Abstract
As células morrem por apoptose, também conhecida como morte celular regulada, adquirir várias novas actividades que lhes permitam influenciar a função de células vivas adjacentes. actividades vitais, tais como a sobrevivência, a proliferação, crescimento e diferenciação, estão entre as muitas funções celulares modulados por células apoptóticas. A capacidade para reconhecer e responder às células apoptóticas parece ser uma característica universal de todas as células, independentemente da linhagem ou órgão de origem. No entanto, a diversidade e complexidade da resposta às células mandatos apoptóticos que grande cuidado em dissecar os eventos de sinalização e vias responsáveis por qualquer resultado particular. Em particular, deve-se distinguir entre os vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas podem influenciar as vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis, incluindo: o reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, libertação de mediadores solúveis pela célula apoptótica, e / ou acoplamento da phagomáquinas cytic. Aqui, nós fornecemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular que são induzidas nas células respondedoras viáveis após a sua exposição a células apoptóticas. Uma grande vantagem do protocolo encontra-se em atenção o que compensa a dissecção do mecanismo pelo qual as células apoptóticas modulam eventos de sinalização dentro de células que respondem. Enquanto que o protocolo é específico para uma linha imortalizada condicionalmente rato renal proximal tubular de células (células BU.MPT), é facilmente adaptado para linhas de células que são não-epitelial de origem e / ou derivado a partir de outras do que o rim órgãos. A utilização de células mortas, como um estímulo introduz vários factores exclusivos, que podem dificultar a detecção de eventos de sinalização intracelular. Estes problemas, bem como estratégias para minimizar ou contorná-los, são discutidas no âmbito do protocolo. A aplicação deste protocolo deve ajudar o nosso conhecimento expansão da ampla influência que as células mortas ou a morrer exercem sobre os seus vizinhos vivos, tanto na saúde como na diseaSE.
Introduction
Apoptose, ou morte celular regulada 1, contribui de forma essencial para a manutenção e desenvolvimento de tecidos. Vistos os mais simples, as licenças de apoptose envelhecido, danificado ou excesso de células de ser eliminados sem danos a tecidos circundantes 2,3. A contribuição de apoptose para a homeostase dos tecidos, no entanto, é consideravelmente mais dinâmico e variado. As células morrem por apoptose adquirir várias novas actividades, tanto secretada e associada à célula, o que lhes permite influenciar a função de células vivas adjacentes 4-10. Estudos anteriores voltadas para a capacidade das células apoptóticas para suprimir a inflamação 11-16, mas as células apoptóticas também modular uma ampla gama de funções celulares, incluindo actividades vitais tais como a sobrevivência 4,9,10, 4,9,10 proliferação, diferenciação 17, migração de 18 anos, e crescimento de 19. Além disso, estes efeitos não são restritas para os fagócitos profissionais, como macrófagoss, mas se estendem a praticamente todos os tipos de células e linhagens de células, incluindo tradicionalmente não fagocíticas, tais como células epiteliais e endoteliais 7,9,10,18-21.
A resposta específica de células vivas adjacentes após a exposição a células apoptóticas depende de vários factores que se relacionam com as células que respondem tanto viáveis e as próprias células apoptóticas. Por exemplo, embora a exposição a células apoptóticas inibe a proliferação de ambas as macrófagos murinos e as células epiteliais tubulares proximais renais (PTECs), estes dois tipos de células diferem dramaticamente na sua resposta de sobrevivência de células apoptóticas 4,6,9,10. Células em apoptose promover a sobrevivência de macrófagos, mas induzir a morte apoptótica de PTECs 4,6,9,10. Notavelmente, a resposta de células apoptóticas podem variar mesmo entre células que respondem da mesma linhagem, dependendo do órgão da célula responder de origem 10 (por exemplo, nos rins contra PTECs epitelial mamáriacélulas) ou do estado de activação 22 (por exemplo, os neutrófilos). Por outro lado, as células apoptóticas podem evocar respostas diferentes na mesma célula, dependendo da natureza do estímulo 10,23 apoptótica ou a fase de apoptose 10,14.
Tendo em conta a diversidade e a complexidade da resposta de células apoptóticas, muito cuidado deve ser tomado em dissecar os eventos de sinalização e responsáveis para vias qualquer resultado particular. Em primeiro lugar, as respostas que requerem interação física direta entre células viáveis e apoptóticos devem ser diferenciados daqueles provocada por mediadores solúveis liberados ou geradas pelo celular por apoptose 3,6-10. Se é necessária a interacção física, em seguida, uma maior diferenciação deverá ser executado. eventos de sinalização pode depender de reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, independente de imersão subsequente, ou na captação de fagocitária, independente do receptor específico que se liga a célula apoptótica 3-7,9,10,19. No último caso, a resposta não é específico para células apoptóticas, e pode ser desencadeada por qualquer material fagocítica 4,6.
A importância destas diferenças pode novamente ser apreciado por contraste as respostas de macrófagos e PTECs renais. Para ambos os tipos de células, a exposição a células apoptóticas altera a actividade da pró-sobrevivência quinase Akt. A modulação é dependente da interacção física, uma vez que a separação de células apoptóticas e de responder de uma membrana de policarbonato de 0,4 um suprime a resposta 4,9,10,19. No entanto, a resposta de PTECs é mediada pelo receptor e independente de fagocitose, enquanto que a resposta de macrófagos é impulsionado por fagocitose 4,9,10,19. Esta conclusão é reforçada pelo facto de a exposição a esferas de látex, um estímulo neutro fagocitária, não tem nenhum efeito sobre a actividade de Akt em PTECs, mas imita o efeito de células apoptóticas em macrófagos 4,9.
