Summary
파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.
Abstract
파킨슨 병 (PD)에서 운동 완만, 강성 및 진동에지도하는 SNC에서 도파민 뉴런의 발음 변성 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실이있다. 형광 마커를 사용하여 기본 복부 중뇌 (VM) 문화 생활 도파민 신경 세포의 식별은 고정 된 세포의 면역 염색에 의존하지 않고 이러한 신경 세포의 선택적 취약점을 연구하는 다른 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 분리, 해리, 문화 마우스 VM 신경 삼주합니다. 우리는 그 다음의 (a 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터에 의해 구동) eGFP는 형광을 이용하여 문화에서 도파민 신경 세포를 식별합니다. 개별 뉴런 유리 가능한 Micropipette를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 수확된다. 다음으로, 우리는 수확 된 세포 용균 및 단일 세포 RNA-SEQ 라이브러리 (1, 2)를 생성하는 cDNA 합성 및 트랜스포존 매개 "tagmentation를"행위엉덩이 = "외부 참조"> 3, 4, 5. 품질 제어 검사를 통과 한 후, 단일 셀 라이브러리는 서열화되고 후속 분석은 유전자 발현을 측정하기 위해 수행된다. 우리는 개인의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 사체 결과를보고한다. 우리는 수확 서열 된 라이브 TH-eGFP는 세포의 100 % 도파민 신경 세포라고보고한다. 이러한 기술은 신경 과학 및 분자 생물학에서 광범위하게 응용 프로그램을 제공합니다.
Introduction
파킨슨 병 (PD)는 불치, 노화와 관련된 퇴행성 신경 질환이다. 이 비교적 흔한 질환의 원인은 제대로 이해 남아 있습니다. 운동 완만, 강성 및 진동의 진단 임상 양상에 이르는 Substantia 그라 (SNC)에서 도파민 뉴런의 뚜렷한 신경 세포의 변성과 뇌 전반에 걸쳐 광범위하게 신경 세포의 손실은있다.
SNC의 도파민 신경 세포를 포함하는 차 혼합 문화는 파킨슨 병에 특히 적합하다. 복부 피개 영역 (VTA) 도파민 뉴런은 보상과 중독에 연루되어있다. 복부 중뇌 (VM) 차 혼합 배아 문화 SNC와 VTA의 도파민 (DA) 신경 세포와 GABA 성 신경 세포 모두를 포함한다. VM 일차 배양 신경 분석에 유용 할 수 있고, 도파민 성 신경 세포의 선택적 취약점 해명. 형태에 따라 문화에서 도파민 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법은 없습니다. 그우리는 단일 셀, 고 수율 RNA 시퀀싱 라이브러리를 식별하고 하나의 도파민 신경 세포를 수확하고 구성하는 기술을 개발 재.
우리는 하나의 도파민과 중뇌 문화에서 고립 된 GABA 성 신경 세포에 대한 대표의 RNA 전 사체 데이터를보고합니다. 이 프로토콜은 DA / GABA 사체의 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위해 신경 보호, 신경 퇴화, 및 약리학 적 분석에 이용 될 수있다. 도파민 뉴런 VM 차 배양에서 발현 뉴런의 소수를 표현하기 때문에, 안정적으로 생활 문화 뉴런을 식별하는 능력은 단일 셀 연구 향상된 범위를 가능하게 할 것이다. 이 새로운 기술은 세포 수준에서 발생하는 메커니즘을 이해하는 발전을 촉진하고 다른 신경 및 분자 생물학 분야에서의 응용을 가질 수있다.
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Protocol
참고 : 모든 실험 관리 및 국민 건강의 연구소 및 프로토콜에서 제공하는 동물의 사용에 대한 지침에 따라 수행 하였다는 캘리포니아 공과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
배아 마우스 뇌에서 차 도파민 세포 배양 1. 유도
- 솔루션 및 문화 매체
- 아스 코르 산 원액의 제조
- 아스코르브 산 352 mg의 칭량. 20 ㎖의 최종 총 부피에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 용해합니다. -20 ° C에서 500 μL 씩 0.2 μm의 주사기 팁과 저장소를 통해 필터링합니다.
- 파파인 원액의 제조
- 15 단위 / 1 배 Hanks' 균형 소금 용액 ㎖ (HBSS)에 파파인을 희석. 최대 피펫 5 배 아래로 철저하게 혼합 할 수 있습니다. 해부의 날에 준비합니다.
- DNase의 원액의 제조
- DNase의 20 밀리그램을 달아. 20 ㎖의 총 최종 부피에 멸균 H 2 O를 추가합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 팁 살균 필터. 1 mL의 분취 량에서 -20 ° C에서 보관.
- 정지 용액의 조제
- 45 mL의 1 배 HBSS에 10 % 5 ㎖ 기증자 말 말 혈청을 희석. 0.2 μm의 주사기 필터 팁 살균 필터. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 4 % 소 혈청 알부민 (BSA) 원액의 제조
- BSA의 2g을 달아 45 mL의 총 최종 볼륨 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 필터는 0.2 ㎛의 주사기 필터 팁 살균. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 도금 매체의 제조
- 494 mL의 매체에, L- 알라 닐 -L- 글루타민 (L-글루타민 안정화 소스)와 도너 말 혈청 5 mL를 포함 1.25 ㎖의 배양 배지를 추가한다. 필터 0.2 μm의 주사기 FIL과 소독터 팁. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 세포 배양 배지의 제조
- 196 mL의 도금 매체로, 4 mL의 B27 200 μL의 아스 코르 빈산을 추가합니다. 필터 0.2 μm의 필터로 살균. 4 ° C에서 솔루션을 저장하고 주일 이내에 사용한다.
