Protocol
1. Herstellung von Materialien und Kulturmedium
- Für die Präparation und Dissoziation des SCZ, wickeln Sie das Gehirn Matrix, zweischneidigen Rasierklinge und Zange mit Aluminiumfolie, und sie dann im Autoklaven sterilisiert werden.
- Vorbereitung 50 ml kaltem PBS-Puffer das gesamte Gehirn der Maus zu waschen.
- Legen Sie ein Präpariermikroskop und bereiten die chirurgischen Instrumente für die Präparation des Gehirns erforderlich (autoklaviert Schere und Pinzette) und die Isolierung des SCZ (1 ml Spritze, 30 G-Nadel, Gehirn-Matrix und einer feinen Pinzette).
- Herstellung von N2 Medium:
- Bereiten F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + Natriumbicarbonat) -Medium mit 2% B27, 1% N2 Ergänzungsmittel, und 1% Penicillin-Streptomycin.
Hinweis: Das Wachstumsmedium besteht aus N2-Medium und Wachstumsfaktoren (20 ng / ml gereinigten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF2)).
- Bereiten F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + Natriumbicarbonat) -Medium mit 2% B27, 1% N2 Ergänzungsmittel, und 1% Penicillin-Streptomycin.
- Bereiten Sie einen Verdauungspuffer (40 Einheiten / ml Papain, 2,4 Einheiten / ml DISPASII e und 2% Penicillin-Streptomycin in PBS) für eine Gewebe Verdauung.
- Herstellung von Beschichtungs Plate und Deckglas:
- Bereiten poly-L-Ornithin (PLO; 0,01%) und Laminin (10 ug / ml , gelöst in dH & sub2 ; O). Zur Beschichtung von Platten mit 6 Vertiefungen für die Aufrechterhaltung der SCZ-aNSCs als Einschicht- oder 18 mm-Deckgläschen für die Immunfärbung, inkubieren mit PLO über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O Lassen Sie die Platten und Deckgläser nach der letzten Wäsche zu trocknen.
- Als nächstes brüten die Platten mit Laminin über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O.
Achtung: Die Laminin nicht trocken, was die Zellbindung beeinflussen.
Anmerkung: Die Beschichtungslösungen können 3-mal wiederverwendet werden.
2. Isolierung und des Zerfalls des Adult SCZ
- Vor der Kultur Vorbereitung, legen Sie die Gehirn-Matrix und zweischneidiges Rasiermesser auf dem Eis.
Hinweis: Das Gehirn Matrix nicht einfrieren, weil der brain könnte daran zu binden. - Opfere eine Maus (8 Wochen alt) von CO 2 Ersticken oder Genickbruch.
- Schneiden Sie den Kopf mit einer scharfen Schere nach dem Spritzen 70% Ethanol aus. Um den Kopf zu immobilisieren, halten fest an beiden Seiten des Kopfes. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere an der Mittellinie in einer Schwanz-rostralen Richtung. Dies fördert die vollständige Entfernung der Haut von dem Schädel.
- Entfernen Sie den kaudalen Teil des Schädels (posterior lambda) zuerst, und dann legen Sie die Zange zwischen dem Schädel und das Gehirn an der dorsalen Mittellinie Position. Besorgen Sie sich die links (oder rechts) Scheitelbein und vorsichtig abziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Entfernung des anderen Scheitelbein.
Hinweis: Wegnahme der Sehnerv und die Entfernung der Hirnhäute aus dem Gehirn machen es leichter, das Gehirn aus dem Schädel zu lösen. - Übertragen Sie das Gehirn zu kaltem PBS-Puffer (25 ml) und spülen Sie ihn zweimal überschüssiges Blut zu entfernen.
- Legen Sie das Gehirn in das Gehirn Matrix auf Eis und make koronale Schnitte 1 mm dicke Scheiben zu erhalten. Übertragen Sie die Gehirnscheiben (1 mm), um die SCZ Regionen enthalten, die im hinteren Teil des Gehirns zu einer kalten PBS in einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff befinden.