"> Embora menos bem estudadas, as células morrem por necrose ou morte acidental de células 1, também modulam a função de células viáveis nas proximidades 3-10,19. Tal como as células apoptóticas, células necróticas exercem os seus efeitos através de uma variedade de mecanismos, nomeadamente a fuga de conteúdo intracelular através da sua membrana celular rompido 3,5,6,9,24. Muitas células, incluindo PTECs e macrófagos, possuem receptores não concorrentes distintos para as células a morrer por necrose 5,9. Engagement desses receptores induz eventos de sinalização que são muitas vezes oposta às induzidas por acoplamento dos receptores de células apoptóticas 4-10,19. por exemplo, em PTECs, células necróticas aumentar a fosforilação da Akt, enquanto que as células apoptóticas diminuir a fosforilação 9,10,19. Aqui, descrevemos um protocolo para identificar eventos de sinalização intracelular induzidos em PTECs rins viáveis através do reconhecimento mediada pelo receptor de PTECs apoptóticos adjacentes
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Protocol
1. Preparações
Nota: Neste protocolo, duas ou mais linhas celulares ou culturas de células primárias, estão independentemente preparado sob condições específicas. Estas preparações incluem células em apoptose (Protocolo 1), células necróticas (Protocolo 2), e células de resposta saudáveis (Protocol 3). Após a preparação independente, as células apoptóticas ou necróticas são adicionados a células de resposta e a transdução de sinal resultante é monitorizada (Protocolos 4, 5 e 6).
- Prepare meio de cultura e reagentes
- Preparar 500 mL de meio de cultura (para utilização, quando o crescimento de células sob condições permissivas, ver secção 1.2), combinando o seguinte: 1x Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de glucose, 584 mg / L ʟ-glutamina, 110 mg / l de piruvato de sódio, 100 unidades / mL de penicilina-estreptomicina, 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS), e 10 unidades / mL de interferão-γ (IFN-γ).
- Preparar 500 ml de meio de cultura de B (para uso WHen células-fome de soro sob condições não permissivas, ver secção 1.2), omitindo de FBS e IFN-γ da receita do meio de cultura de A. Para cultivar células sob condições não permissivas (antes de soro-inanição), adicionar 10% v / v de FBS para meio de cultura de B.
- Prepare a 0,4% (v / v) de paraf ormaldeído, pH 7,2, em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) a partir de 4% de paraformaldeído estoque para a fixação de células mortas.
Nota: O paraformaldeído é tóxico, e cautela apropriada deve ser exercido na sua utilização.
- células BU.MPT Cultura
- Descongele de azoto líquido de um frasco de células BU.MPT.
Nota: BU.MPT é uma linha de ratinhos renal proximal tubular célula epitelial (PTEC) derivado de um ratinho transgénico tendo uma (TS) mutação sensível à temperatura (tsA58) do antigénio tumoral grande de SV40 (TAG) sob o controlo do rato grande complexo de histocompatibilidade (MHC) H-2K b classe I promotor 25,26. - células da placa em polystyr estérileno plasma vácuo-gás tratados pratos de cultura de tecidos (~ 5 X 10 6 células por prato de 100 mm de diâmetro).
- Cultivar células sob condições permissivas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
Nota: As condições permissivas, que são definidos como a cultura em 33-37 ° C na presença de IFN-γ, permitir uma expressão estável do transgene TAg tsA58-mutada. Ao contrário das culturas primárias de rim de rato, PCTEE que não sobrevivem mais do que uma única passagem ou duas, BU.MPT cultivadas sob condições permissivas podem ser passadas indefinidamente.- células de passagem pelo menos três vezes após o descongelamento antes de usá-los em um experimento.
- Para as células de passagem, adicionar 1 ml de tripsina a 0,05% por placa de 100 mm, e incuba-se numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 a 37 ºC durante 5 min. Neutraliza-se a tripsina por adição de 10 mL de meio A. Aspirar as células isoladas, e divididas 1: 3 a 1: 5 em novas 100 mm de poliestireno estéril de plasma de vácuo-gás tratado TISSplacas de cultura de ue. Adicionar meio A para levar o volume até um total de 10 mL por placa de 100 mm.
- células de passagem pelo menos três vezes após o descongelamento antes de usá-los em um experimento.
- Em preparação para uso experimental como células que respondem, crescer as células até à confluência numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições não permissivas (isto é, a 39 ° C na ausência de IFN-γ [meio B, contendo 10% v / v de FBS]).
Nota: Sob condições não permissivas, a expressão do transgene TAg-tsA58 mutado é inibida por> 95%, e células BU.MPT se comportam como culturas primárias de rim de rato PCTEE.
- Descongele de azoto líquido de um frasco de células BU.MPT.
