Protocol
材料および培養培地の調製
- SCZの解剖および解離のために、アルミホイルで脳マトリックス、両刃カミソリの刃、および鉗子をラップしてから、オートクレーブでそれらを滅菌します。
- 全マウスの脳を洗浄するために、冷PBS緩衝液の50ミリリットルを準備します。
- 解剖顕微鏡を設定し、脳（オートクレーブ処理ハサミやピンセット）の解剖とSCZ（1 mlシリンジ、30 G針、脳マトリックス、および細かい鉗子）を単離するために必要な手術器具を準備します。
- N2培地の調製：
- F-12 / DMEM（+ L-グルタミン、+炭酸水素ナトリウム）2％B27、1％N2サプリメント、および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含む培地を準備します。
注：成長培地は、N2培地および成長因子（20 ngの/ mLの精製された上皮成長因子（EGF）および20 ng / mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF2））からなります。
- F-12 / DMEM（+ L-グルタミン、+炭酸水素ナトリウム）2％B27、1％N2サプリメント、および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含む培地を準備します。
- 消化緩衝液を準備します（40単位/ mlのパパイン、2.4単位/ ml dispasE II、および2％のペニシリン - ストレプトマイシンPBS中）組織消化のために。
- コーティングプレートとカバースリップの調製：
- （; 0.01％PLO）とラミニン（DH 2 Oに溶解し10μg/ mlの）ポリ-L-オルニチンを準備します。免疫染色のために、単層または18ミリメートルカバースリップとしてSCZ-aNSCsのメンテナンスのためのコート6ウェルプレートに、4℃で一晩PLOでそれらをインキュベートします。そしてO.は、プレートとカバースリップは、最後の洗浄後に乾燥することができDH 2でそれらを3回洗浄します。
- 次に、4℃で一晩ラミニンでプレートをインキュベート。そして、DH 2 Oでそれらを3回洗浄
注意：細胞付着に影響を与えるであろう、ラミニンを乾燥させないでください。
注：コーティング溶液を3回再利用することができます。
2.単離と大人SCZの解離
- 文化の準備に先立ち、氷上で脳マトリックスと両刃カミソリを配置します。
脳マトリックスを凍結しないでください、理由BR注：アインは、それに添付可能性があります。 - CO 2窒息または頚椎脱臼により（8週齢）のマウスを生け贄に捧げます。
- 70％エタノールを噴霧した後、鋭利なハサミで頭部を切断。ヘッドを固定化するために、しっかりと頭の両側を保持。尾 - 吻側方向に正中線でハサミで皮膚をカット。これは、頭蓋骨から皮膚の完全な除去を促進します。
- 最初の（ラムダに後方）頭蓋骨の尾の部分を削除してから、背側正中線の位置で頭蓋骨と脳の間に鉗子を挿入します。左（または右）頭頂骨をつかみ、慎重にはがし。他の頭頂骨の除去のために、この手順を繰り返します。
注：視神経と脳から髄膜の除去の切断はそれが簡単に頭蓋骨から脳をデタッチすることを可能にします。 - 冷PBS緩衝液（25ミリリットル）に脳を移し、余分な血液を除去するために、それを2回すすいでください。
- 氷とミリアンペアに脳マトリックスに脳を置きますKE冠状カットは1mm厚のスライスを得ることができます。 35mmのプラスチック製ペトリ皿に冷PBSに脳の後部に配置されSCZ領域を含む脳切片（1mm）で転送します。
注意：冠状切片の平行な面を得るために、脳の亀裂は、脳マトリックスの正中線に配置されることを確実にします。セクション内の不要な変動を回避することが重要です。
注：ブレグマ2〜3ミリの後部に脳スライスを入手。これは、SVZからSCZの分離を可能にします。 - 低倍率で解剖顕微鏡下で、曲がった30G針6,9と皮質と海馬の白質領域からSCZをマイクロ解剖。そして、SCZ上記の皮質領域を削除します。冷PBSせずに氷の上で35ミリメートルのプラスチックペトリ皿にスライスから解剖SCZ領域を配置します。
