Protocol
1. Utarbeidelse av materialer og dyrkingsmedium
- For disseksjon og dissosiasjon av SCZ, vikle hjernen matrise, tveegget barberblad og tang med aluminiumsfolie, og deretter sterilisere dem ved autoklavering.
- Fremstille 50 ml kald PBS-buffer for å vaske hele musehjerne.
- Sett opp en disseksjon mikroskop og fremstille de kirurgiske verktøy som kreves for disseksjon av hjernen (autoklaverte sakser og pinsetter) og isolering av SCZ (1 ml sprøyte, 30 G nål, hjerne matrix, og fin pinsett).
- Utarbeidelse av N2 Medium:
- Forbered F-12 / DMEM (+ L-Glutamin, + natriumbikarbonat) medium med 2% B27, en% N2 kosttilskudd, og 1% Penicillin-Streptomycin.
Merk: Vekstmediet består av N2 medium og vekstfaktorer (20 ng / ml renset, epidermal vekstfaktor (EGF) og 20 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF2)).
- Forbered F-12 / DMEM (+ L-Glutamin, + natriumbikarbonat) medium med 2% B27, en% N2 kosttilskudd, og 1% Penicillin-Streptomycin.
- Utarbeide en fordøyelsen buffer (40 emne / ml papain, 2,4 enhet / ml dispase II, og 2% penicillin-streptomycin i PBS) for vev fordøyelse.
- Utarbeidelse av Coating Plate og Coverslip:
- Forbered poly-L-ornithine (PLO, 0,01%) og laminin (10 mikrogram / ml oppløst i DH 2 O). Å belegge seks-brønns plater for vedlikehold av SCZ-aNSCs som et enkeltlag eller 18 mm dekkglass for farging, ruge dem med PLO over natten ved 4 ° C. Deretter vaske dem 3 ganger med DH 2 O. La platene og Dekk til tørk etter siste vask.
- Deretter inkuberes platene med laminin over natten ved 4 ° C. Deretter vaske dem 3 ganger med DH 2 O.
Advarsel: Ikke tørk laminin, noe som vil påvirke cellebinding.
Merk: De beleggende oppløsninger kan brukes om igjen 3 ganger.
2. Isolering og dissosiasjon av Adult SCZ
- Før kultur forberedelse, setter hjernen matrise og tveegget barberhøvel på is.
Merk: Ikke frys hjernen matrise, fordi brain kan feste til det. - Ofre en mus (8 uker gammel) av CO 2 kvelning eller halshugging.
- Skjær av hodet med skarp saks etter sprøyting 70% etanol. For å immobilisere hodet, holder begge sider av hodet tett. Skjær huden med saks på midtlinjen i en hale-rostralt retning. Dette fremmer den fullstendige fjernelse av huden fra skallen.
- Fjern hale del av skallen (posterior til lambda) først, og deretter sette pinsett mellom hodeskalle og hjernen ved rygglinjen plassering. Ta tak i venstre (eller høyre) issebeinet og nøye skrelle den av. Gjenta denne fremgangsmåten for fjerning av den andre issebeinet.
Merk: Utkobling av synsnerven og fjernelse av hjernehinnene fra hjernen gjøre det lettere å løsne hjernen fra skallen. - Overfør hjernen til kald PBS-buffer (25 ml) og skyll det to ganger for å fjerne overskytende blod.
- Plasser hjernen inn i hjernen matrise på is og make koronale kutt for å få en mm tykke skiver. Overfør hjerneskiver (1 mm) inneholdende SCZ regionene som er plassert i den bakre del av hjernen til en kald PBS i en 35 mm petriskål av plast.
Forsiktig: For å oppnå et parallelt plan av koronale seksjoner, at hjernen sprekken er plassert i midtlinjen av hjerne matrix; er det viktig å unngå unødvendige variasjoner i seksjonene.
Merk: Skaff hjernen skiver på 2-3 mm posteriort for bregma; Dette tillater separasjon av den SCZ fra SVZ. - Under dissekere mikroskop med lav forstørrelse, mikro-dissekere SCZ fra hvit substans område av hjernebarken og hippocampus med en bøyd 30G nål 6,9. Deretter fjerner hjernebarken regioner over SCZ. Plasser dissekert SCZ regionen fra skivene i en 35 mm plast petriskål på is uten kald PBS.