2. Preparação de células em apoptose BU.MPT (Protocolo 1)
Nota: Este protocolo é específico para células BU.MPT como fonte de células em apoptose, e estaurosporina como o método de indução de apoptose. Em alternativa, uma outra linha celular ou cultura celular primária, pode ser utilizada como uma fonte de células apoptóticas, com a apoptose induzida por Protoco padronizadoLS para esse tipo de célula particular e método de indução de apoptose.
- Após passagem para 100 mm de diâmetro de poliestireno estéril de plasma de vácuo-gás tratados pratos de cultura de tecidos, as células crescer até à confluência BU.MPT numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições permissivas (isto é, a 37 ° C em meio de cultura A na 10 ml por placa de 100 mm), conforme descrito no ponto 1.2.3.
- Lavar a monocamada de células aderentes três vezes com meio de cultura B, utilizando 10 mL por lavagem.
- Induzir a apoptose através da incubação das células em meio de cultura contendo estaurosporina B, um inibidor de proteína cinase não selectivos, a 1 ug / mL durante 3 horas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 a 37 ºC.
- Aspirar o meio contendo estaurosporina contendo "flutuante" células apoptóticas que têm destacadas a partir da monocamada. Centrifugar este meio durante 10 minutos a 500 xg, descartar o sobrenadante, o sedimento de lavar três vezes com meio de cultura B, eadicionar o sedimento volta a células recolhidas no passo seguinte, 2.5.
- Separe as células aderentes restantes passos de 2,3 e 2,4 por adição de 5 mM (ácido etilenodiaminotetracético) de EDTA em 1x Ca 2 + - + 2 e Mg livre de DPBS a 1 mL por placa durante 5 min. Aspirar o meio contendo EDTA contendo células apoptóticas destacadas, e reunir as células isoladas com os "flutuante" células apoptóticas do passo 2.4 em um tubo estéril de centrífuga de 15 mL de poliestireno.
- Lavam-se as células apoptóticas três vezes por centrifugação durante 10 min a 500 xg e re-suspensão em 10 mL de 1x de Ca + 2 - e Mg + 2 Livres de DPBS por lavagem.
- Após a última lavagem, suspender as células em apoptose em fresco meio de cultura B em ~ 5 x 10 6 células por ml antes do uso para estimular células de resposta. Em alternativa, fixar as células apoptóticas foram lavadas em 0,4% (v / v) de paraf ormaldeído em 1X DPBS durante 30 minutos e, em seguida lavar três vezes com culturameio B, antes da suspensão em meio de cultura B.
- Conforme apropriado, confirmar a indução da apoptose por citometria de fluxo utilizando uma preparação em separado de células apoptóticas (ou reservando algumas células para esta finalidade), como previamente descrito 6,9,10,15.
Nota: as células iniciais apoptóticos têm membranas celulares intactas, e aparecem como iodeto de propídio (PI) células -negative e anexina V positiva de diminuição do tamanho da célula (em relação a células viáveis). Final de células em apoptose têm membranas celulares não intactos, e aparecem como células PI-positivas e anexina V positiva de diminuição do tamanho das células. Usando o protocolo atual, preparações típicas contêm ~ 85% de apoptose precoce e ~ 15% de células em apoptose final. - Adicionar células apoptóticas de células de resposta BU.MPT (Protocolo 3) a uma razão apoptótica-a-respondedor de células de 1: 1, quer directamente, quer após a fixação de células apoptóticas durante 30 minutos com 0,4% (v / v) de paraf ormaldeído em 1X DPBS .
Nota: fixação celular por apoptose antes da estimulação de respostas devenão afectam os resultados, a menos que os eventos de sinalização observados são devidos a libertação de um mediador solúvel (Tabela 1).
3. Preparação de células necróticas BU.MPT (protocolo 2)
Nota: Este protocolo é específico para células BU.MPT como fonte de células necróticas, e aquecimento como o método de indução de necrose. Em alternativa, uma outra linha celular ou cultura celular primária, pode ser utilizada como uma fonte de células necróticas, com necrose induzida por protocolos normalizados para esse tipo de célula particular e o processo de indução da necrose.
- Após passagem para 100 mm de diâmetro de poliestireno estéril de plasma de vácuo-gás tratados pratos de cultura de tecidos, as células crescer até à confluência BU.MPT numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições permissivas (isto é, a 37 ° C em meio de cultura A na 10 mL por prato), conforme descrito no ponto 1.2.3.
- Lavar a monocamada de células aderentes três vezes com meio de cultura B, usando10 mL por lavagem.
- Separe as células por adição de EDTA a 5 mM em 1x Ca + 2 - e Mg + 2 Livres de DPBS a 1 mL por placa durante 5 min. Aspirar o meio contendo EDTA contendo as células isoladas, e adicionar a suspensão de células para um tubo de poliestireno estéril de centrífuga de 15 mL.
- Lavam-se as células três vezes por centrifugação durante 10 min a 500 xg e re-suspensão em 10 mL de Ca + 2 - e Mg + 2 Livres de DPBS por lavagem.
- Após a última lavagem, suspender as células em meio de cultura fresco B a 5 x 10 ~ 6 células por mL.
- Induzir a necrose de células por aquecimento a 70 ºC durante 45 min num banho de água, suavemente vórtice da suspensão de células a cada 10 min.
- Incubar as células durante 2 horas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 a 37 ° C. Suavemente vortex a suspensão de células a cada 15 min.