注：成熟した神経細胞を含む余分な地域の汚染がaNSCsとニューロスフェア形成bの生存能力に影響を与える可能性がありますecause彼らはANSC培養条件下で細胞死を起こします。 - 曲がった30 G針を使用して、すぐに小片に切開した組織を切ります。
注：長い時間がSCZ組織を切開するために必要とされている場合は、チョッピングの前に冷PBSで解剖した組織を浸します。 - 再懸濁消化緩衝液1mlで刻んだ組織を、消化緩衝液2mlを含有する15mlチューブに組織を転送し、そして37℃の水浴中で30分間それをインキュベートします。
注：十分に混合するためにチューブを10分ごとに振ります。
3.梁下ゾーン由来の成体神経幹細胞培養
- 消化された組織を分離し、その後5分間、145×gでチューブを遠心分離する穏やかにチューブをタップします。消化緩衝液を洗い流し、ゆっくりP1000ピペットを用いて試料溶液を5回の最大をピペットするために予め温めておいたN2培地1mlで再懸濁消化された組織、上清を捨てます。
注：過粉砕狭いとピペットチップは、細胞の生存及びその後の成長を減少させることができます。 - 5分間、145×gでチューブを遠心。上清を廃棄した後、N2培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。
- 非コート6ウェルプレート中のN2培地1mlを調製し、2mlの最終容量を作成するために懸濁された細胞を1ml加えます。
- 各ウェルにEGF（20ng / ml）およびbFGFを（20 ngの/ ml）を加えます。穏やかに播種した細胞を添加した成長因子を混合するために手で6ウェル培養皿を振ります。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で6ウェルプレートを保管してください。
- 8日間毎日各ウェルにEGF（20ng / ml）およびbFGFを（20 ngの/ ml）を加えます。すべての三日目は、培地のおおよそ2ミリリットルの容量を維持するために、N2培地200μlのを追加します。
ニューロスフェアとして、また単層培養へのNSCの4継代
- ニューロスフェアを収集し、新しい15ミリリットルコニカルチューブに移します。
注：ニューロスフェアの数（>直径50μm）PERならびに単一マウス脳のSCZからは、SVZ（190.5±6.33）9のそれよりも少なかった64.3±7.31でした。 - 単一細胞に神経球を解離し、37℃の水浴中で5分間解離緩衝液0.5 mlのニューロスフェアを培養します。一次ニューロスフェアは、単一の細胞に分離し、神経球または単層培養物のいくつかの継代にわたって維持することができます。
SCZ-aNSCsは、単層培養形式で> 10回継代することができるので、単層としてSCZ-aNSCsを展開すると、神経球よりも優れているが、<ニューロスフェア培養形式で5回：注意してください。
注意：SCZ-aNSCs強い凝集を示し、単一細胞にそれらを分離することは困難です。このように、ニューロスフェア培養形式は、ルーチン細胞増殖のために推奨されません。 - ゆっくり5分間145×gで上下P1000ピペットで5倍未満と遠心チューブを試料溶液をピペット。上清および再suコマンドを破棄N2培地1mlの神経球を過ごします。
注：細胞の生存及びその後の成長を減少させることができ、狭いピペットチップで粉砕にわたり。 - 細胞懸濁液（10μl）を0.4％トリパンブルー溶液の1混合し、次いで血球上の生細胞の数を数える：細胞をカウントするには、1を作ります。 PLO /ラミニンで6ウェルプレートに塗布した後、各ウェルのためのN2培地2mlで2.5×10 5細胞/ mlで細胞をプレート。
注：細胞密度の変化は、それらの条件と分化能に影響を与えることができます。 - 5日間の増殖因子の毎日の治療とSCZ-aNSCs（2ミリリットル、20 ngの/ ml）を維持し、それらの通路それら。
梁下ゾーン由来の成体神経幹細胞の分化5.