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액의 조제
주의 : 다음과 같이 파라 포름 알데히드를 사용하여 일반적인주의 사항은 다음과 같습니다, 증기의 흡입을 방지, 피부와 눈 접촉을 피하십시오, 흄 후드를 사용하여 열이나 화기에 가까이하지 말 것. 적절한 개인 보호 복을 착용 할 것. PFA 따라서 철저하게 취급 후에는 손을 씻고, 과민성 피부염의 원인이 될 수 있습니다.- 1X PBS, pH 7.4의 30 mL의 16 % PFA의 10 ML을 추가합니다.
- 0.1 % 트리톤 X-100의 제조
- 피펫 1 mL의 트리톤 X-100을 9 mL의 PBS 1X로는 10 % 용액을 제조한다. 피펫 천천히 점성 용액을 피펫 팁을 채울 수 있습니다. DIS 37 ° C를 물을 욕조에 따뜻한풀다. 4 ° C에서 10 %의 주식을 저장합니다.
- 이 직렬 1시 10분 희석을 행함으로써, 예를 들어 0.01 % (10 % 스톡을 희석하여 1 % 용액을 만들기 위해 9 ㎖의 1X PBS로 1 ㎖의 10 % 용액을 희석 9 ㎖의 1X PBS에 1 % 용액 1 ㎖ 있도록 0.1 % 용액).
- 10 %의 제조 1 % 당나귀 혈청
- 10 %의 솔루션을 1X PBS의 9 mL의 당나귀 혈청의 1 ML을 추가합니다. 1 %의 솔루션을 1X PBS, pH 7.4의 49.5 mL의 당나귀 혈청 0.5 mL를 넣고.
- 1X PBS의 준비
- O.는 pH 미터를 사용하여 pH를 7.4로 용액의 pH를 조정 H 2 450 ㎖ 중에 50 ㎖를 첨가하여 10 배 PBS 1 배 희석.
- 아스 코르 산 원액의 제조
- 문화 요리를 코팅
- 폴리 -L- 오르니 틴 코팅
- 멸균 기법을 사용하여 120 μL 폴리 -L- 오르니 틴과 모든 35mm 접시의 중앙 코트 만 10mm 직경의 유리 바닥. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어. 폴리 소호 흡인 진공 흡입기를 사용하여rnithine. 멸균 H 2 O로 두 번 요리를 씻어
- 라미닌 코팅 (1 mg을 재고 농도 / ㎖)
- 멸균 H 2 O (최종 농도는 0.01 ㎎ / ㎖) 2 ㎖의 20 μL 라미닌 희석.
- 0.01 mg의 희석 라미닌 120 μL 모든 접시의 중앙 코트 만 10mm 직경의 유리 바닥 / ㎖의 멸균 기술을 이용하여, 사용하기 전에 37 ℃에서 1 시간 또는 O / N 부화.
- 폴리 -L- 오르니 틴 코팅
- 마우스 해부
주 :이 문화 인큐베이터에 배아 주머니에서 전송로이 절개의 방법은, 세포의 최소한의 노출을 위해 설계되었습니다. 세포의 생존율은 중뇌 해부 뇌의 일부를 제거함으로써 유지된다. 필요없이 더 빨리 중뇌 진행 격리 지역에 액세스 할 수있는 전체 뇌를 해부한다. 본 연구에 사용 된 마우스 변형에 대한 재료의 표를 참조하십시오. - 70 % 에탄올로 안락사 마우스의 복부를 스프레이. 2 × 3 이빨 집게를 사용하여 낮은 복부의 피부를 잡고 무딘 칼날 수술 가위를 사용하여 복강을 엽니 다. 각면에 횡 방향 및 근위 이동이 컷을 확인합니다. 복강을 노출 포셉을 사용하여 복벽을 통해 접어.
참고 : 자궁 이제 노출된다. 흉막 캐비티 및 기흉의 생성을 노출하는 것은 동물이 회복되지 않는 것을 보장한다. - 자궁을 분리하기 위해 자궁의 양쪽 끝을 잘라. 멸균 후드에 페트리 접시에 놓습니다.
- 각 손에 스트레이트 팁 집게를 사용하여 배아 주머니를 열고 배아를 제거합니다. 빨리 집게로 목에서 머리를 곤란에 의해 목을 베다. 지느러미 표면이 액세스 할 수 있도록 단단히 주둥이에 배치 된 집게로 머리를 안정.
- 다른 헥타르에서 개최 된 집게를 사용하여차 바로 중뇌의 능선 전에 피부와 두개골의 층을 꼬집어. 피부와 중간 선을 따라 꼬리 쪽 두개골을 다시 껍질. 피질과 중뇌 및 소뇌를 통해 다른 사이에 하나의 팁 능선 주위에 집게를 놓습니다.
- 핀치와 꼬리 쪽의 주동이의 측면과 소뇌의 전뇌 뒤에 남겨두고, 전체 중뇌를 제거합니다. 해부 현미경 차가운 HBSS와 페트리 접시에 놓습니다.
- 잔여 배아에 대해이 절차를 반복합니다.
- 복부 측이 지금 이용할 수 있도록 해부 현미경 뇌 세그먼트 뒤집어. 지금 4 사분면 볼 수 있습니다. 부드럽게 수막을 잡고 위로 떨어져 뇌에서 당겨 수막과 혈관을 모두 제거합니다.