- Conforme apropriado, confirmar a indução de necrose por citometria de fluxo utilizando uma preparação separada de necrotic células (ou reservando algumas células para esta finalidade), como anteriormente descrito 6,9,10,15.
Nota: as células necróticas ter rompido as membranas celulares, e aparecem como células PI-positivas aumentou de tamanho de célula (em relação a células viáveis). Usando o protocolo atual, preparações típicas contêm ≥ 95% de células necróticas. Alternativamente, a indução da necrose e perda da integridade da membrana pode ser confirmada por coloração com azul de Tripano.
4. Preparação de células BU.MPT Responder (Protocol 3)
Nota: Este protocolo é específico para células BU.MPT como fonte de células de resposta. Em alternativa, uma outra linha celular ou cultura celular primária, podem ser utilizados como células de resposta. Antes da utilização experimental, quiescência durante a noite pode ser induzida por protocolos normalizados dentro do laboratório.
- Cultivar células BU.MPT em 100 mm pratos de cultura de tecidos estéreis sob condições permissivas em meio de cultura A a 10 mL por placa, até que consigam ~85% de confluência.
- cultura Aspirar meio de A, e lave as células três vezes com meio de cultura B em 10 mL por lavagem. Soro-privar as células durante a noite, durante 18 a 24 horas numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2 sob condições não permissivas (isto é, a 39 ° C em cultura de meio B a 10 ml por placa), tal como descrito na secção 1.2 0,4, de modo a induzir a quiescência. Alternativamente, crescer as células em meio de cultura B mais 10% (v / v) de FBS a 39 ºC durante um dia antes de as células de soro durante a noite em meio de fome cultura B sem FBS.
- Rotular um prato de cultura de tecidos em separado das células BU.MPT confluentes para cada condição experimental.
- Incluem os seis seguintes condições: a estimulação de respostas BU.MPT viáveis com factor de veículo ou de crescimento epidérmico (EGF) durante 15 min, após a sua exposição durante 30 minutos para que, ou não, células apoptóticas, ou células necróticas.
Nota: a exposição a células mortas podem estimular ou inibir o nível de actividade de um given molécula sinalizadora. A estimulação é melhor detectado acima de uma linha de base baixa (por exemplo, ausência de EGF), enquanto que a inibição é mais detectado a partir de uma linha de base elevada (por exemplo, a presença de EGF). Uma vez que o efeito de estimulação com células mortas é a priori desconhecido, recomenda-se realizar todos os estudos, tanto na ausência e na presença de EGF.
5. Estimulação de células de resposta com apoptose e células necróticas (Protocolo 4)
- Aspirar meio de cultura B, desde pratos pré-rotulados de repouso (privadas de soro) BU.MPT células de resposta (Protocolo 3).
Nota: Após cultura durante a noite sob condições não permissivas, as células BU.MPT deve comportar-se como culturas primárias de rim de rato PCTEE. - Por placa de 100 mm, adicione 2 mL de um dos seguintes procedimentos: meio de cultura B (sem células); suspensão de células apoptóticas em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 1); ou de suspensão celular por necrose em ~ 5 x 10 6 células por ml in meio de cultura B (protocolo 2).
- Distribuir a suspensão 2 mL de células mortas uniformemente sobre a placa de 100 mm e manter o tempo para que eles se depositam no mínimo. Para alcançar este objectivo, a distribuir gota de suspensão de células mortas a gota, com uma ampla pipeta de ponta ao longo de toda a superfície dos pratos de células de resposta. Utilizar um volume de 2 ml, tal como um compromisso entre a minimizar o tempo de estabilização e evitar a aglomeração de células mortas.
Nota: O uso de uma suspensão de células mortas, como um estímulo implica um certo número de considerações especiais, que são descritos abaixo em maior detalhe (Tabela 2 e Discussão). - Alcançar uma proporção de células mortas-a-respondedor de ~ 1: 1 por adição de 2 mL de células mortas em ~ 5 x 10 6 culas por ml para uma placa de 100 mm confluentes, que contém ~ 10 x 10 6 células. Alternativamente, a fim de estabelecer a dependência da dose de quaisquer eventos de sinalização observadas, variar a proporção de morte para células que respondem de forma contínua por diluição progressiva em cultoure meio B das suspensões de células mortas preparados nos protocolos nºs 1 e 2.
- Distribuir a suspensão 2 mL de células mortas uniformemente sobre a placa de 100 mm e manter o tempo para que eles se depositam no mínimo. Para alcançar este objectivo, a distribuir gota de suspensão de células mortas a gota, com uma ampla pipeta de ponta ao longo de toda a superfície dos pratos de células de resposta. Utilizar um volume de 2 ml, tal como um compromisso entre a minimizar o tempo de estabilização e evitar a aglomeração de células mortas.
- Agite suavemente os pratos, em seguida, incuba-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
- Após 30 min, estimulam as células de resposta, quer com veículo ou 50 nM de EGF, de acordo com o pré-marcação do prato de cultura.
- Incubar durante 15 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
- Lave as células mortas pela adição de 5 mL de gelada 1x DPBS, agitando o prato, e aspirar o fluido da lavagem. Repita três vezes.
- Colocar imediatamente os pratos de células de resposta em gelo para posterior processamento.