Achtung: Um eine parallele Ebene von koronalen Abschnitte zu erhalten, stellen Sie sicher, dass das Gehirn Riss in der Mittellinie des Gehirns Matrix angeordnet ist; es ist wichtig, unnötige Schwankungen in den Abschnitten zu vermeiden.
Hinweis: Erhalten Gehirnscheiben bei 2-3 mm hinter Bregma; Dies ermöglicht die Trennung des SCZ vom SVZ. - Unter dem Binokular mit geringer Vergrößerung, Mikro-sezieren die SCZ aus der weißen Substanz Bereich des Cortex und Hippocampus mit einer gebogenen Nadel 30G 6,9. Dann entfernen Sie die Rinde Regionen über dem SCZ. Platzieren Sie den sezierten SCZ Region von den Scheiben in eine 35 mm Petrischale aus Kunststoff auf Eis ohne kaltem PBS.
Hinweis: Die Kontamination von zusätzlichen Regionen reifen Neuronen, welche die Lebensfähigkeit von aNSCs und Neurosphere Bildung b beeinflussen könnteneil sie unterliegen in aNSZ nach folgenden Kriterien Kulturbedingungen Zelltod. - Mit einer gebogenen 30 G-Nadel, sofort hacken die sezierten Gewebe in kleine Stücke.
Hinweis: Wenn eine längere Zeit zum Präparieren des SCZ Gewebe erforderlich ist, bevor Zerkleinern der sezierten Gewebe in kaltem PBS tauchen. - Re-suspendieren des zerkleinerten Gewebe mit 1 ml Verdauungspuffer, zu übertragen, das Gewebe zu einem 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Verdauungspuffer, und inkubiere für 30 min in einem Wasserbad 37 ° C.
Hinweis: Das Röhrchen wird alle 10 Minuten gut zu mischen.
3. subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellkultur
- Tippen Sie auf das Rohr leicht das verdaute Gewebe zu trennen, und dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen, erneut suspendiert, um die verdaute Gewebe mit 1 ml vorgewärmtes N2 Medium, um die Verdauung Puffer zu waschen und sanft die Probenlösung maximal 5 mal pipettieren eine P1000 Pipette.
Hinweis: Über Verreiben mit einem schmalenPipettenspitze kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Nach Verwerfen des Überstandes, resuspendieren in 1 ml Medium N2 des Zellpellets.
- Vorbereitung 1 ml N2-Medium in einer nicht-beschichteten 6-Well-Platte und 1 ml der suspendierten Zellen auf ein Endvolumen von 2 ml zu machen.
- In EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) in jede Vertiefung. Schütteln Sie die 6-Well-Kulturschale mit der Hand mit den plattierten Zellen die zusätzlichen Wachstumsfaktoren zu mischen. Halten Sie die 6-Well - Platte in einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator.
- Hinzufügen, EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) zu jedem Well täglich für 8 Tage. Jeden dritten Tag, 200 & mgr; l N2 Medien die ungefähre 2 ml Volumen des Mediums aufrechtzuerhalten.
4. Passagierung von NSCs als Neurosphären und Monolayer-Kulturen
- Sammeln Sie die Neurosphären und sie auf einem neuen 15 ml konischen Röhrchen.
Hinweis: Die Anzahl der Neurosphären (> 50 & mgr; m Durchmesser) per gut von der SCZ einer einzelnen Maus Gehirn war 64,3 ± 7,31, die als die des SVZ weniger war (190,5 ± 6,33) 9. - Inkubieren der Neurosphären mit 0,5 ml Dissoziationspuffer für 5 min in einem Wasserbad 37 ° C, um die Neurosphären in einzelne Zellen dissoziiert. Primäre Neurosphären können in einzelne Zellen und gepflegt über mehrere Passagen als Neurosphere oder Monolayer-Kulturen voneinander zu trennen sind.
Hinweis: Der Ausbau SCZ-aNSCs als Monoschicht auf Neurosphären überlegen ist, weil SCZ-aNSCs kann> 10-mal in einer Monokultur-Format agiert werden, aber <5 mal in einem Neurosphere Kultur Format.