- 중뇌을 분리하는 동안 뇌 세그먼트를 안정시키기 위해 집게를 사용합니다. 약 세그먼트의 중심에 뇌실에 포셉 한 통을 놓습니다. 내가 포인팅, 첫 번째 핀치 등쪽 확인다음 내측 양쪽의 접시, NTO. 양쪽 측면 절개함으로써 낮은 두 사분면을 가져 가라.
참고 : 관심의 조직이 조밀 나타나는 복부 하부 섹션에 있습니다. 이 지역은 VTA와 SNC 모두 포함되어 있습니다. - 트림 덜 조밀 조직 삭제 :이이 우수하고 열등한 colliculi를 포함합니다. 페트리 접시의 별도의 영역에 신선한 HBSS의 VTA와 SNC 모두를 포함하는 해부 조직을 놓습니다.
참고 : 마우스 두뇌 발달이 단계 (E14)에서, 복부 중뇌에 대한 관심의 영역이 조나의 incerta 및 기타 시상 하부 셀 그룹에서 심실로 구분됩니다. 개발 배아 마우스 뇌의 더 긴 구조는 성인 마우스 뇌에 가깝게 위치한이 지역들 사이의 구별을 할 수 있습니다. - 나머지 모든 뇌 세그먼트에 대해 반복합니다.
- 모든 뇌 세그먼트를 해부 한 후, 분기 개에 집게와 11 호 메스를 사용거의 동일한 크기의 조각으로 채널 중뇌 부분.
- 세포의 효소 처리
- HBSS에있는 모든 등분 중뇌 부분을 차지하고 15 ML 원뿔 튜브로를 배치하는 넓은 구멍 P1000 피펫 팁을 사용합니다. 세그먼트는 튜브의 바닥에 정착하고 등분 조각으로 채택 된 HBSS를 제거 할 수 있습니다.
- 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브에 파파인 용액 500 μL를 추가하고 배치합니다. 7.5 분 후 튜브를 쓸어 넘겨 손가락으로 재현 탁 세포.
- 넓은 구멍 P1000 팁을 사용하여, 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase의) 용액 1 mL를 분취에 피펫 만 중뇌 부분. 세그먼트는 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- 넓은 구멍 P1000 팁을 사용하여, 린스 냉간 정류장 용액 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 만 중뇌 세그먼트를 전송. 세그먼트는 튜브의 바닥에 정착하자에 린스를 반복더 많은 가전.
- 세포 현탁액의 기계적 분쇄
- 신선한 스톱 솔루션과 피펫 최대 1 mL로 마지막 헹굼을 교체하고 아래로 7 배 세포를 씹다하는 P1000 피펫 팁. 세포 용해를 최소화하기 위해 과도한 분쇄하지 마십시오.
- 천천히 튜브 바닥으로 4 % BSA 용액 200 μL 피펫 팅하여 세포 현탁액을 언더. 조심스럽게 세포 현탁액 층을 방해하지 않도록하기 위해 피펫 팁을 철회. 6 분 280 XG에 원심 분리 후, P1000과 뜨는을 대기음 매체 도금의 1 mL에 세포를 재현 탁.
- 혈구를 사용하여 세포 수를 수행합니다. 평판 배지에, 1000 세포 / μL로 세포 현탁액을 희석.
- 진공 흡입기를 사용하여, 많아야 세 요리 일괄 적으로, 코팅 된 접시에서 라미닌 대기음. 플레이트 120 μL (1.2 × 10 5 세포 / 접시 (78.5 mm (2)
- 1 시간 후, 세포를 조심스럽게 중단을 최소화하기 위해 배양 접시의 시드 화 영역 배양액 3 ㎖를 추가한다.
- 3 주 동안 3 일 간격으로 세포 배양 접시에 전체 매체 변화에 반을 수행합니다.
RNA 시퀀싱 2. 수확 교양 - 도파민 뉴런
참고 : 세포 수확 및 단일 세포 RNA-시퀀싱 프로토콜의 개요는 그림 1에 제시되어있다.
- 단계 실험의 날 전에 수행하는
- 15 분 동안 2 O 증류 H에서 다시 15 분 동안 100 % 에탄올로 초음파 처리에 의해 면도 붕규산 유리 모세관 튜브. 튜브 드레인의 RNase 불 활성화하기 위해 200 ℃의 오븐에서 하룻밤 동안 굽는다.
- 갓 열 사용의 RNase가없는 피펫 팁 미세 원심 분리 튜브에의 RNase 억제제 용액을 1 μL (20 μL 총 부피)로 시퀀싱 키트에서 배 용해 완충액 19 μL를 혼합하여 10 배 반응 완충액의 스톡 용액을 제조 하였다. 간단히 마이크로 원심 분리기를 이용하여 혼합물을 스핀과 얼음에 보관하십시오.
- (수확 뉴런을 수집하는 데 사용되는) 각 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브의 각각에 10 배 반응 완충액 2 μL를 추가한다. 신경 세포를 식별하는 적절한 태그가 수확 및 저장은 4 ℃에서 동결하기로 튜브 라벨.
- 단계 실험의 날에 수행하는
- 수확 피펫의 제작.
- 미세 전극 풀러와 microforge의 유리 코팅 가열 필라멘트를 사용하여 구운 모세관 튜브에서 - (8 μm의 2) 큰 팁 직경 가능한 Micropipette를 당깁니다. 긴 테이퍼 가능한 Micropipette를 형성하기 위해 풀러를 설정합니다. 보정 계수와 접안 고전력 OB 구비 한 microforge를 사용(- 20 μm의 10) 원하는 팁 크기로 마이크로 피펫의 팁을 깰 주관적인.