- Prepare lisados celulares
- Preparar tampão de lise celular contendo o seguinte: 1 × solução salina tamponada com Tris (TBS), pirofosfato de sódio 10 mM, 0,5% w / v de desoxicolato, 0,1% w / v de SDS, 10% glicerol, e 25 mM de fluoreto de sódio.
- Imediatamente antes da lise celular, adicione a seguinte na ordem exata dada na indconcentrações icated: Mini cocktail inibidor da protease livre de EDTA (1 comprimido por 10 mL de tampão de lise), 10% (v / v) de Triton X-100, ditiotreitol 1 mM (DTT), fluoreto de fenilmetanossulfonilo 1 mM (PMSF), e 10 mM ortovanadato de sódio.
- Adicionar 700 ul de tampão de lise de células gelada por placa de 100 mm de fresco estimuladas células respondedoras em gelo a partir do passo 5.7. Raspar as células com um raspador de células, e transferir o lisado para pré-refrigerada microtubos de 1,5 mL. Manter os tubos em gelo durante 15 min.
- Sonicar lisados em gelo com 10 pulsos de 20 Hz, menos de um segundo cada de duração. Evitar a criação de espuma na interface gás / líquido, tal como este pode sobreaquecer as amostras. Totalmente mergulhe a sonda de ultra-sons para os microtubos contendo lisados antes de ligar o sonicator, e alternar a sonicator antes de retirar a sonda a partir dos lisados.
- Centrifuga-se a 20000 xg durante 10 min a 4 ° C, transfere-se os sobrenadantes em microtubos pré-gelada fresca, E armazenar a -70 ºC.
- Efectuar a electroforese em gel e imunotransferência em sobrenadantes de lisados, como anteriormente descrito 6,9,10,15.
- Preparar tampão de lise celular contendo o seguinte: 1 × solução salina tamponada com Tris (TBS), pirofosfato de sódio 10 mM, 0,5% w / v de desoxicolato, 0,1% w / v de SDS, 10% glicerol, e 25 mM de fluoreto de sódio.
6. Prevenir o contato físico direto entre Metas e respondedores Usando um semipermeável Policarbonato Membrana (Protocolo 5)
- Prepare células de resposta BU.MPT de acordo com o Protocolo nº 3, com uma exceção; crescer as células em cultura de tecidos de poliestireno estéril tratada conjuntos de 12 poços.
- Em poços selecionados, coloque um sistema de suporte permeável contendo uma membrana de policarbonato de 0,4 mm para evitar a interação física entre as células mortas e de resposta. Incluem poços de controlo, sem uma membrana na mesma experiência.
- Aspirar meio de cultura B de poços experimentais de células BU.MPT de resposta privadas de soro.
- Seguir o protocolo 4 para a estimulação de células de resposta com células apoptóticas ou necróticas, com as seguintes modificações:
- Por poço da 1cluster de 2 bem, adicione 0,1 mL de um dos seguintes procedimentos: meio de cultura B (sem células); suspensão de células apoptóticas em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 1); ou suspensão celular necrótica em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 2).
Observação: Como bem confluente de um cluster de 12 poços contém ~ 0,5 x 10 6 células, a adição de 0,1 mL de células mortas em ~ 5 x 10 6 culas por mL produz uma proporção mortos-a-respondedor celular de ~ 1: 1. - Para poços que contêm o sistema de suporte permeável, adicionar as células mortas no topo da membrana de policarbonato de 0,4 um dentro do sistema de suporte permeável, de modo que não existe qualquer interacção física directa entre células mortas e respondedoras.
- Por poço da 1cluster de 2 bem, adicione 0,1 mL de um dos seguintes procedimentos: meio de cultura B (sem células); suspensão de células apoptóticas em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 1); ou suspensão celular necrótica em ~ 5 x 10 6 culas por mL em meio de cultura B (Protocolo 2).
7. A inibição da fagocitose com citocalasina D (Protocolo 6)
- Prepare células de resposta BU.MPT de acordo com o Protocolo nº 3.
- Prepara-se o inibidor do citoesqueleto citocalasina D na dimethil sul f óxido (DMSO) a 4 mg / ml (1000 ×). Adicionar pratos de pré-marcados de células de resposta, quer BU.MPT 10 ul de veículo (DMSO) ou 10 mL de citocalasina D para alcançar uma concentração final de 4 ug / mL em 10 mL de meio de cultura B.
Nota: A esta concentração de citocalasina D, a fagocitose por células BU.MPT e uma linha celular de macrófagos foi inibida por ≥90% 9,10. - Incubar durante 2 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% (v / v) de CO2.
- Siga o protocolo nº 4 para a estimulação de células de resposta com células apoptóticas ou necróticas.
- Conforme apropriado, confirmar a inibição da fagocitose de células mortas por citometria de fluxo utilizando uma preparação em separado de células mortas e as células de resposta (ou reservados para esta finalidade), como previamente descrito 9,10.
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Representative Results
Na Figura 1, é proporcionado um diagrama esquemático que descreve as etapas de temporização e críticos envolvidos na preparação de células apoptóticas (Protocolo 1) e células necróticas (Protocolo 2) e a estimulação de células de resposta com suspensões de células apoptóticas e necróticas (Protocolo 4).