Merk: Forurensning av ekstra områder som inneholder modne nevroner kan påvirke levedyktigheten til aNSCs og neurosfære dannelse because de gjennomgår celledød i aNSC dyrkningsforhold. - Ved hjelp av en bøyd 30 G nål, umiddelbart hogge dissekert vev i små biter.
Merk: Hvis en lengre tid er nødvendig for å dissekere den SCZ vev, senk dissekert vev i kald PBS før hakking. - Re-suspendere den hakkede vev med 1 ml fordøyelse buffer, overføre vev til et 15 ml rør inneholdende 2 ml av fordøyelse buffer, og inkuberes det i 30 minutter i et 37 ° C vannbad.
Merk: Rist tube hvert 10 min for å blande godt.
3. Subcallosal Zone-avledet Adult Neural Stem Cell Culture
- Tapp røret mildt for å dissosiere det fordøyde vevet, og deretter sentrifuger røret ved 145 xg i 5 minutter. Kast supernatanten, re-suspendert spaltet vev med 1 ml forvarmet N2-medium for å vaske ut fordøyelse buffer, og forsiktig pipettér prøveoppløsningen maksimalt 5 ganger ved hjelp av en pipette P1000.
Merk: Over-triturating med en smalpipettespiss kan redusere cellenes levedyktighet og påfølgende vekst. - Sentrifuger røret ved 145 xg i 5 minutter. Etter kassering av supernatanten, re-suspen cellepelleten i 1 ml av N2-medium.
- Fremstille 1 ml av N2-medium i en ikke-belagt 6-brønns plate og tilsett 1 ml av de suspenderte celler til å lage en endelig volum på 2 ml.
- Legg EGF (20 ng / ml) og bFGF (20 ng / ml) i hver brønn. Rist 6-brønners kulturskål for hånd for å blande de tilsatte vekstfaktorer med de pletterte celler. Hold 6-brønns plate i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator.
- Legg EGF (20 ng / ml) og bFGF (20 ng / ml) til hver brønn hver dag i 8 dager. Hver tredje dag, tilsett 200 ul av N2 media for å opprettholde den omtrentlige 2 ml volum av mediet.
4. aging av NSCs som Neurosfærer og Ettlagskulturer
- Samle Neurosfærene og overføre dem til en ny 15 ml konisk tube.
Merk: Antallet neurosfærer (> 50 mikrometer i diameter) per vel fra SCZ av en enkelt musehjerne var 64,3 ± 7,31, som var mindre enn den for SVZ (190,5 ± 6.33) 9. - Inkuber neurosfærene med 0,5 ml av dissosiasjon buffer i 5 min i et 37 ° C vannbad for å dissosiere neurosfærene inn i enkeltceller. Primære Neurosfærene kan dissosiert til enkeltceller og vedlikeholdes over flere passasjer som neurosfære eller monolagskulturer.
Merk: Utvide SCZ-aNSCs som et enkeltlag er overlegen Neurosfærene fordi SCZ-aNSCs kan passert> 10 ganger i en monokultur format, men <5 ganger i en neurosfære kultur format.
Forsiktig: SCZ-aNSCs viser sterk aggregering, og det er vanskelig å skille dem i enkeltceller. Således er neurosfærene kulturen formatet ikke anbefalt for rutinemessig celle ekspansjon. - Forsiktig pipettér prøveløsningen opp og ned med en pipette P1000 mindre enn 5 ganger, og sentrifuger rør ved 145 xg i 5 minutter. Kast supernatanten og re-subruke neurosfærene med 1 ml av N2-medium.
Merk: Over triturating med en smal pipette tips kan redusere celleviabilitet og påfølgende vekst. - For å telle cellene, gjør en 1: 1 blanding av cellesuspensjon (10 pl) og 0,4% trypanblått-oppløsning, og deretter telle antall levende celler på en hematocytometer. Etter belegging av en 6-brønns plate med PLO / laminin, plate cellene ved 2,5 x 10 5 celler / ml med 2 ml av N2-medium til hver brønn.
Merk: Endringer i celletetthet kan påvirke deres tilstand og differensiering potensial. - Opprettholde SCZ-aNSCs med en daglig behandling av vekstfaktorer (2 ml, 20 ng / ml) i 5 dager, og dem passasje dem.
