖)과의 bFGF (20 NG / ㎖)를 추가합니다. 모든 세 번째 날, 배지의 대략 2 mL의 부피를 유지하기 위해 N2 배지 200 μl를 추가한다.
neurosphere를 같이하고 단일 플라이 문화에 NSCs의 4.과 Passaging
- neurosphere를 수집하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송.
참고 : neurosphere를 수 (> 50 μm의 직경) 체육를물론 한 번의 마우스 뇌의 SCZ에서 r은 SVZ의보다 작은 64.3 ± 7.31이었다 (190.5 ± 6.33) 9. - 하나의 세포로 neurosphere를을 해리 37 ° C의 물을 욕조에 5 분 해리 버퍼의 0.5 ml의와 neurosphere를 품어. 기본 neurosphere를 단일 세포로 해리와 neurosphere 또는 단일 층 문화 등 여러 통로를 통해 유지 될 수있다.
참고 SCZ-aNSCs가 neurosphere 배양 형식 단층 배양 포맷> 10 배이지만 <5 회 계대 수 있기 때문에 단층으로 SCZ-aNSCs neurosphere를 확대하여 우수하다.
주의 : SCZ-aNSCs 강한 응집을 나타내고, 하나의 세포로 해리를하기 어렵다. 따라서, neurosphere 문화 형식은 일상적인 세포 확장하지 않는 것이 좋습니다. - 부드럽게 5 분 동안 145 XG에 위 아래로 P1000 피펫 미만 5 회 원심 분리 튜브를 시료 용액을 피펫. 상층 액과 다시 스와 폐기N2 배지 1 ㎖로 neurosphere를 쓴다.
참고 : 세포 생존과 이후의 성장을 감소 할 수있는 좁은 피펫 팁으로 분쇄하여 이상. - 세포 현탁액 (10 μL) 및 0.4 % 트리 판 블루 용액을 1 혼합물, 다음에 hematocytometer를 생균 수를 계산 : 세포를 계산하는 일을 만든다. PLO / 라미닌 6- 웰 플레이트를 코팅 한 후, 각 웰에 대한 N2 배지 2 ml를 2.5 × 105 세포 / ml의 세포를 접시.
참고 : 세포 밀도의 변화가 자신의 상태 및 분화 가능성에 영향을 줄 수 있습니다. - 오일에 대한 성장 인자의 매일 치료 SCZ-aNSCs (2 ㎖, 20 NG / ㎖)을 유지하고, 이들 통로들을.
뇌량 밑 영역에서 파생 된 성인 신경 줄기 세포의 분화 (5)
- SCZ-aNSCs의 분화 성장 인자와 함께 1 ml의 N2 (20 NG / ㎖) 1 × 105 세포 / ml와 PLO / 라미닌 코팅 18mm 커버 슬립 위에 평판 aNSCs.
- 다음날,세포가 단단히 커버 슬립에 부착 될 때, 성장 인자를 제거하기 위해 N2와 함께 성장 배지를 교환한다.
- 6일 후, 세포 파편을 제거하고 면역 그들을 수정 PBS 1 ㎖에 분화 세포를 세척 하였다.
주 : BrdU의 증식은 세포의 신규 합성 DNA에 혼입 될 수있다. 필요에 따라서, BrdU의 (10 μg의 / ㎖) 세포를 고정하기 전에 세포 살에 첨가 될 수있다.
6. 면역 염색 성인 신경 줄기 세포와 차별화 된 전구 세포
- 면역 염색을 위해, PBS로 세포를 세척하고, 실온에서 20 분 동안 4 % PFA로 고정합니다.
주의 : PFA는 매우 독성; 피부와 눈에 접촉을 피하십시오. - 의 4 % PFA를 제거 PBS로 3 회 고정 된 세포를 씻어 후 4 ° Cuntil가 면역 염색에 필요한에 저장합니다.
- (3 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100, 1X P 용액을 차단하여 커버 슬립에 세포를 부화실온에서 적어도 30 분 동안 BS).
- 신선한 차단 솔루션의 기본 항체를 준비하고 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어.