Na Figura 2, que fornecem resultados representativos que mostram o efeito de células apoptóticas na fosforilação das duas isoformas da serina-treonina quinase de glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3), a GSK-3α e GSK-3β. A GSK-3α / β tem um papel proeminente na regulação da proliferação celular e sobrevivência, bem como o seu papel importante no metabolismo da glicose. A fosforilação de GSK-3α na serina-21 e GSK-3β na serina-9 inibe a actividade da cinase e, por sua vez, leva a uma diminuição da fosforilação e aumento da estabilização da β-catenina. p-cateninaem seguida, transloca-se para o núcleo, onde se promove a transcrição de genes que se sabe estimular a proliferação de células e inibir a apoptose. Portanto, o aumento da fosforilação de GSK-3α / β está associada com o aumento da proliferação e sobrevivência, ao passo que diminuiu a fosforilação de GSK-3α / β correlaciona-se com a diminuição da proliferação e sobrevivência.
Exposição de respondedores BU.MPT quiescentes para células apoptóticas, durante 30 minutos a fosforilação basal fortemente inibida de GSK-3α / β (Figura 2A). Do mesmo modo, a exposição prévia a alvos apoptóticos para 30 min inibiu fortemente subsequente factor de crescimento epidérmico (EGF) a fosforilação induzida de GSK-3α / β (Figura 2A). Em contraste, a exposição de respondedores BU.MPT para células necróticas não teve efeito sobre a fosforilação quer basal ou induzida por EGF de GSK-3α / β.
para Prevent interacção física entre respondedores BU.MPT e células apoptóticas, BU.MPT respondedores foram cultivadas em um sistema de suporte permeável e separados a partir de alvos apoptóticos por uma membrana de policarbonato de 0,4 um. Prevenção da interacção física entre respondedores BU.MPT e células apoptóticas aboliu a capacidade de alvos apoptóticos para inibir a fosforilação de GSK-3α / β (Figura 2B). Para avaliar o papel de fagocitose, foi utilizado o citoesqueleto cytochalasin inibidor D para prevenir a absorção fagocíticas de células mortas. A inibição da fosforilação de GSK-3α / β em resposta a células apoptóticas ocorreu na ausência de fagocitose (Figura 2C). Nós mostramos anteriormente que citocalasina D, na concentração utilizada, inibe PCTEE e fagocitose de macrófagos por ≥90% 9,10. Tomados em conjunto, os nossos resultados mostram que a inibição mediada por células de apoptose de fosforilação de GSK3α / β requer betwe interacção física directa en metas e células de resposta, mas é independente da fagocitose.
Figura 1. Esquema para indução de Sinalização Intracelular Eventos em células de resposta viáveis por interação física com células vizinhas submetidos a morte celular. Os gráficos de linhas representam os eventos de sincronização e críticos na preparação de célula de (A) apoptótica (Apo) e necrótica (B) (necro) suspensões celulares de células BU.MPT, e na (C), a estimulação de resposta BU.MPT viável células com suspensões de células apoptóticas ou necróticas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. A inibição da fosforilação da GSK3α / β em células BU.MPT Responder após exposição a células em apoptose requer interação célula-célula direto, mas é independente da fagocitose. Células de resposta BU.MPT privadas de soro foram pré-tratadas durante 2 h com (A, B) ou veículo (C) citocalasina D (4 ug / mL), e em seguida estimuladas durante 30 min com as células não (-), as células apoptóticas (Apo ), ou células necróticas (NEC) em uma célula morta com respondedor proporção de células de 1: 1. As células de resposta foram então lavadas e incubadas durante mais 15 min na ausência ou na presença de EGF (50 nM), antes da colheita. A fonte de células apoptóticas foi BU.MPT células tratadas com estaurosporina. A fonte de células necróticas foi células BU.MPT tratados termicamente. Interação entre as células mortas e respondedores BU.MPT era ou (A, C) desimpedida, permitindo directomorto célula-respondedor interacção física, ou (B) com separação de células mortas e respondedores por uma membrana de policarbonato de 0,4 um em um sistema de suporte permeável. As células mortas e células de resposta não-aderentes foram removidas por lavagem, e BU.MPT respondedor lisados celulares foram sondadas com anticorpos GSK3α / p anti-fosforilados como mostrado. O carregamento igual foi confirmada através de sondagem para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato total (GAPDH). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Efeito sobre o evento de sinalização assumindo que este mecanismo | |||||||
| Intervenção | mediador solúvel | O reconhecimento mediado por receptores | fagocitose | ||||
| Fixação de células apoptóticas * | Eliminação | Persistência | Persistência | ||||
| A separação física de células apoptóticas e de resposta † | Persistência | Eliminação | Eliminação | ||||
| Ultracentrifugado meio condicionado a partir de células que sofrem apoptose como stimulus¶ | Persistência | Eliminação | Eliminação | ||||
| células necróticas como estímulo | Eliminação | Eliminação ou resposta dirigidas em sentidos opostos (por exemplo, inibição contra o estímulo) | Persistência | ||||
| esferas de látex como estímulo | Eliminação | Eliminação | Persistência | ||||
| inibição farmacológica da fagocitose | Persistência | Persistência | Eliminação | * Resultados previstos assumir que a fixação não altera determinantes de superfície crítica responsáveis pelo reconhecimento e / ou fagocitose mediada por receptor. | |||
| † resultados previstos implica dois pressupostos: primeiro, que o mediador solúvel é suficientemente pequeno para passar através dos poros da membrana que separa o apoptótica e células que respondem, e segundo, que qualquer vesículas galpão ou microvesículas, corpos apoptóticos, muitas vezes denominados, são demasiado grandes para passar através dos poros da membrana. Um papel para vesículas ou microvesículas seria sugerido por uma falta de concordância com os observados eventos de sinalização com separação física de células apoptóticas e de resposta em comparação com meio condicionado ultracentrifugado. | |||||||
| ¶ Ultracentrifugação é necessário para remover quaisquer corpos apoptóticos ou outra vertente material insolúvel que pode imitar a EFFE (20.000 x g durante 30 min)CTS da célula apoptótica intacta. | |||||||
Tabela 1. Identificação do Mecanismo (s) responsáveis pela sinalização Eventos em células viáveis após exposição a células em apoptose. Várias estratégias experimentais simples são fornecidas para diferenciar entre o mecanismo (s) potencial responsável por acontecimentos de sinalização observadas após exposição a células apoptóticas. Estes mecanismos incluem: interacção física da célula apoptótica com receptores específicos na célula que responde, libertação de mediadores solúveis da célula apoptótica, e acoplamento de máquinas fagocítica da resposta celular.