5. Differensiering av Subcallosal Zone-avledet Adult Neural stamceller
- Plate aNSCs mot en PLO / Laminin-belagte 18 mm dekkglass med 1 x 10 5 celler / ml i 1 ml N2 med vekstfaktorer (20 ng / ml) for differensiering av SCZ-aNSCs.
- Den neste dagen,når cellene er godt festet til dekkglass, utveksle vekstmediet med N2 for å fjerne de vekstfaktorer.
- Etter 6 dager, vaske differensierte celler med 1 ml PBS for å fjerne cellerester og fikse dem for farging.
Merk: BrdU kan bli innlemmet i den nylig syntetiserte DNA av prolifererende celler. Derfor, hvis ønskelig, BrdU (10 ug / ml) tilsettes til levende celler før fiksering av cellene.
6. Farging Adult Neural stamceller og differensierte stamfedre
- For farging, vaskes cellene med PBS og feste dem med 4% PFA i 20 minutter ved romtemperatur.
Forsiktig: PFA er svært giftig; unngå kontakt med hud og øyne. - Fjern 4% PFA, skyll de faste celler med PBS 3 ganger, og deretter lagre dem ved 4 ° Cuntil det er behov for farging.
- Inkuber cellene på dekkglass med blokkeringsoppløsning (3% bovint serumalbumin og 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) i minst 30 minutter ved romtemperatur.
- Fremstille de primære antistoffer i frisk blokkeringsoppløsningen og prøvene inkuberes over natten ved 4 ° C.
- Farging de aNSCs
- Flekk aNSCs bruker anti-nestin og anti-BrdU antistoffer. Før fiksering, tilsett 20 mikrogram av BrdU til aNSCs og inkuber dem i 2 timer. Utfør denaturerende trinn ved anvendelse av 2 N HCI i 20 minutter ved 37 ° Cbefore utføre blokkeringstrinn.
- Farging de differensierte forfedre:
- Bruk anti-O4, anti-BIII-tubulin, og anti-glial fibrillary surt protein (GFAP) antistoffer for å merke differensierte stamceller.
- Farging de aNSCs
- Vask prøvene med PBS 3 ganger og inkuber dem med sekundære antistoffer konjugert med fluorescerende fargestoffer (1: 500) i blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter vaskes prøvene 3 ganger med PBS.
Merk: Bruk sekundære antistoffer som samsvarer med vertene av primæreantistoffer. Hoechest33343 (1: 2000) anvendes for nukleær farging. - Legg monteringsløsning til et lysbilde glass og fortsett med montering. Observer og bilde prøven på en konfokalmikroskop på flere bølgelengder: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), og Hoechest33343 (405 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definere kultur system for aNSCs fra det ukjente nevrogen regionen er viktig for å forstå disse cellene og for å utvikle sitt potensial bruk i hjernen reparasjon 12. Det er kjent at NSC i ulike utviklingsstadier eller i ulike regioner oppfører seg annerledes 3,4. Nylig ble det rapportert at SCZ-avledede celler som oppviser differensielle potensialer for neuronal differensiering in vivo og in vitro sammenlignet med SVZ-avledede celler 7-9. Derfor, for å nøyaktig isolere hver nevrogen region, ble hjerneskiver som omfatter SCZ dissekert ved anvendelse av en 1 mm hjerne matrix (figur 1A). Etter 8 dager av kulturen med vekstfaktorer, kan aNSCs avledet fra SCZ danne neurosfærer, i hvilket cellene kan deretter bli opprettholdt (figur 1B).
Siden et delsett av NSCs i neurosfærene kan være spontaneously differensiert 13, en monolagskultur system er også nyttig for opprettholdelse av den forholdsvis homogen populasjon av SCZ-aNSCs. Vekstfaktorer og dissosiasjon enzymer så som trypsin ikke lett trenge dypt inne i neurosfærene 14,15. Monolagskulturer gi jevnere betingelser for utvidelse av NSC. Fra primær Neurosfærene, ble SCZ-aNSCs dissosiert til enkeltceller av en fordøyelsen buffer behandling. En dag etter celle såing, ble aNSCs festet til den belagte plate og oppviste celleproliferering (figur 2A). For å bekrefte sin potens av spredning, ble BrdU lagt inn i media. Etter inkubasjon med BrdU i 2 timer, ble cellene lett farget med anti-BrdU (en markør for proliferasjon) og anti-nestin (en markør for nevrale stamceller) antistoffer, noe som indikerer at SCZ-aNSCs er aktivt prolifererende og opprettholde de viktigste egenskaper av stamceller (figur 2B). Følgelig gjorde de ikke exhibit markører for differensierte celler, slik som EGFR (uttrykt i forbigående forsterkende celler) og DCX (uttrykt i neuroblasts) (figur 2C).