Achtung: SCZ-aNSCs zeigen eine starke Aggregation, und es ist schwierig, sie in einzelne Zellen zu distanzieren. Somit wird der Neurosphärenkultur Format nicht für Routinezellexpansion empfohlen. - Pipettieren vorsichtig die Probenlösung nach oben und unten mit einer P1000 Pipette weniger als 5-mal und Zentrifuge das Rohr bei 145 g für 5 min. Überstand verwerfen und neu sudie Neurosphären mit 1 ml Medium N2 verbringen.
Hinweis: Über eine schmale Pipettenspitze Verreiben kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern. - Um die Zellen zu zählen, machen Sie eine 1: 1-Gemisch aus der Zellsuspension (10 ul) und der 0,4% Trypanblau-Lösung und dann die Anzahl der lebenden Zellen auf einer Zählkammer zählen. Nach der Beschichtung / Laminin eine 6-Well - Platte mit der PLO, die Platte , die Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml mit 2 ml N2 - Medium für jede Vertiefung.
Hinweis: Änderungen in der Zelldichte ihren Zustand und Differenzierungspotenzial beeinflussen können. - Pflegen die SCZ-aNSCs mit einer täglichen Behandlung von Wachstumsfaktoren (2 ml, 20 ng / ml) für 5 Tage, und diese Passage ihnen.
5. Differenzierung von subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellen
- Platte aNSCs auf eine PLO / Laminin-beschichtete 18 mm Deckglas mit 1 x 10 5 Zellen / ml in 1 ml N2 mit Wachstumsfaktoren (20 ng / ml) für die Differenzierung der SCZ-aNSCs.
- Am nächsten Tag,Wenn die Zellen fest an dem Deckglas angebracht ist, das Wachstumsmedium mit N2 tauschen die Wachstumsfaktoren zu entfernen.
- Nach 6 Tagen, wasche die differenzierten Zellen mit 1 ml PBS Zelltrümmer zu entfernen und sie für die Immunfärbung fixieren.
Hinweis: BrdU in die neu synthetisierte DNA der proliferierenden Zellen eingebaut werden. Daher kann, falls gewünscht, BrdU (10 & mgr; g / ml) zugegeben werden, um Zellen zu leben vor der Fixierung der Zellen.
6. Immunostaining adulten neuralen Stammzellen und Differentiated Vorläufern
- Für die Immunfärbung, waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur.
Achtung: PFA ist sehr giftig; Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. - Entfernen Sie die 4% PFA, spülen Sie die fixierten Zellen mit PBS 3 mal, und dann bei 4 ° Cuntil sie für die Immunfärbung benötigt werden.
- Inkubieren der Zellen auf dem Deckglas mit Blockierungslösung (3% Rinderserumalbumin und 0,1% Triton X-100 in 1 × Pmindestens 30 min bei Raumtemperatur BS) für.
- Bereiten Sie die primären Antikörper in frischen Blockierungslösung und die Proben unter über Nacht bei 4 ° C.
- Immunostaining die aNSCs
- Beflecken die aNSCs mit Anti-Nestin und Anti-BrdU-Antikörper. Vor der Fixierung hinzufügen 20 ug BrdU in die aNSCs und brüten sie für 2 h. Führen der Denaturierungsschritt unter Verwendung von 2 N HCl für 20 min bei 37 ° Cbefore den Blockierungsschritt durchzuführen.
- Immunostaining die differenzierten Vorläufern:
- Verwenden anti-O4, anti-Tubulin-bIII und Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) -Antikörper die differenzierten Vorläufern zu etikettieren.
- Immunostaining die aNSCs
- Waschen der Proben mit 3 mal PBS und Inkubieren sie mit sekundären Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert Antikörper (1: 500) in Blocking-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS.
Hinweis: Verwenden Sie sekundäre Antikörper, die die Gastgeber des primären entsprechenAntikörper. Hoechest33343 (1: 2000) wird für die Kernfärbung verwendet. - In einem Glasobjektträger Montagelösung und fahren Sie mit Montage. Beobachten und Bild der Probe auf einem konfokalen Mikroskop bei mehreren Wellenlängen: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) und Hoechest33343 (405 nm).