- aNSCs를 면역 염색
- 안티 네 스틴 및 BrdU의 항 - 항체를 사용 aNSCs 얼룩. 고정하기 전에 aNSCs에 BrdU의 20 μg의를 추가하고 2 시간 동안 그들을 품어. 차단 단계를 수행하는 37 Cbefore에서 20 분 동안 2 N 염산을 사용하여 변성 단계를 수행합니다.
- 차별화 된 전구 세포를 면역 염색 :
- 차별화 된 전구 세포에 라벨을 방지 O4, 안티 bIII - 튜 불린, 및 안티 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 항체를 사용합니다.
- aNSCs를 면역 염색
- PBS로 3 번 샘플을 세척하고, 형광 염료 (1 : 500)에 접합 된 이차 항체로 배양 한 30 분 동안 실온에서 용액을 차단한다. 그런 다음, PBS로 샘플을 3 회 반복한다.
참고 : 차의 호스트와 일치를 사용하여 이차 항체를항체. Hoechest33343 (1 : 2000)은 핵 염색에 사용됩니다. - 슬라이드 글라스에 장착 솔루션을 추가하고 설치를 진행합니다. 여러 파장에서 공 초점 현미경에 샘플을 관찰하고 이미지 : FITC (488 나노 미터)를 Cy3 (543 ㎚), Cy5에 (647 ㎚), 및 Hoechest33343 (405 nm의).
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Representative Results
알 수없는 신경성 지역에서 aNSCs을위한 문화 시스템을 정의하는 것은이 세포를 이해하기위한 뇌 수리 (12)에 자신의 잠재적 인 사용을 개발하기위한 필수적이다. 다른 발달 단계에서 또는 다른 지역에서 NSCs을 다르게 3,4 행동 것으로 알려져있다. 최근에는 SCZ 유래 세포는 SVZ 유래 세포 7-9에 비해 생체 내 및 시험관 내에서 신경 세포의 분화, 차동 전위를 나타내는 것으로보고되었다. 따라서 정확하게 각 신경성 영역을 분리하기 위해 상기 SCZ 포함 뇌 조각은 1mm 뇌 매트릭스 (도 1A)를 사용하여 절개 하였다. 성장 인자와 함께 배양 8 일 후, SCZ로부터 유도 aNSCs는 세포이어서 (도 1b)를 유지할 수있는 neurosphere를을 형성 할 수있다.
neurosphere를에 NSCs의 서브 세트가 될 수 있기 때문에 SPOntaneously 단층 배양 시스템은 또한 SCZ-aNSCs의 비교적 균일 한 인구의 유지 보수를 위해 도움이된다, (13) 차별화. 성장 인자 및 트립신으로 분해 효소 쉽게 neurosphere 14, 15의 깊은 내부에 침투하지 않습니다. 단층 문화 NSCs의 확장에 더도 조건을 제공합니다. 기본 neurosphere를에서 SCZ-aNSCs는 소화 버퍼 처리하여 단일 세포로 분해되었다. 어느 날 세포 파종 후, aNSCs는 코팅 된 플레이트와 전시 세포 증식 (그림 2A)에 부착 하였다. 확산의 자신의 힘을 확인하려면 BrdU의 미디어에 추가되었습니다. 2 시간 동안 BrdU를 배양 한 후, 세포를 용이 SCZ-aNSCs 활발히 증식 및 주요 특성을 유지하고 있음을 나타내는, 항 BrdU의 (증식 마커), 항 네 스틴 항체 (신경 줄기 세포 마커) 염색 하였다 줄기 세포 (도 2B). 따라서, 그들은 EXH하지 않았다아이 비트 차별화 된 (일시적으로 증폭 세포에서 발현) 같은 EGFR과 같은 세포 및 (neuroblasts로 표현) DCX (그림 2C)에 대한 마커.
SCZ-aNSCs의 다수의 분화 잠재력을 확인하기 위해, 성장 인자를 배양 배지에서 제거 하였다. 육일 후, 세포는 분화 된 세포에 대한 다양한 업체와 면역 염색 하였다. 사용 된 다른 aNSCs의 자손, 마커 신경 세포에 대한 (Tuj1), 성상 교세포 (GFAP), 및 희소 돌기 아교 세포 (O4)를 전시하는 단계; 이들 세포 유형은 모두 SCZ-aNSCs에서 (도 3)을 생성 하였다.