| emissão experimental | Estratégias disponíveis para minimização e / ou evasão |
| número restritocélulas de apoptose por célula responder (~ 1: 1). | 1. Aumentar o número de células apoptóticas, mas a proporção de células apoptóticas-a-respondedor deve ser mantido <2: 1. * |
| Necessidade de sedimentação dependentes da gravidade de células em apoptose. | 1. minimizar o volume do meio em que as células apoptóticas são suspensos. |
| 2. Centrifugar a placa ou prato para accionar as células apoptóticas através do meio de suspensão mais rapidamente. | |
| desigual distribuição espacial de células apoptóticas. | 1. distribuir gota cuidadosamente a suspensão de células apoptóticas a gota, com uma ampla pipeta de ponta ao longo de toda a superfície dos pratos de células de resposta. |
| 2. Evitar a pratos de cultura ou de poços com um diâmetro <35 mm, em que os efeitos do menisco pode levar a distribuições irregulares. | |
| A heterogeneidade da população de células apoptóticas. | 1. Use um indutor forteda apoptose. |
| 2. Após a indução, corrigir as células em apoptose com paraformaldeído, e classificar por citometria de fluxo para obter uma população mais uniforme. | |
| rácios de células * No apoptótica-a-respondedor> 2: 1, as células em apoptose irá formar um tapete confluentes e células em apoptose adicionais deixará de fazer contato direto com células de resposta | |
Tabela 2. Experimental problemas associados com a utilização de uma suspensão celular como um estímulo de sinalização intracelular Eventos. Vários obstáculos experimentais associados com a utilização de uma suspensão de células como um estímulo são listados, bem como estratégias para a sua solução parcial.
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Discussion
Apresentamos aqui um protocolo para a caracterização dos acontecimentos de sinalização intracelular induzida em células viáveis após a sua exposição a células que sofrem apoptose, ou outras formas de morte celular. O protocolo enfatiza os vários mecanismos pelos quais a exposição a células apoptóticas podem modulam vias de sinalização intracelulares dentro das células respondedoras viáveis. Estes mecanismos incluem: a interacção (via ponte moléculas ou determinantes da superfície sobre a célula morta ou suas vesículas de hangar e microvesículas, muitas vezes denominados corpos apoptóticos) com receptores específicos na célula respondedor; a liberação de mediadores solúveis (ou mesmo sua geração extracelular 27); eo engajamento da máquina fagocítica. Em circunstâncias em que a fagocitose substancial ocorre, um mecanismo adicional a ser considerado é a entrega de mediadores, tais como microARN, enriquecida no interior da célula apoptótica ou suas vesículas 21. O significado do nosso protocolo, em comparação com ometodologias utros, reside na sua dissecação cuidadosa dos vários mecanismos pelos quais as células apoptóticas podem modular a transdução do sinal dentro das células que respondem. Uma grande vantagem é que a maioria das técnicas necessárias são simples e padrão de cultura de células.
Enquanto o protocolo é específico para células BU.MPT, uma linha PCTEE rato renal imortalizada, como a fonte de ambas as células mortas e respondendo, adaptação do protocolo para outras linhas celulares ou culturas celulares primárias é simples e de fácil implementação. Além disso, como nas nossas publicações anteriores, a fonte de células mortas e responder não precisa ser, necessariamente, o mesmo 9,10,19. Enquanto nós descrevemos o uso de estaurosporina e de calor como indutores de apoptose e necrose, respectivamente, o modo e os gatilhos de morte celular pode também variar. Embora os eventos de sinalização induzidos em respondedores BU.MPT após a exposição a células apoptóticas são largamente independente do modo de indução da apoptose, que have observadas algumas diferenças 9,10. Por esta razão, nós recomendamos resultados principais a replicar com vários disparadores diferentes de morte celular por apoptose. Por exemplo, se as células altamente fagocíticas, tais como macrófagos, são utilizados como respondedores 4,6, ou, se a duração da interacção entre respondedores e células mortas é tempo suficiente para a fagocitose substancial a ocorrer, em seguida, poderá considerar-se um indutor não-tóxico de apoptose, tais como ultravioleta-ou irradiação gama 4,9,10, para descartar potencial entrega fagocítica da toxina. Métodos alternativos de indução de necrose pode também ser considerado. Embora se tenha obtido resultados idênticos com aquecimento e congelação-descongelação das células, a extensa aglomeração de células e detritos que ocorre com congelação-descongelação tornar a sua utilização problemática.