- microforge의 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 고정하고 microforge에 홀더를 탑재합니다. 이를 가열 필라멘트 전류에 microforge 및 스위치의 기계적 조작기를 이용하여 유리 피복 가열 필라멘트 상기 초점 마이크로 피펫의 선단을 가지고. 가열 된 필라멘트에 피펫 팁을 터치합니다. 피펫 팁은 적절한 직경에 녹아 때 전류를 끕니다.
노트. 전류를 차단하면 필라멘트가 아래로 갑자기 이동하고 원하는 직경이 큰 오픈 팁 피펫을 생산, 피펫 팁에서 분리하게됩니다. - 필요할 때까지 밀폐 된 상자에 완료 가능한 Micropipette를 저장합니다.
- 뉴런을 수확.
노트. 배양 된 신경 세포는 이전에 게시 된 프로토콜 (6)의 수정 된 버전 다음 수확했다.- 철저하게 카스티물 린스 액체 살균제와 물을 사용하여 배양 접시 및 수집 튜브와 접촉 세포 수확 방 모든 표면 EAN. 80 % 에탄올로 소독 표면을 닦은 다음의 RNase-억제제 주입이 닦습니다.
- 얼음이 절연 컨테이너, 일반 (물) 얼음 하나는 드라이 아이스와 다른를 입력합니다. 일반 얼음에 10 배 반응 완충액 2 μL와 이전에 채워진 0.2 ㎖의 PCR 수집 튜브를 놓습니다.
- 의 RNase없는 둘 베코의 PBS (DPBS)의 2 mL로 씻어 수확 DPBS의 1 mL로 교체 접시에서 배양 배지 드레인, 인큐베이터에서 신경 세포를 포함하는 배양 접시를 제거합니다.
- 40 배 상 목적하는 수은 램프 및 GFP 필터 세트를 갖추고 반전, 표면 형광 현미경을 사용하여 기본 중뇌 문화 형광, TH 양성 신경 세포를 식별합니다.
- 전동 또는 수동 마일을 사용하여 셀 소마를 통해 피펫의 위치를cromanipulator. 마이크로 피펫 홀더 측 포트에 부착 된 플라스틱 배관을 통해 입으로인가 부드러운 흡입을 이용하여 유리 마이크로 피펫에 신경을 대기음. 즉시 목욕 솔루션에서 셀을 포함하는 마이크로 피펫을 제거합니다.
- 0.2 mL의 PCR 튜브 컬렉션을 포함하는 반응 버퍼 내부의 피펫 팁을 배치하고 하단에 튜브의 측면에 대한 팁을 휴식. 마이크로 피펫의 뒤쪽에 멸균 21 G 주사기 바늘을두고 바깥쪽으로 압력을가함으로써, 마이크로 피펫의 선단에서 깨진 - (1.5 μL, 0.5), 나머지 액체를 배출.
- 데스크탑 마이크로 원심 분리기를 사용하여 5 초 동안 포집 관을 원심 분리하여 드라이 아이스에서 동결. -80 ℃에서 하나의 세포를 포함하는 수집 튜브를 저장한다. 전형적으로, 105 세포는 실온에서 1 시간 동안 접시 당 수확.
- 수확 피펫의 제작.
3. 단일 셀 RNA-SEQ 라이브러리 제작
- <첫 번째 가닥의 cDNA 리> 세대
- PCR을 캐비닛에 얼음 아래 시약을 가져와. (2 μL 배 첫번째 가닥 완충액, 0.25 μL DTT (100 mM)을 1 μL의의 dNTP 믹스 (10 mM)을 1 μL의 올리고 뉴클레오티드 PCR의 캐비닛에 상온에서 다음의 시약을 조합하여 첫번째 가닥 마스터 믹스를 더한 10 %를 준비 12 μM), 0.25 μL의 RNase 억제제, 1 μL는 효소 (100 단위) 역. 이는 역전사 마스터 믹스 (반응 당 5.5 μL 총 부피)이다.
- 드라이 아이스에 -80 C에서 샘플을 채취하여 PCR 캐비닛에 가져다. 상기 하나의 세포 샘플에 다음을 추가 : 1 μL 1, 1 μL가 RNA 스파이크를 정량화 3 '프라이머. 72 ° C에서 핫 뚜껑 열 순환기 사전에 냉각 블록에 샘플을 가져와.
- 72 ° C에서 3 분 동안 열 순환기의 튜브를 품어 한 후 PCR 쿨러 선반에 샘플을 넣어.각 반응 관 (단계 3.1.1에서) 마스터 믹스의 5.5 μL를 추가하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다. 5 초 동안 0.2 μL 튜브 스핀 다음과 같이 열 순환기에서 배양한다 : 42 ° C를 90 분, 10 분, 70 ° C에 대한. 4 ° C에서 잡으십시오.
- 증폭 된 제 1 가닥의 cDNA의 정제.
주 : PCR 증폭 cDNA를 자성 비드에 고정화하여 정제한다. 0.2 ㎖의 튜브에 대한 자기 분리 장치를 사용합니다.- 1.5 ㎖의 튜브에 자석 구슬을 나누어지는. 각 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 실온 비드 분취를 가져오고 분산 잘 섞는다. 소용돌이 자석 구슬이 균일하게 혼합 될 때까지.
- 각 샘플에 자석 구슬 25 μL를 추가합니다. 철저하게 혼합 아래로 적어도 10 배 전체 볼륨 업을 피펫 팅에 의해 섞는다. 8 분은 구슬로 cDNA를 바인드를 수 있도록 RT에서 품어.