For å bekrefte flere differensiering potensialet i SCZ-aNSCs, ble vekstfaktorer fjernet fra kulturmedier. Etter 6 dager ble cellene immunostained med ulike beslutningstakere for differensierte celler. Å vise de ulike progenies av aNSCs, markører for nevroner (Tuj1), astrocytter (GFAP) og oligodendrocytter (O4) var ansatt; alle disse celletyper ble samlet fra den SCZ-aNSCs (figur 3).
Figur 1: Isolering av SCZ regionen og dannelse av neurosfærene. (A) Fremgangsmåte for disseksjon av den SCZ regionen fra voksen musehjerne. Å kultur SCZ-AnSCS er en 8 uker gamle mus hjernen plassert på en hjerne matrise (1 mm intervaller). Etter seksjonering, 1 mm hjerneskiver som inkluderte SCZ region (2-3 mm fra bregma) ble dissekert (angitt med rød stiplet linje). (B) neurosfære formasjon. Åtte dager etter in vitro-kultur, primære neurosfærer (passasje 0) ble dannet og passaged. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vedlikehold av SCZ-aNSCs som en monolagskultur. (A) En dag etter såing de dissekerte celler, ble SCZ-aNSCs festet og utvidet på en belagt rett i en mono måte (til venstre). Tre dager etter vedlikehold, ble antall SCZ-aNSCs økt (til høyre). (B) Farging med BrdU (rød, en markør for voksende celler), nestin (grønn, en markør for nevrale stamceller), og Hoechest33343 (blå, en markør for kjerner). (C) farging med nevrale stilk / stamcellemarkører nestin (rød, en markør for type B nevrale stamceller), EGFR (grønn, en markør for type C forbigående forsterkende celler), og DCX (blå, en markør for type A neuroblasts). Kjerner ble kontra med Hoechest33343 (hvit). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Farging av differensierte celler fra SCZ-aNSCs. Farging med differensiering markører Tuj1 (grønn, en markør for umodne nerveceller), O4 (rød, en markør for oligodendrocytes), og GFAP (hyleow, en markør for astrocytter). Forstørrede Bildene vises som innfellinger. Hoechest33343 (blå) ble brukt for teller-farging kjernene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette notatet beskriver en detaljert protokoll for å generere NSCs fra den voksne mus SCZ og for å opprettholde dem for ulike bruksområder. Det er tre kritiske trinn for bestemmelse av in vitro kultursystem er nødvendig for å rense og utvide SCZ-NSC. For det første er det viktig å sikre at SCZ regionen er nettopp dissekert ut fra andre potensielle nevrogene regioner (figur 1B). Tykke og presise seksjoner inneholdende de SCZ regionene ble oppnådd med en 1 mm intervall hjerne matrix, og deretter en fin nål ble anvendt for mikro-disseksjon av den SCZ fra andre kortikale regioner (figur 1A). Når ikke-NSCs fra tilstøtende vev, som for eksempel den cerebrale cortex, dyrkes med SCZ-aNSCs oppstår katastrofal død, noe som negativt påvirker levedyktigheten og sfære-dannelse av SCZ-NSCs 16-18,22. Hale SCZ (2-3 mm posteriort for bregma) ble bekreftet som den beste regionen for å generere ulike SCZ-aNSCs. For det andre hensiktsmessig enzymatiske behandling i trinn høsting og aging er kritisk for å oppnå et høyt utbytte av celler. Dispase II og papain var mer effektive for å isolere aNSCs enn trypsin. Dissosiasjon av celler for aging med dissosiasjon buffer istedenfor trypsin forbedret sin levedyktighet 19. Mekanisk dissosiasjon og triturering med en pipette bør være minimal. For det tredje blir et cellefilter anvendes generelt i primærkultursystemer for å fjerne cellerester etter vev fordøyelse. Men på grunn av lokaliseringen av SCZ-aNSCs, er disse cellene oppnådd etter brudd av hvit substans ved enzymoppslutning og mekanisk finmaling. Under filtrering med et cellefilter, vil en betydelig mengde av celler tapt. Derfor dyrking SCZ-aNSCs uten å bruke en celle sil er en bedre måte å få en høy avkastning av celler.