Várias estratégias simples podem ajudar a elucidar o mecanismo particular responsável por quaisquer eventos de sinalização observadas após exposição a células apoptóticas (Tabela 1 Tabela 1, o efeito sobre o evento de sinalização observadas podem identificar o mecanismo responsável. Por exemplo, no caso de reconhecimento mediado pelo receptor da célula apoptótica, o evento de sinalização deve persistir Apesar da fixação da célula apoptótica, e deve ser eliminado com a substituição de células apoptóticas por meio condicionado ou pérolas de látex, bem como com a separação física de células mortas e responder. Em resposta a células necróticas, o evento de sinalização deve ser eliminada ou dirigidas em sentidos opostos (por exemplo, inibição contra o estímulo).
Existem várias consequências desta relação de células mortas-se responder que pode restritaslevar a uma redução ou obscurecimento de eventos de sinalização. Para interagir fisicamente com uma célula de resposta viável, um celular por apoptose deve primeiro resolver através da coluna do meio de suspensão. Mesmo com volumes mínimos, o tempo para o assentamento de células podem ser apreciáveis, tanto tempo quanto 10 a 20 min. eventos de sinalização intracelular irá, assim, ser descoordenados entre células que respondem. Assim, o contato inicial entre células de resposta e mortas não pode ser precisamente cronometrado, mas cai dentro de uma certa forma ampla gama de vezes. Para a sinalização de eventos que ocorrem numa escala de tempo mais curto do que a requerida para a resolução, esta falta de sincronização pode levar a um obscurecimento do sinal de tal modo que já não é distinguível de fundo. Mesmo sinais de duração prolongada, se não de magnitude suficiente, pode ser suscetível a esse problema.
Em adição a estes problemas temporais, matérias espaciais também podem afetar adversamente os resultados. efeitos meniscais, especialmente em poços e pratos de sdiâmetro Mall (por exemplo, cultura de tecidos de poliestireno tratada agregados de 96 poços), ou correntes de fluido geradas por pipetagem vigorosa também pode levar a uma distribuição não uniforme de células mortas, criando desse modo um estado de festa ou fome entre respondedor células. Uma vez que o sinal medido deriva do que de todas as células de resposta em um único poço ou placa, a variação na captura de células mortas pode obscurecer sinais mais fracos.
Um último aspecto refere-se à heterogeneidade da população de células apoptóticas. Mesmo com uma forte gatilho de apoptose, tais como estaurosporina, a qualquer preparação de células mortas conterá células em vários estágios do processo de morte. Isto torna-se relevante, se a força da resposta da célula apoptótica depende da sua fase no processo de morte 10,14. Uma vez que, em média, cada célula respondendo encontra apenas uma célula apoptótica, heterogeneidade, neste caso, pode levar a um enfraquecimento do evento global detectado sinalização. mesa 2
Existem várias outras preocupações experimentais associados exclusivamente com o uso de células mortas, como um estímulo. Mais importante, as condições de cultura podem afectar não apenas as células que respondem, mas também as próprias células mortas. Por exemplo, proteínas séricas, se presente, pode anexar à superfície da célula morta, e aumentar ou inibir o seu reconhecimento por células que respondem. Na solução de um resultado incoerente, ou um resultado diferente do relatado na literatura, deve ser dada atenção às seguintes condições de cultura (tanto para responder e células mortas): grau de confluência, número de passagens, presença de soro, inativação térmica de soro e natureza e duração da imobilidade. Finalmente, é preciso estar ciente de que a morte celular é um aspecto inexorável de toda a cultura de células, e células de resposta são, portanto, continuamente expostos a um nível baixo de mortoscélulas. Esta exposição pode potencialmente afectar a resposta experimental para um bolus de células mortas, uma vez que os próprios sinais em estudo estão a ser induzida continuamente. modulação do sinal podem surgir através de percursos de realimentação normais, ou mesmo através de selecção de uma subpopulação de células que respondem, especialmente se os eventos de sinalização induzidos envolvem proliferação ou sobrevivência.
Em resumo, descrevemos um protocolo para a determinação dos acontecimentos de sinalização intracelular induzida em células viáveis pela sua interacção fisica com as células mortas ou moribundas adjacentes. Embora o foco é predominantemente em eventos de sinalização induzidos por reconhecimento mediado pelo receptor de células mortas, o protocolo também permite a identificação dos eventos de sinalização induzidos por absorção fagocítica ou a libertação de mediadores solúveis de células mortas. A utilização de células mortas, como um estímulo introduz vários factores exclusivos, que podem dificultar a detecção de eventos de sinalização intracelular. A consciência destes ufactores nique, bem como os vários mecanismos pelos quais as células mortas modulam a sinalização intracelular, é crítica para a concepção e interpretação de experiências dentro deste campo crescente de estudo. O protocolo descrito aqui deve ajudar na compreensão dos mecanismos pelos quais as células mortas ou a morrer afetam seus vizinhos vivos na saúde e na doença.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
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