- PCR 마스터 믹스의 제조
- 되어온 모든 반응에 대한 DS-cDNA를 증폭 PCR 마스터 믹스를 준비합니다하는 ional 10 % 5 μL 10 배 PCR 버퍼, 2 μL의의 dNTP 믹스 (10 mM)을 2 μL PCR 프라이머 2 (12 μM), 2 μL 50 배 (2) 중합 효소 믹스, 39 μL 클레아 무료 물을 혼합하여 (50 μL 총 볼륨 / 반응).
- 첫 번째 가닥의 증폭
- 액체가 완전히 분명 나타날 때까지 자기 분리 장치 ≥5 분에 샘플 및 자기 구슬을 배치하고 상층 액에 남아있는 구슬이 없습니다.
- 분리 장치의 샘플을 유지, 상층 액을 피펫 버린다. 튜브 측으로부터 액체를 수집하기 위해 5 초 동안 샘플을 스핀. 다음, 30 초 동안 자기 분리 장치의 샘플을 놓습니다 P10의 피펫에 남아있는 모든 상층 액을 제거합니다.
- 이전 단계의 구슬에 바인딩 각 튜브 포함하는 DNA로 PCR 마스터 믹스 50 μL를 추가합니다. 온수 뚜껑 예열 된 열 자전거 타는 사람 (95 ° C)에서 튜브를 놓습니다. 다음 프로그래밍을 사용하여 열 순환을 시작할m : 1 분 95 ° C, 15 초 동안 95 ° C의 26주기, 30 초 동안 65 ° C, 6 분 동안 68 ° C. 그런 다음 72 ° C 10 분. 4 ° C에서 잡으십시오.
참고 : 자세한 내용은 순서는 사용자 설명서를 참조하고 샘플 설정을 최적화 할 수 있습니다.
- 증폭 된 이중 가닥의 cDNA의 정제
- 각 샘플에 구슬 90 μL를 추가합니다. 철저하게 혼합 아래로 적어도 10 배 전체 볼륨 업을 피펫 팅에 의해 섞는다. 8 분은 구슬로 cDNA를 바인드를 수 있도록 RT에서 품어. 액체를 완전히 맑은 나타날 때까지 ≥5 분 동안 자기 분리 장치의 샘플 플러스 비즈를 배치하고, 상청액에 남아있는 비드는 없다.
- 시료는 자기 분리 장치이지만, 상층 액을 제거하고 폐기. 자기 분리 장치의 샘플들을 유지. 구슬을 방해하지 않고 각각의 샘플에 갓 85 % 에탄올 140 μL를 추가합니다. 30 초 동안 기다립니다. 상층 액을 피펫. 의 cDNA는 BEA에 결합 유지됩니다세척 공정 동안에 DS.
- 한 번 더 에탄올 세척을 반복합니다.
- 간단히 튜브 측으로부터 액체를 수집하기 위해 샘플을 스핀. 다음, 30 초 동안 자기 분리 장치의 샘플을 놓고 피펫에 남아있는 모든 에탄올을 제거합니다. 펠릿은 건조하고 더 이상 반짝 때까지 (균열이 나타납니다 즉 전) 2.5 분 - 2 상온에서 샘플을 놓습니다.
참고 : 그냥 건조까지만 펠렛을 건조. 펠렛이없는 광택과 매트를 볼 것이다. 펠렛이 건조되지 않으면, 에탄올 증폭 된 cDNA의 회수 속도 및 수율을 줄일 수있는 샘플 웰에 남아있을 것이다. 펠렛 위에 건조 경우, 펠렛에 균열이있을 것이다. 그것은 재수하는 이상 2 분 소요되며 증폭 된 cDNA를 복구 및 수율을 감소시킬 수있다. - 구슬이 건조되면, 비드 펠렛을 다루 용출 버퍼의 22.5 μL를 추가합니다. 자기 분리 장치로부터 시료를 제거하고, 비드를 재현 탁 철저히 혼합한다. 에서10 분 동안 실온에서 cubate는 재수합니다.
- 튜브 측으로부터 액체를 수집하기 위해 5 초 동안 샘플을 스핀. 이 솔루션은 완전히 깨끗해질 때까지, ≥1 분 동안 다시 자기 분리 장치의 샘플을 놓습니다.
참고 : 구슬의 작은 인구는 배양 중에 자석에 펠렛하지 않을 수 있습니다. 뜨는 그들을 재현 탁하고 (기존의 펠렛을 방해하지 않고) 구슬의 나머지 부분은 이미 펠렛 화 한 자석으로 그들을 피펫 위아래 이러한 unpelleted 구슬을 피펫. - 더 비즈가 뜨는에 남아 있지 않을 때까지 배양을 계속합니다. 클레아없는, 저 밀착성 튜브에 각 튜브의 정제 된 cDNA를 포함하는 명확한 뜨는을 전송합니다. -20 ° C에서 샘플 정보 저장과 각 튜브 라벨. 시료는 -20 ° C 무기한으로 저장 될 수있다.
- DNA 농도 및 단편 크기 측정
- 1 μL 등을 정량화하여 품질 관리 검사를 실시형광 분석기의 cDNA를 iquot. AS (1에서 설명 된) 전기 영동 시스템을 사용하여 DS-cDNA를 1 μL (3 NG)를 평가한다.
- DNA의 단편화
주 : DNA 샘플 준비 키트를 사용합니다.- 튜브로 cDNA를 20 μL (35 NG 합계)를 추가합니다. Tagment DNA 25 μL (TD)는 cDNA를 함유 튜브에 버퍼에 추가.