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Representative Results
Definition des Kultursystems für aNSCs aus dem unbekannten neurogene Region ist von wesentlicher Bedeutung für diese Zellen zu verstehen und für ihre mögliche Verwendung in Gehirn Reparatur 12 zu entwickeln. Es ist bekannt , dass NSC in verschiedenen Entwicklungsstadien oder in unterschiedlichen Bereichen unterschiedlich 3,4 verhalten. Vor kurzem wurde berichtet , dass SCZ-abgeleiteten Zellen Differentialpotentiale für die neuronale Differenzierung in vivo aufweisen und in vitro im Vergleich zu SVZ abgeleiteten Zellen 7-9. Deshalb, um genau jede neurogenen Region isolieren, Hirnschnitten, die die SCZ beinhalten wurden unter Verwendung einer 1 mm Gehirnmatrix (1A) seziert. Nach 8 Tagen der Kultur mit Wachstumsfaktoren, von der SCZ abgeleitet aNSCs können die Zellen anschließend aufrechterhalten kann Neurosphären, in welcher Form (1B).
Da eine Teilmenge von NSC in den Neurosphären können spo seinntaneously 13 differenziert, eine Einschichtfolie Kultursystem für die Aufrechterhaltung der relativ homogene Population von SCZ-aNSCs auch hilfreich. Wachstumsfaktoren und Dissoziation Enzyme wie Trypsin kann durchdringen nicht leicht tief im Inneren des Neurosphere 14,15. Monolayer-Kulturen bieten noch mehr Bedingungen für den Ausbau von NSCs. Von der Grundneurosphären wurden SCZ-aNSCs in einzelne Zellen durch eine Verdauungspuffer Behandlung distanzierte. Einen Tag nach der Zellaussaat, aNSCs wurden auf die beschichtete Platte befestigt und zeigte die Zellproliferation (2A). Um ihre Wirksamkeit der Proliferation zu bestätigen, wurde BrdU in den Medien gegeben. Nach Inkubation mit BrdU für 2 h wurden die Zellen mit anti-BrdU (ein Marker für die Proliferation) und Anti-Nestin (Marker für neurale Stammzellen) Antikörper leicht gefärbt, was darauf hinweist, dass SCZ-aNSCs aktiv proliferieren und Aufrechterhaltung der Schlüsseleigenschaften Stammzellen (2B). Demzufolge haben sie nicht exhibit Marker für differenzierte Zellen, wie EGFR (ausgedrückt in transient Verstärkungs Zellen) und DCX (ausgedrückt in Neuroblasten) (2C).
Um zu bestätigen, wurden die multiple Differenzierungspotential von SCZ-aNSCs, Wachstumsfaktoren aus dem Kulturmedium entfernt. Nach 6 Tagen wurden die Zellen mit verschiedenen Entscheidungsträgern für differenzierte Zellen immunhistochemisch. Um zeigen die verschiedenen Nachkommen von aNSCs, Marker für Neuronen (TuJ1), Astrozyten (GFAP) und Oligodendrozyten (O4) eingesetzt; alle diese Zelltypen wurden aus der SCZ-aNSCs (Figur 3) erzeugt wird .