그림 1 : neurosphere의 SCZ 영역 및 형성의 분리. 성체 마우스의 뇌에서 SCZ 영역의 해부 (A) 절차. 문화 SCZ-내지 An희주는 8 주령의 마우스의 뇌는 뇌 매트릭스 (1mm 간격)에 배치됩니다. (빨간 점선) 해부 된 SCZ 영역 (브레 그마 2-3mm)를 포함, 1mm의 뇌 조각을 절편 후. (B) Neurosphere 형성. 체외 문화, 차 neurosphere를 (통로 0) 이후 여덟 일을 형성하고 계대 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 단일 층 문화와 SCZ-aNSCs의 유지. (A) 해부 세포를 파종 후 어느 날, SCZ-aNSCs 부착 및 단층 방식 (왼쪽)에 코팅 된 요리로 확장되었다. 사흘 유지 후 SCZ-aNSCs의 수 (오른쪽) 증가 하였다. (B)의 BrdU (빨강, 세포 증식 마커), 네 스틴 (녹색, 신경 줄기 세포 마커) 및 Hoechest33343 (블루, 핵에 대한 마커)에 면역 염색. 신경 줄기와 면역 염색 (C) / 전구 세포 마커 네 스틴 (빨간색, B 형 신경 줄기 세포 마커), EGFR (녹색, C 형 과도 증폭 세포 마커), 및 DCX (파란색, A 형 마커 neuroblasts). 핵은 Hoechest33343 (흰색)으로 대조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : SCZ-aNSCs에서 분화 된 세포의 면역 염색. 분화 마커 Tuj1 (녹색, 미성숙 신경 세포 마커), O4 (빨강, 희소 돌기 아교 세포 마커), 및 GFAP와 면역 염색하면 (소리흐름, 성상 세포 마커). 확대 이미지는 세트로 표시됩니다. Hoechest33343 (파란색) 카운터 오염성 핵 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 논문은 성인 마우스 SCZ에서 NSCs의를 생성하는 다양한 응용 프로그램을 유지하기 위해 상세한 프로토콜을 설명합니다. SCZ-NSCs을 정화하고 확장하는 데 필요한 체외 배양 시스템을 구축하기위한 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, SCZ 영역 정확하게 다른 잠재적 신경성 영역 (도 1b)로부터 절개하는 것이 중요하다. SCZ 영역을 포함하는 두꺼운 정확한 섹션은 1mm 간격 뇌 매트릭스 수득 한 후, 미세 바늘이 다른 피질 영역 (도 1a)에서 SCZ의 미세 절개에 사용되었다. 비 NSCs의는 대뇌 피질과 같은 인접 조직에서 SCZ-aNSCs와 함께 배양하면, 치명적인 죽음에 부정적인 가능성 및 SCZ-NSCs의 16-18,22 분야 형성에 영향을 발생합니다. 꼬리 SCZ (정수리 2-3 밀리미터 후방)는 별개 SCZ-aNSCs를 생성하기위한 최선의 영역으로 확인되었다. 둘째, approp채취 및 계대 단계 riate 효소 처리는 세포의 높은 수율을 달성하는데 중요하다. 디스 파제 II와 파파인은 트립신보다 aNSCs을 분리하는 더 효과적이었다. 해리 버퍼 대신 트립신 계대에 대한 세포의 분리는 생존 (19)을 강화. 피펫과 기계 분리 및 분쇄 최소화해야한다. 셋째, 셀 스트레이너는 일반적으로 조직을 분해 한 후 세포 파편을 제거하기 위해 일차 배양 시스템에서 사용된다. 그러나 SCZ-aNSCs의 국산화로 인해,이 세포는 효소 소화와 기계적 분쇄에 의해 흰색 물질의 파손 후 얻을 수있다. 세포 여과기 여과 중에 세포의 상당한 양이 손실 될 것이다. 따라서, 셀 스트레이너를 사용하지 않고 SCZ-aNSCs를 배양하면 세포의 높은 수율을 얻을 수있는 좋은 방법입니다.