- 튜브에 TDE1 (Tagment DNA 효소)의 5 μL를 추가합니다. 최대 피펫과 10 배 아래로 혼합. 각 샘플에 대한 새로운 팁을 사용합니다. 1 분 동안 20 ° C에서 280 XG에 원심 분리기.
- 온수 뚜껑 열 순환기에 샘플을 놓고 그것을 실행 : 55 ° C, 5.5 분. 빨리 50 μL QG 용액 (겔 추출 키트)를 추가합니다. 최대 피펫과 10 배 아래로 혼합. 다음 단계로 직접 진행합니다.
- 조각난 DNA의 정제
- 구슬, 피펫 최대의 170 μL를 추가하고 아래로 10 배는 혼합 할 수 있습니다. 이 10 분 동안 앉아 할 수 있습니다. 자석에 튜브를 넣어. 튜브는 10 분 동안 자석에 앉아 보자.샘플이 자기 분리 장치에있는 동안, 상층 액을 피펫 버린다.
- 자석에 튜브를두고 85 % 에탄올 200 μL를 추가합니다. 에탄올을 제거, 30 초 동안 앉아 보자. 에탄올 세척을 반복합니다. 실온에서 튜브 1,000 XG에 스핀.
- 다시 자석에 튜브를 넣어. 잔류 에탄올을 피펫. 샘플은 15 분 동안 실온에서 건조하자.
- 겔 추출 키트에서 용출 버퍼의 21 μL를 추가합니다. 튜브 자석, 피펫을 위로 떨어져 앉아 보자 10 배 아래로 혼합. 튜브를 실온에서 15 분 동안 앉아 보자.
- 5 분 동안 자석에 튜브를 돌려줍니다. 새로운 튜브에 용액 (정제 DNA)의 피펫 20 μL.
- 조각난 DNA의 태그 및 PCR 증폭
참고 :이 단계에서 정제 된 DNA가 제한된주기 PCR 프로그램을 통해 증폭된다. PCR 반응 단계는 인덱스 1 (I7) 및 인덱스 2 (I5)뿐만 아니라 공통 어댑터 (클러스터 생성 및 시퀀싱 필요) (P5 및 P7)를 추가한다. DNA의의를 참조하십시오자세한 내용은 충분한 준비 가이드.- 새로운 튜브에서 인덱스 2 프라이머의 5 μL (흰색 모자)를 추가합니다. 새로운 피펫 팁을 사용하면 인덱스 1 프라이머 (오렌지 캡)의 5 μL를 추가합니다. 각 튜브에 PCR 마스터 믹스 15 μL를 추가합니다.
- 각 튜브에 PCR 프라이머 칵테일의 5 μl를 추가합니다. 튜브에 정제 된 DNA의 20 μL를 추가합니다. 5 회 - 부드럽게 아래로 삼을 피펫합니다.
- 열 순환기에 다음과 같은 프로그램을 사용하여 PCR을 수행 : 72 ° C를 3 분 동안, 98 ° C를 30 초, 10 초, 30 초 동안 63 ° C, 3 분 72 ° C 98 ° C의 5 사이클. 10 ° C에서 잡으십시오. PCR을 청소 즉시 진행 또는 최대 2 일 동안 4 ° C에서 샘플을 저장합니다.
- 증폭 된 DNA 조각의 정화
- RT에 구슬을 가져옵니다. 신선한 85 % 에탄올을 준비합니다. PCR 기계에서 샘플을 가지고 잠시 스핀 다운.
- 튜브에 구슬 30 μL를 추가합니다. 조심스럽게 피펫은 위아래로 10 배 혼합한다. 튜브를 5 분 동안 실온에서 앉아 보자. 장소 혈중 알코올 농도5 분 동안 상기 자석의 케이. 자석에 튜브로 뜨는을 폐기 피펫을 사용합니다.
- 각 튜브에 85 % 에탄올 200 μL를 추가합니다. 피펫은 30 초 후에 꺼 에탄올. 85 % 에탄올 세척을 반복합니다. 피펫은 30 초 후에 꺼 에탄올.
- 자석에 여전히 튜브와 뚜껑을 열어 둔 상태에서 15 분 동안 공기 건조에 구슬을 할 수 있습니다. 자석에서 튜브를 제거합니다.
- 용출 버퍼의 32.5 μL를 추가합니다. 부드럽게 피펫과 10 배 아래로. 15 분 - 10 자석을 품어.
- 2 분 동안 자석 튜브를 돌아가거나 상등액 클리어 할 때까지. 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는의 30 μL를 전송합니다.
- DNA 농도 및 조각 크기의 측정
- 형광 분석기의 cDNA를 1 μL의 DNA 농도를 정량화하여 품질 관리 검사를 실시한다. 전기 영동에 의해 DNA의 단편의 크기를 결정합니다. DS-의 cDNA 1 μL (3 NG)를 평가합니다.
- 시퀀싱
- 시퀀싱 시설에 단일 세포 RNA-서열 라이브러리를 가져옵니다. 100 bp의 염기 서열은 이전에 게시 된 프로토콜 4 다음 시퀀서에 읽 생성합니다.
참고 : 각 시퀀싱 라이브러리는 매핑 읽기 고유> 20000000를 생성한다.
- 시퀀싱 시설에 단일 세포 RNA-서열 라이브러리를 가져옵니다. 100 bp의 염기 서열은 이전에 게시 된 프로토콜 4 다음 시퀀서에 읽 생성합니다.