Mens både neurosfære kulturer og monolagskulturer kan anvendes for opprettholdelse av NSCs, en begrensning av den neurosfære kultur er at enkelt NSCs dissosiert etter splitting kan være tilfeldig aggregeres. Aggregering resultater i ulike størrelser av neurosfærer. Når størrelsen på en neurosfære når en viss kritisk verdi, vokser neurosfærene som en heterogen struktur, på grunn av en mangel på næringsstoffer, vekstfaktorer, og oksygen i kjernen 20. Videre neurosfærer med store størrelser er ikke lett dissosiert med dissosiasjon buffer og kreve lengre enzymatiske behandling ganger med omfattende mekanisk finmaling, som fører til lavere cellelevedyktighet. Derfor er monolagskultur system anbefalt å opprettholde SCZ-aNSCs gjennom flere passasjer. I en monolagskultur system, blir aNSCs stabilt opprettholdt som NSCs (type B) uten spontan differensiering til spesifiserte celler, slik som forløpere (type C og A) (figur 3A). SCZ-aNSCs ble passert i lengre perioder, <5 passasjer i en neurosfære format og> 10 passasjer som et enkeltlag. Dette er consistent med tidligere resultater, noe som tyder på at enlagskultur systemet opprettholder NSCs in vitro i langsiktige kulturer 21. Imidlertid reduserte den prolifererende hastighet, og den delen av døende celler øket i løpet av 5 passasjer. Utvidet aging påvirker multipotency og nevronale differensiering med økt kromosomavvik 22. Derfor, for å unngå lengre aging effekter, er det anbefalt å bruke tidlig passasje (<passasje 5) celler for spredning og differensiering analyse. Selv om potensialet for selvfornyelse av SCZ-aNSCs ligner SVZ-aNSCs, ble mindre neuronal differensiering vist i SCZ-aNSCs 9.
Metoder for å isolere aNSCs fra nevrogene regioner av den voksne hjernen, inkludert SVZ og dentate gyrus (DG), er det etablert 22. Selv om slike protokoller er fremmet isolering og dyrking av aNSCs in vitro, er det flere begrensninger for å oppnå et høyt antallceller. Mange protokoller bruker en hjernevev helikopter som kan føre til tap av hjernevev i løpet av hakke inngrepet. En annen tilnærming til å isolere aNSCs fra nevrogene regioner bruker en coronal kutt gjennom hjernen ved hjelp av en skalpell. Dette etterfølges av mikro-disseksjon av den SVZ eller av DG langs den langsgående rennen 23. Nærvær av andre hjerneregioner kan føre til andre celletyper for å forurense den aNSC kulturen, noe som kan påvirke levedyktigheten til cellene in vitro. Med dagens protokollen, kan mange forskjellige prøvene skal forvaltes i et enkelt eksperiment, inkludert kontroller versus en rekke eksperimentelle grupper. Også å ha klippet ved hjelp av en hjerne matrise er overlegen en hjerne hakking verktøy, som gjør det mulig for oppnåelse av NSCs fra ulike områder av hjernen med en høy celleutbytte. Det gjør det også mulig å sammenligne aNSCs fra ulike regioner i samme hjernen.
Transplantasjon og prosjektering av endogene NSCs har vært considered som mulige strategier for stamcelleterapi. For dette, in vitro-studier om hva som kjennetegner aNSCs bør også grundig utforsket. Derfor vil etablering av en velkarakterisert in vitro kultursystem være nyttig for å fremme anvendelsen av NSC. I denne kulturen systemet, stamcelle egenskaper SCZ-aNSCs var godt vedlikeholdt, noe som gjenspeiles av selvfornyelse og fler avstamning differensiering under egnede forhold. Derfor kan dette kultursystem kan brukes for utvidelse av SCZ-aNSCs for biologiske studier og terapeutiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H.
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