Abbildung 1: Die Isolierung des SCZ Region und die Bildung des Neurosphäre. (A) Verfahren für die Präparation des SCZ Region von der erwachsenen Gehirn der Maus. Zur Kultur der SCZ-aNSCs, ein 8 Wochen alten Mäusegehirn auf eine Gehirn-Matrix gelegt (1 mm-Intervallen). Nach dem Schneiden, 1 mm Gehirnscheiben, die die SCZ-Bereich (2-3 mm vom Bregma) aufgenommen wurden seziert (durch die rote gestrichelte Linie). (B) Neurosphäre Bildung. Acht Tage nach der in - vitro - Kultur, primäre Neurosphären (Passage 0) gebildet und agiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Wartung der SCZ-aNSCs als Monolayer - Kultur. (A) Einen Tag nach der sezierten Zellen Aussaat, SCZ-aNSCs wurden befestigt und erweitert auf ein beschichtetes Gericht in einem einschichtigen Weise (links). Drei Tage nach der Wartung, die Anzahl der SCZ-aNSCs erhöht wurde (rechts). (B) Mit BrdU (rot, ein Marker für proliferierende Zellen), Nestin (grün, ein Marker für neurale Stammzellen) und Hoechest33343 (blau, ein Marker für Immunfärbung Kerne). (C) Immunfärbung mit neuralen Stamm- / Vorläuferzellmarker Nestin (rot, ein Marker für Typ B neurale Stammzellen), EGFR (grün, ein Marker für Typ C transiente Verstärkungs Zellen) und DCX (blau, ein Marker für Typ A Neuroblasten). Nuclei wurden mit Hoechest33343 (white) gegengefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Immunfärbung der differenzierten Zellen aus den SCZ-aNSCs. Immunostaining mit Differenzierungsmarker TuJ1 (grün, ein Marker für unreife Neuronen), O4 (rot, ein Marker für Oligodendrozyten) und GFAP (schreienow, ein Marker für Astrozyten). Vergrößerte Bilder werden als Einfügungen gezeigt. Hoechest33343 (blau) wurde für die Gegenfärbung der Kerne verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Dokument beschreibt ein detailliertes Protokoll NSC von der adulten Maus SCZ zu erzeugen und sie für verschiedene Anwendungen zu erhalten. Es gibt drei wichtige Schritte zur Ermittlung der In - vitro - Kultursystem erforderlich zu reinigen und SCZ-NSCs erweitern. Erstens ist es wichtig, sicherzustellen , dass die SCZ Region genau von anderen potentiellen neurogener Bereiche (1B) präpariert wird. Dick und präzise Abschnitte der SCZ Regionen enthielten , wurden mit einem 1 mm Abstand Gehirn Matrix erhalten, und dann wurde eine feine Nadel für die Mikro-Dissektion der SCZ aus anderen kortikalen Regionen (Abbildung 1A) verwendet. Wenn nicht-NSC von benachbarten Geweben, wie der Großhirnrinde, kultiviert werden , mit SCZ-aNSCs, katastrophalen Tod eintritt, was sich negativ auf die Lebensfähigkeit und die Kugelbildung SCZ-NSC 16-18,22 auswirkt. Die Schwanz SCZ (2-3 mm hinter Bregma) wurde zur Erzeugung von deutlichen SCZ-aNSCs als die beste Region bestätigt. Zweitens, die geeignet friate enzymatische Behandlung in der Ernte und Passagierung Schritte ist entscheidend, um eine hohe Ausbeute an Zellen zu erreichen. Dispase II und Papain waren wirksamer als für aNSCs Trypsin isoliert. Die Dissoziation von Zellen für Passagierung mit Dissoziationspuffers anstelle von Trypsin verstärkt ihre Lebensfähigkeit 19. Mechanische Dissoziation und Verreiben mit einer Pipette sollte minimal sein. Drittens wird ein Zellsieb in primäre Kultursysteme zur Entfernung zellulärer Debris nach Gewebe Verdauung verwendet. Jedoch aufgrund der Lokalisierung von SCZ-aNSCs werden diese Zellen nach dem Bruch der weißen Substanz durch Enzymverdau und mechanischen Verreibung erhalten. Während der Filtration mit einem Zellsieb würde eine beträchtliche Menge an Zellen verloren. Daher eine Zelle Sieb ohne die Verwendung von SCZ-aNSCs Kultivierung ist ein besserer Weg, um eine hohe Ausbeute an Zellen zu erhalten.