- SCZ-aNSCsの分化のための成長因子を有する1ミリリットルN2（20 ngの/ ml）の中の1×10 5細胞/ mlとPLO /ラミニンでコーティングした18ミリメートルカバースリップ上にプレートaNSCs。
- 次の日、細胞がしっかりとカバースリップに結合している場合には、増殖因子を除去するためにN 2で成長培地を交換します。
- 6日後、細胞破片を除去し、免疫染色のためにそれらを修正するためにPBS 1mlで分化した細胞を洗浄します。
注：BrdUを増殖細胞の新たに合成されたDNAに組み込むことができます。そのため、必要に応じて、BrdUを（10μg/ ml）を、細胞の固定前に細胞を生きて追加することができます。
6.免疫染色成体神経幹細胞および分化した前駆細胞
- 免疫染色のために、PBSで細胞を洗浄し、室温で20分間、4％PFAで固定し。
注意：PFAは非常に有毒です。皮膚や眼との接触を避けます。 - 、4％PFAを削除し、PBSで3回を固定した細胞を洗い流し、その後、4°Cuntil彼らは免疫染色のために必要とされるでそれらを格納します。
- 1×P溶液（3％ウシ血清アルブミン及び0.1％トリトンX-100を遮断してカバースリップ上で細胞をインキュベート室温で少なくとも30分間BS）。
- 新鮮なブロッキング溶液中で一次抗体を準備し、4℃で一晩サンプルをインキュベートします。
- aNSCsを免疫染色
- 抗ネスチンおよび抗BrdU抗体を用いてaNSCsを染色。固定する前に、aNSCsへのBrdUの20μgのを追加し、2時間のためにそれらをインキュベートします。ブロッキング工程を実施する37°Cbeforeで20分間2 N HClを用いて変性ステップを実行します。
- 分化した前駆細胞を免疫染色：
- 差別化前駆細胞を標識する抗O4、抗BIIIチューブリン、および抗グリア線維酸性タンパク質（GFAP）抗体を使用してください。
- aNSCsを免疫染色
- PBSで試料を3回洗浄し、蛍光色素（1：500）にコンジュゲート二次抗体でそれらをインキュベートし、室温で30分間ブロッキング溶液中。その後、PBSで試料を3回洗浄します。
注：プライマリのホストと一致し使用した二次抗体抗体。 Hoechest33343（1：2,000）は、核染色のために使用されます。 - スライドガラスにマウントソリューションを追加し、取り付けを進めます。複数の波長で共焦点顕微鏡でサンプルを観察し、画像：FITC（488 nm）と、のCy3（543 nm）で、Cy5の（647 nm）であり、Hoechest33343（405 nm）を。
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Representative Results
未知の神経形成領域からaNSCsための培養システムを定義すると、これらの細胞を理解し、脳修復12におけるそれらの潜在的用途を開発するために不可欠です。異なる発生段階で、または異なる地域でのNSCが異なる3,4振る舞うことが知られています。最近、SCZ由来細胞は、SVZ由来細胞7-9と比較して、インビボおよび インビトロで神経分化のために差動電位を示すことが報告されました。従って、正確にそれぞれの神経原性領域を分離するために、SCZを含む脳切片を1mm脳マトリックス（ 図1A）を使用して解剖しました。増殖因子との培養の8日後、SCZ由来するaNSCs細胞はその後（ 図1B）を維持することができる、ニューロスフェアを形成することができます。
ニューロスフェアでNSCのサブセットは、SPO可能性があるためntaneously単層培養系はまた、SCZ-aNSCsの比較的均質な集団の維持のために有用である、13を分化しました。トリプシンなどの成長因子および解離酵素が容易に神経球14,15の奥深くに浸透していません。単層培養は、NSCの拡張のためのより均一な条件を提供しています。一次ニューロスフェアから、SCZ-aNSCsは、消化緩衝液処理により単一細胞に解離させました。ある日、細胞播種後、aNSCsは、コーティングされたプレートと展示細胞増殖（ 図2A）に取り付けました。増殖のそれらの効力を確認するために、BrdUを培地に添加しました。 2時間のBrdUとのインキュベーション後、細胞を容易にSCZ-aNSCsが活発に増殖との重要な特性を維持していることを示し、抗BrdU（増殖のマーカー）および抗ネスチン抗体（神経幹細胞のマーカー）で染色しました幹細胞（ 図2B）。したがって、彼らはEXHませんでしたこのようなEGFR（一過性増幅細胞内で発現）およびDCX（神経芽細胞内で発現）（ 図2C）などの分化細胞、用ibitマーカー。