neurosphere 문화와 단층 문화 모두 NSCs을의 유지, 신경의 한 제한을 적용 할 수 있지만,구 문화는 분할 무작위로 집계 할 수 있습니다 후 단일 NSCs의이 해리 것입니다. neurosphere를 다른 크기의 집계 결과. neurosphere의 크기가 특정 임계 값에 도달하면, neurosphere 인해 코어 (20)에서 영양 부족, 성장 인자, 및 산소로 이종 구조로 성장한다. 또한, 큰 크기 neurosphere를 쉽게 분리 완충액으로 해리되지 않고 낮은 세포 생존에 이르는 광범위한 기계적 분쇄와 이상 효소 처리 시간을 필요로한다. 따라서, 단층 배양 시스템은 복수의 통로를 통해 SCZ-aNSCs를 유지하도록 권장한다. 단층 배양 시스템에서 aNSCs 안정적 같은 조상 (타입 C와 A) (도 3a)와 같은 특정 세포로 분화없이 자발적 NSCs의 (유형 B)으로 유지된다. SCZ-aNSCs은 오랜 기간, 단층으로 <A neurosphere 형식의 5 구절과> 10 구절에 대한 계대 하였다. 이 단점입니다단층 배양 시스템은 장기 배양 21 시험관 NSCs의 제안을 유지 이전 결과와 istent. 그러나, 증식 속도는 감소하고 죽는 세포의 일부는 통로 (5) 이상 증가 하였다. 확장 계대가 능성 증가 염색체 이상 (22)와 신경 세포의 분화에 영향을 미칩니다. 따라서, 연장 된 계대 효과를 방지하기 위해서는 증식 및 분화를 분석 초기 통로 (<통로 5) 세포를 사용하는 것이 권장된다. SCZ-aNSCs의 자기 갱신의 가능성이 SVZ-aNSCs과 유사하지만, 덜 신경 세포의 분화는 SCZ-aNSCs 9에 나타내었다.
SVZ 및 치아 이랑 (DG)을 포함하여 성인 뇌의 신경 인성 영역에서 aNSCs를 분리하는 방법은, (22)를 설립했다. 이러한 프로토콜은 분리 및 체외에서 aNSCs의 재배를 추진했지만, 높은 수를 얻기 몇 가지 제한 사항이 있습니다세포. 대부분의 프로토콜은 마 과정에서 뇌 조직의 손실을 야기 할 수있는 뇌 조직 초퍼를 이용한다. 신경 인성 영역에서 aNSCs를 분리하는 또 다른 방법은 메스를 사용하여 두뇌를 통해 코로나 컷을 사용합니다. 이것은 SVZ의 미세 절개에 의해 또는 종 방향 균열 (23)을 따라 DG로 이어진다. 다른 뇌 영역의 존재는 다른 종류의 세포가 시험관 내에서 세포의 생존에 영향을 줄 수있는 aNSC 배양을 오염시킬 수있다. 현재의 프로토콜을 통해 여러 샘플을 실험군의 다양한 컨트롤을 포함하여 대 단일 실험 내에서 관리 할 수있다. 그것은 높은 셀 수율 다양한 뇌 영역에서 NSCs의 달성을 허용 로서도, 뇌 매트릭스를 이용 슬라이싱 것은 뇌 자르고 도구 우수하다. 또한 같은 뇌의 여러 지역 aNSCs의 비교를 가능하게한다.
내생 NSCs의 이식 및 엔지니어링은 considere있는되었습니다줄기 세포 치료를위한 가능한 전략으로서 D. 이를 위해 aNSCs의 특성에 대한 시험 관내 연구는 포괄적으로 탐구해야한다. 따라서, 시험 관내 배양 시스템에서 잘 특성화의 설립 NSCs의 적용을 촉진하는데 도움이 될 것이다. 적절한 조건에서 자기 갱신 및 여러 혈통 분화에 의해 입증이 문화 시스템에서, SCZ-aNSCs의 줄기 세포 특성을 잘 유지되었다. 따라서,이 배양 시스템은 생체 연구 및 치료 애플리케이션 SCZ-aNSCs의 확장에 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H.
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
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