주 : 다음 단계는 상업 시퀀싱 키트에서 시약을 사용하십시오.
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Representative Results
여기에서 우리는, 티로신 수산화 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-SEQ (그림 1)를 사용하여 자신의 RNA 전 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다. 데이터 수확 서열화 된 TH-eGFP는 양성 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체의 존재 TH, DOPA 데카 복실 라제 (DDC) 및 도파민 전달체 DAT에 기초하여, 도파민 뉴런 것으로 나타났다 (slc6a3). RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 각각의 단일 셀 RNA-서열 라이브러리에서 6,000 - 8,000 단백질 코딩 유전자 (그림 2) 검출되었다. 도파민 신경 세포는 견고 여러 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChR을) 서브 유닛 (표 1)에 추가하여 도파민 관련 증명서를 표현한다. 우리는 어떤 것을 관찰되지t TH했다 GABA 성을 위해 음성 인 세포의 모든; RNA-서열에 의해 평가로 그러므로 우리는 Gad1 사본의 존재 여부에 따라 GABA 성으로 세포를 정의했다. 우리는 도파민 관련 증명서를 표현하지 않는 GABA 성 신경 세포로 정의하지만, GABA 합성, Gad1의 주요 유전자를 발현 할 언급 한 바와 같이 세포. 단일 셀 라이브러리는 또한 채널, 수용체, 핵 단백질 히스톤, organellar 단백질 및 전사 인자를 코딩하는 긴 비 코딩 RNA뿐만 아니라, 성적 증명서를 한 것으로 밝혀졌습니다.
차 TH-eGFP는 마우스 중간 뇌의 문화에 우리의 실험에서 수행으로, 개별 뉴런 1. RNA-SEQ 그림. 삼주 (1) 문화 TH-eGFP는 마우스 복부 신경. (2) 수은 광원 및 FITC / GFP 필터를 사용하여 흥미로운 GFP에 의해 형광 하나의 뉴런을 식별합니다. (3) 무선위상 광학에서 같은 40X 목표를 토륨 하나의 뉴런을 시각화하고 정확하게 피펫을 배치합니다. (4 - 5), 유리 마이크로 피펫으로 대기음 단 전지. 이미지는 수확 후 셀을 보여줍니다 (4) 단계 40X; (5) eGFP는 형광. 72 ° C에서 올리고 DT 프라이머와 용해 버퍼 (6)를 Lyse 세포. (7) cDNA 합성; 26주기 증폭. cDNA를 (8) 트랜스포존 매개 "tagmentation". (9) cDNA의 품질 관리 검사 다중화 순서. Tophat, 커프스 링크와 Cuffdiff 7을 사용 (10) 이후 전산 분석. 유전자 발현의 상대적인 농축 매핑 백만 사체 킬로 당 프래그먼트 단위로 측정되었다 (FPKM) 판독한다. RNA-SEQ의 목적은 셀의 상대 풍부하게 발현 된 유전자의리스트를 제공하는 것이다. 이미지 (2 - 4) 현재 법과 출신K, (6-10)는 이전 보고서 1에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. TH-eGFP는 양성 세포에서 생성 된 단일 도파민 RNA-서열 도서관에서 감지 단백질 코딩 유전자의 수입니다. 6000 - 8000 단백질 유전자는 단일 셀 라이브러리에서 발견되었다. FPKM는 : 매핑 백만 성적 증명서의 킬로 당 조각은 (FPKM) 읽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | DA 단일 세포 N = 10 | GABA 성 단일 세포 N = 7 |
| FPKM (± SEM을 의미) | ||
| TH | 4714 ± 764 | 1.2 ± 0.14 |
| DDC | 779 ± 167 | 0.8 ± 0.1 |
| slc6a3 / DAT | 506 ± 144 | 0.5 ± 0.04 |
| DRD2 | 14 ± 8 | 0.1 ± 0.004 |
| chrna6 (α6) | 174 ± 57 | 0.0 |
| chrna4 (α4) | 17 ± 5 | 26.4 ± 2.3 |
| chrnb2 (β2) | 9 ± 3 | 17.3 ± 1.2 |
| chrnb3 (β3) | 38 ± 13 | 0.0 |
| Gad1 | 0.0 | 959.0 ± 70.0 |
| Htr3a | 0.0 | 0.6 ± 0.01 |
| Htr3b | 0.0 | 0.0 |
표 1. 도파민 관련 VentrMidbrain 문화의 날 21과 도파민과 GABA 성 뉴런에 nAChR을 유전자 성적 증명서. TH-eGFP는 긍정적이고 부정적인 뉴런에 대한 RNA-서열 데이터가 표시됩니다. 단일 세포 배양 날에 수확 (21) RNA-서열 데이터는 TH-eGFP는 긍정적 인 뉴런 티로신 수산화 (TH), 도파 탈 탄산 효소 (DDC), 도파민 수송 DAT (slc6a3)를 포함 DA-관련 유전자 전 사체의 높은 수준을 한 것으로 보여 , α6, α4, β2 및 β3 포함하고 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChR을) 소단위. 그러나, 이들 세포의 GABA 성 마커 유전자 글루탐산 디카 르 복실 라 아제 1 (Gad1) 및 세로토닌 5-HT3 수용체 A와 B 소단위 (Htr3A 및 Htr3B)의 낮은 수준이었다. GABA 성 신경 세포가없는 수준으로 낮은있다DA-관련 유전자 성적 증명서, chrna6, chrnb3 및 Htr3A / B 만의 Gad1의 높은 수준을 가지고있다. RNA-SEQ (Cuffdiff) 데이터는 도파민 관련, GABA 성, 니코틴 수용체와 세로토닌 성적 증명서에 대해 표시됩니다. FPKM는 : 매핑 백만 성적 증명서의 킬로 당 조각은 (FPKM) 읽습니다.