SCZ-aNSCs複数の分化能を確認するために、成長因子を培地から除去しました。 6日後、細胞を、分化した細胞のための様々なメーカーで免疫染色しました。 aNSCs、ニューロン（のTuj1）のマーカー、アストロサイト（GFAP）、およびオリゴデンドロサイト（O4）を使用したの異なる子孫を発揮すること。すべてのこれらの細胞型は、SCZ-aNSCs（ 図3）から生成されました。
図1： ニューロスフェアのSCZ領域と形成の単離。 （A）成体マウスの脳からSCZ領域の解剖のための手順。文化SCZ-ANにSCは、8週齢のマウスの脳は、脳マトリックス（1ミリメートルの間隔）に配置されています。切片化後、SCZ領域を含ま、1mmの脳切片（ブレグマから2-3 mm）を（赤い点線で示す）切開しました。 （B）ニューロスフェア形成。八日in vitro培養した後、一次ニューロスフェア（継代0）を形成し、継代しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 単層培養としてSCZ-aNSCsのメンテナンス。 （A）解剖細胞を播種の翌日、SCZ-aNSCsは、単層の方法でコーティングされたディッシュ（左）に付着し、増殖させました。三日メンテナンス後、SCZ-aNSCsの数は、（右）増加しました。 （B）のBrdU（赤、増殖細胞のマーカー）、ネスチン（緑色、神経幹細胞のマーカー）、及びHoechest33343（青色核のマーカー）で免疫染色。 （C）神経幹/前駆細胞マーカーネスチン（赤、B型神経幹細胞のマーカー）、EGFR（緑、タイプC一過性増幅細胞のマーカー）、およびDCX（青、タイプAのマーカーを用いた免疫染色神経芽細胞）。核はHoechest33343（白）で対比染色しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：SCZ-aNSCs から分化した細胞の免疫染色。分化マーカーのTuj1（緑、未熟な神経細胞のマーカー）による免疫染色、O4（赤、オリゴデンドロサイトのマーカー）、およびGFAPは（大声で叫びますOW、アストロサイトのマーカー）。拡大画像ははめ込みとして示されています。 Hoechest33343（青）カウンター染色の核に使用しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本論文では、成体マウスSCZからのNSCを生成し、様々なアプリケーションのためにそれらを維持するための詳細なプロトコルを記述します。 SCZ-のNSCを精製し、展開するために必要なin vitroの培養系を確立するための3つの重要なステップがあります。まず、SCZ領域が正確に他の潜在的な神経性領域（ 図1B）から解剖されていることを確認することが重要です。 SCZ領域を含む厚さと正確なセクションを1mm間隔脳マトリックスを用いて得られ、その後細かい針が他の皮質領域（ 図1A）からSCZの顕微解剖のために使用しました。ときに非NSCのような大脳皮質などの隣接組織から、負SCZ-NSCを16-18,22の生存率および球形成に影響を及ぼすSCZ-aNSCs、壊滅的な死が発生、と培養されます。尾SCZ（ブレグマ2-3ミリの後部）が明確なSCZ-aNSCsを生成するための最良の領域として確認されました。第二に、approp収穫と継代段階でriate酵素処理は細胞の高い収量を達成するために重要です。ディスパーゼIIおよびパパイン、トリプシンよりaNSCsを単離するための、より効果的でした。解離緩衝液の代わりに、トリプシンで継代のための細胞の解離は、生存能力19を増強しました 。ピペットで機械的解離及びトリチュレーションは最小限でなければなりません。第三に、セルストレーナーは、一般に、組織消化後に細胞の破片を除去するために、初代培養系で使用されています。しかし、SCZ-aNSCsの局在のために、これらの細胞は酵素消化および機械的粉砕によって白質の破壊後に得られます。セルストレーナーで濾過中、細胞のかなりの量が失われることになります。したがって、セルストレーナーを使用せずにSCZ-aNSCsを培養すると、細胞の高い収量を得るための良い方法です。