Während sowohl Neurosphäre Kulturen und Monolayer-Kulturen können zur Wartung von NSC, eine Begrenzung der neuro angewendetKugel Kultur ist, dass einzelne NSCs distanzierte nach der Trennung zufällig aggregiert werden können. Die Aggregationsergebnisse in verschiedenen Größen von Neurosphären. Wenn die Größe eines Neurosphäre einen bestimmten kritischen Wert erreicht hat , wächst die Neurosphären als heterogene Struktur, aufgrund eines Mangels an Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, und Sauerstoff im Kern 20. Neurosphären mit großen Größen sind nicht leicht mit Dissoziationspuffers distanzierte und erfordern längere enzymatische Behandlungszeiten mit umfangreichen mechanischen Zerreiben, was zu niedrigeren Lebensfähigkeit der Zellen Darüber hinaus. Daher wird die Monoschichtkultur System empfohlen SCZ-aNSCs durch mehrere Durchgänge zu erhalten. In einer Monolayer - Kultur - System werden aNSCs stabil als NSC (Typ B) gehalten wird, ohne spontane Differenzierung in spezifizierten Zellen, wie Progenitoren (Typen C und A) (3A). SCZ-aNSCs wurden für längere Zeit agierten, <5 Passagen in einem Neurosphere Format und> 10 Passagen als Monoschicht. Dies ist Nachteileistent mit früheren Ergebnissen, die darauf schließen lassen , dass die Monoschicht - Kultursystem in 21 Langzeitkulturen NSC in vitro beibehält. Jedoch verringert die proliferierenden Geschwindigkeit, und der Anteil der sterbenden Zellen erhöht über 5 Durchgänge. Erweiterte Passagierbarkeit wirkt sich auf die Multipotenz und die neuronale Differenzierung mit erhöhter Chromosomenaberration 22. Daher erweiterten Passagierung Effekte zu vermeiden, wird empfohlen, für die Proliferation und Differenzierung Analyse frühen Passage (<Passage 5) Zellen zu verwenden. Obwohl das Potential zur Selbsterneuerung von SCZ-aNSCs ähnlich ist SVZ-aNSCs weniger neuronale Differenzierung wurde in SCZ-aNSCs 9 gezeigt.
Verfahren zur aNSCs von neurogenen Regionen des erwachsenen Gehirns, einschließlich des SVZ und Gyrus dentatus (DG), wurden 22 aufgebaut isolieren. Obwohl solche Protokolle, die Isolierung und Kultivierung von aNSCs in vitro gefördert haben, gibt es einige Einschränkungen, um eine hohe Anzahl von ErlangungZellen. Viele Protokolle verwenden eine Hirngewebe chopper, die den Verlust von Hirngewebe während des Schneideverfahrens führen kann. Ein weiterer Ansatz aNSCs von neurogenen Regionen zu isolieren, verwendet einen koronalen Schnitt durch das Gehirn mit einem Skalpell. Dies wird durch die Mikrodissektion des SVZ oder der DG entlang der Längsspalte 23 gefolgt. Die Anwesenheit von anderen Hirnregionen können zu anderen Zelltypen , die aNSZ nach folgenden Kriterien Kultur zu verunreinigen, die die Lebensfähigkeit der Zellen in vitro beeinflussen könnte. Mit dem aktuellen Protokoll können viele verschiedene Proben in einem einzigen Experiment verwaltet werden, einschließlich der Kontrollen im Vergleich zu einer Vielzahl von experimentellen Gruppen. Auch Aufschneiden einen Gehirnmatrix überlegen ist ein Gehirn Zerkleinerungswerkzeug, wie es für die Erreichung der NSC aus verschiedenen Hirnregionen mit einer hohen Zellausbeute ermöglicht. Es ermöglicht auch den Vergleich von aNSCs aus verschiedenen Regionen desselben Gehirns.
Transplantation und Engineering von endogenen NSCs wurden considered als mögliche Strategien für die Stammzelltherapie. Hierzu wird in vitro Studien über die Eigenschaften von aNSCs auch umfassend untersucht werden sollten. Daher wird die Einrichtung eines gut charakterisierten in - vitro - Kultursystem hilfreich sein für die Anwendung von NSCs fördern. In diesem Kultursystem wurden die Stammzelleigenschaften von SCZ-aNSCs gut gepflegt, wie es durch die Selbsterneuerung und Multiple-lineage Differenzierung unter den geeigneten Bedingungen belegt. Daher kann dieses Kultursystem für die Erweiterung der SCZ-aNSCs für biologische Untersuchungen und therapeutischen Anwendungen verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
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