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Discussion
여기에서 우리는 단일 셀 RNA-서열과 각 셀을 연구, 형광 태그를 사용하여 이기종 인구에서 단일 세포를 분리. 우리는 수확 서열 라이브 TH-eGFP는 세포 100 % 다음 세 DA 관련된 유전자 전 사체, TH, DDC 및 slc6a3의 존재에 기초하여, 실제로 도파민 뉴런 있다고보고한다. RNA-서열에 의해 평가로 TH-eGFP는 양성 세포는 모두이 세 가지 유전자를 표명했다. 이는 각각의 TH-eGFP는 세포는 도파민 뉴런 (8, 9)와 연관된 이온 채널의 레퍼토리를 표시되었습니다 전기 생리학 연구와 일치율이었다. 이 프로토콜에서 우리는 라이브 도파민 신경 세포에 대한 신뢰할 수있는 표식으로 GENSAT 티로신 수산화-eGFP는 마우스 스트레인 (10)를 이용했다. WT 문화에서 현재 자신의 형태를 기반으로 라이브 도파민 신경 세포를 식별 할 신뢰할 수있는 방법이 없습니다. 아이덴에서 우리의 풍부한 경험에도 불구하고tifying 만 세 수확 의심되는 도파민 세포의 10 밖으로 야생형의 문화에서, 도파민 뉴런에서 기록 도파민 뉴런했다. 또한, 우리는 모든 TH에 대한 음성 인 세포가 GABA 성이었다 관찰. RNA-서열에 의해 평가로 우리는 Gad1 사본의 존재와 DA-관련 성적 증명서의 부재에 따라 GABA 성으로 세포를 정의했다.
도파민 뉴런 VM 차 배양에서 발현 뉴런의 소수를 표현하기 때문에, 안정적으로 생활 문화에서 뉴런을 식별 할 수있는 능력은 가능한 단일 셀 연구의 범위를 향상시킬 것이다. 이 프로토콜은 도파민 사체 다양한 치료법의 효과를 연구하기 위해 신경 보호, 신경 퇴화, 및 약리학 적 분석에 이용 될 수있다. 또한, 하나의 면역 조직 화학, 전기 생리 학적, 바이오 포토 닉 11이 프로토콜을 사용할 수 있고, 원칙적으로, 프로테옴 분석. 그만큼자체 분석은 파킨슨 병 및 중독 연구에 특히 유용하다. 그러나 물론 GENSAT 마우스 또는 유사하게 표시 마우스에 유사한 프로토콜은 다른 질병 상태 또는 희귀 세포에 사용될 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 주어진 신경 하위 유형 내에서 이질성의 새로운보기를 제공합니다.
이전의 연구에서 단일 세포를 수확 후 우리는 PBS에 직접 배치; 그러나 지금 우리는 반응 버퍼에 직접 수확 한 단일 세포를 놓습니다. 각 도서관에서 검출 된 유전자의 숫자에 의해 평가 이것은 더 나은 품질의 RNA-서열 라이브러리가 발생합니다. 이 기술의 주요 제한 사항 중 하나는 그 형광 태그 셀이 필요된다. 전술 한 바와 같이, 형태에 기초하여 혼합 배양에서 특정 세포 유형을 식별 할 진정한 신뢰할 수있는 방법이 없다. 셀 고유의 형광 또는 마우스 선 Cre 호텔은 발현의 큰 범위가 이제 적절하게 많은 경우에 세포를 표시된 제공한다. 그러나, 의료 소적합한 형광 마우스 라인을 선택할 때 유전자 변형 마우스 라인의 광범위한 연구 TH-Cre 호텔은 노크에 마우스 선 것은 nondopaminergic 셀 (12)에 형질 전환 유전자 발현 발음을 나타낼 것을 발견 ULD는 촬영.
또한, 미래의 실험에서 최적화 될 필요가있다 또 다른 단계는 마이크로 피펫 팁의 원하는 크기이다. 미래 실험 도파민 신경 세포 이외의 세포 유형의 사용을 포함하는 경우, 마이크로 피펫 팁 크기 관심 셀에 대해 최적화 될 필요가있다.
RNA 서열이 마이크로 어레이 깊이보다 더 강력한 기술이다. RNA-SEQ 좋은 실행 - 투 - 실행 재현성을 제공합니다. 검출 된 동적 범위는 셀 내의 실제 사체 존재비에 필적한다. 하나는 다른 스플 라이스 양식과 새로운 동종를 검색 할 수 있습니다. 기준 유전자가없는 샘플의 드 노보 분석이 가능하다; 새로운 참조 유전자가 발견되는 경우, 데이터는 재 해석 될 수있다다시 13 습식 작업 실험을 실행하지 않고 특정 유전자 (들).
요약하면, 우리는 수확 서열 된 라이브 TH-eGFP는 세포의 100 % 도파민 신경 세포라고보고한다. 이 기술은 급성 기술은 신경 과학 및 분자 생물학에서 광범위하게 응용이있을 것이다 14, 15 및 GENSAT 마우스에서 해리 또는 장기 배양 도파민 신경 세포를 식별 다른 보고서를 확장합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stock solution, 1x final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20 °C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C Water bath | |||
| 37 °C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50x 2 polymerase mix | 50x Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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