両方のニューロスフェア培養物及び単層培養は、NSCのメンテナンスに適用することができるが、神経の1の制限球の文化は分割がランダムに集約することができた後に、単一のNSCが解離していることです。ニューロスフェアの異なるサイズの集計結果。ニューロスフェアの大きさがある臨界値に達すると、ニューロスフェアは、異種栄養不足による構造、成長因子、およびコア20の酸素として成長します。さらに、大きなサイズのニューロスフェアを簡単に低い細胞生存率につながる、解離緩衝液を用いて解離し、大規模な機械的摩砕して、より長い酵素処理時間を必要とされていません。したがって、単層培養システムは、複数の通路を通ってSCZ-aNSCsを維持することをお勧めします。単層培養系では、aNSCsは安定して、このような前駆細胞（タイプCとA）（ 図3A）として指定された細胞への自発的分化なしのNSC（タイプB）として維持されています。 SCZ-aNSCsは、単層として長期間、<ニューロスフェアの形式で5継代および> 10継代継代しました。これは短所であります単層培養システムは、長期培養21 in vitroでのNSCを維持することを示唆している以前の結果とistent。しかし、増殖速度が減少し、死にかけている細胞の一部は、5継代にわたって増加しました。拡張継代は、多分化と増加した染色体異常22と神経分化に影響を与えます。したがって、拡張された継代の影響を避けるために、増殖および分化の解析のために初期継代（<通路5）細胞を使用することをお勧めします。 SCZ-aNSCsの自己再生の可能性がSVZ-aNSCsと同様であるが、あまり神経分化は、SCZ-aNSCs 9に示しました。
SVZおよび歯状回（DG）を含む成体脳の神経原性領域からaNSCsを単離するための方法は、22を確立されています。このようなプロトコルが分離し、in vitroでaNSCsの栽培を推進しているが、高い番号を取得するいくつかの制限があります細胞。多くのプロトコルは、チョッピング手順中脳組織の損失を引き起こす可能性がある脳組織チョッパーを使用します。神経原性の領域からaNSCsを単離するための別のアプローチは、メスを用いて脳を介して冠状カットを使用しています。これは、縦裂23に沿ってSVZのかDGの顕微解剖が続いています。他の脳領域の存在は、他の細胞型は、in vitroでの細胞の生存率に影響を与える可能性がありますANSC文化を汚染する可能性があります。現在のプロトコルでは、多くの異なるサンプルは、実験群の様々な対対照を含む、単一の実験で管理することができます。それは、高い細胞収率を有する種々の脳領域からのNSCの達成を可能にするように、また、脳マトリックスを用いてスライスすると、脳チョッピングツールよりも優れています。また、同じ脳の異なる領域からaNSCsの比較を可能にします。
内因性NSCの移植とエンジニアリングはconsidereされています幹細胞療法のための可能な戦略として、D。このため、aNSCsの特性に関するin vitro試験も総合的に検討されるべきです。したがって、 体外培養系で十分に特徴づけの確立は、NSCの適用を促進するための参考になります。適切な条件下で自己再生および多系列分化によって証明されるように、この培養系では、SCZ-aNSCsの幹細胞の特性は、十分に維持されました。従って、この培養系は、生物学的研究および治療用途のためにSCZ-aNSCsの拡張のために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
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