Abstract
免疫応答の刺激は、有効性と免疫のメカニズムを検討する無脊椎動物研究における一般的なツールです。粒子は免疫系によって検出され、免疫エフェクターの産生を誘導するように、この刺激は、昆虫への非病原性粒子の注射に基づいています。私たちは、蚊ハマダラカにおけるメラニンの応答の刺激にここに焦点を当てます。メラニンの応答は、メラニンの暗い層で異物や寄生虫のカプセル化につながります。この応答を刺激するために、蚊は、微小ガラス管を用いて胸腔内のビーズを用いて接種します。そして、24時間後に、蚊がビーズを取得するために解剖されています。ビーズのメラニンの程度は画像分析ソフトウエアを用いて測定されます。ビーズは、病原性寄生虫の効果、または免疫応答を回避または抑制するための能力を持っていません。これらの注射は、measuする方法です免疫有効性及びそのような繁殖力や長寿などの他の生活史形質、上の免疫刺激の影響再。これは、直接宿主 - 寄生虫相互作用を研究するとまったく同じではありませんが、免疫力とその進化生態学を研究するための興味深いツールです。
Introduction
そのキューティクルまたはそれらの中腸上皮4を通して破る3 -昆虫は寄生虫や病原体1から身を守るために免疫応答に依存しています。蚊では、これらの応答は、細菌5、ウイルス6、フィラリア線虫7、およびマラリア原虫1,8,9に対して効率的です。 12 -蚊では、キー免疫応答は、メラニン10で異物をカプセル化したものです。 12 -このカプセル化は、中腸内または血リンパ循環システム10に発生する可能性があります。このメラニン応答は、プロフェノールオキシダーゼカスケード10の結果である- 12、そしてそれは寄生虫の死に、またはそれらの食作用につながることができます。血球細胞の数は限られている大人の蚊では、メラニンは、マラリア原虫の寄生虫やフィラリア線虫7に対してのように、体液性応答です。いくつかの他の昆虫では、それは直接7メラニン化するために寄生虫の周りに集まる血球細胞です。また、メラニンは7治癒産卵とキューティクルの傷のようないくつかの他の生理学的プロセスのためにも不可欠です。
18 -免疫応答の刺激は、いくつかの農業および公衆衛生モデル系13の昆虫耐性を研究するためのツールとして使用されます。 16,19 -宿主-寄生虫相互作用14を研究するハマダラカ蚊、アフリカにおけるマラリアの主要なベクトルで使用されています。これらの技術は、それらのパターン認識受容体（PRR）2で寄生虫を検出するために、昆虫の能力に基づいています。蚊はまた、病原体関連分子パターン（PAMP）のようなそれらの生物学的に干渉する他の分子を検出する、またはコラーゲンおよび核酸の放出に起因する独自の損傷した細胞を検出することができます。蚊免疫細胞23 -このような血球などの検出20のために使用されています。主な免疫シグナル伝達経路は、IMD、トール、JAK / STAT 24、およびリボ核酸干渉（RNAi）25,26です。トールおよびIMD経路の両方は、メラニンの応答に影響を及ぼし、プロフェノールオキシダーゼカスケード10との対話- 12。
メラニンの応答を刺激するために使用される標準的なツールは、胸腔の血リンパ中に小さなビーズと蚊の接種です。メラニンのカプセル化の程度は、その後、蚊の切開を介してビーズを回収した後、19を測定することができます。ほとんどの研究では、唯一のビーズは蚊15,16,27毎に注入したが、より多くのビーズを注入すると、メラニン応答19の限界を研究するために可能です。これらのビーズは、蚊の生理機能の妨害を制限するために、注射液（生理血清）を使用して注入され、蚊15,16,27の乾燥。色素は、ビーズの選択を容易にするためにこの溶液に添加します。これは、ビーズ15,16,27を取得するために使用される解剖ソリューションについても同様です。
非病原性の刺激で虫を接種することの利点は、免疫応答に直接影響に焦点を当てることができることです。 31、または免疫回避31 - - 34による寄生病原28、免疫抑制29への複雑な効果はありません。また、このような寿命や産卵数などの他の生活史形質、上の刺激の結果は、また、研究することができます。したがって、進化生態学を研究する研究者は、このようなツール2,35,36が必要な場合があります。例えば、免疫挑戦マルハナバチは、飢餓の下に短縮寿命を持っています。免疫刺激と展開の同様の負の効果は、多くの場合、短いで、その結果、別の無脊椎動物のモデルで観察されていますえー寿命以下繁殖成功13,27,37。このような研究は、環境に2,4,38を変えて実施することができます。免疫力を刺激することも免疫病理39,40に直接焦点を当てたものに興味があります。
このプロトコルは、メラニン応答を刺激し、直接メラニンの量を測定するために蚊を有するビーズの接種に基づいています。これは、異なる実験設定でメラニン応答の定量的および定性的な研究を可能にします。このようなツールは、加熱死菌41に抗菌性応答などの他の免疫応答の刺激に拡張することができます。また、多くの生態系の設定で行うことができます。
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Protocol
注射や解剖1.生理食塩水
- pH値= 6.8で1.3のNaCl、0.5mMのKClと0.2 mMのCaCl 2をを得るために、蒸留水に塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを添加することにより、生理食塩水を準備します。
- 透明ビーズを着色するために生理食塩水の99ミリリットルに0.1％メチルグリーン溶液1mlを追加します。これは、0.001％メチルグリーン」注射液」です。
- その後、生理食塩水45mlの0.1％メチルグリーン溶液5mlを追加します。この0.01％メチルグリーン」解剖溶液」切開中のビーズの着色とその観察を容易にするために、メチルグリーンで10倍に濃縮します。
注：必要に応じてバッファを殺菌フィルター。
2.キャピラリーの準備
- 熱プルマイクロキャピラリーガラス管最小のビーズ（φ= 40μm）の42よりもわずかに大きい非常に微細な先端を得ることができます。
- オープンとAピンセットでチップを破壊したり、先端をオフにソーイングすることにより、各キャピラリをdjust。
3.蚊飼育
- 26±1℃でリアのA.ハマダラカ 、70±5％の相対湿度、12：12時間の明：暗サイクル。成人女性を維持し、それらを10％糖液へのアクセスを与えます。
キャピラリー4.ビーズ選択
- 5センチメートルペトリ皿に負に帯電したビーズ（直径40〜120ミクロン）の0.009グラムを注ぎ、事前に注射液の30分の5ミリリットルを追加します。
注：目標は、注射のためのビーズ選択を容易にするために、染料の色にビーズをできるようにすることです。彼らは無菌ジャーに来ていない場合は、ビーズをオートクレーブ。 - キャピラリーピペット電球に搭載されたキャピラリーを用いて、視覚的に双眼顕微鏡下での生理食塩水0.1μlの最小のビーズを選択します。
注：同時に複数のビーズを接種すると、0.1マイクロリットルの総容積から3ビーズを選択します。
5.モスキート処理および接種
- 昆虫吸引器を使用して、50ミリリットルチューブに各蚊を置きます。
- 砕いた氷（2-5分）にチューブを配置することによって、簡単に各蚊を冷やします。
- 双眼顕微鏡下でその右側に蚊を置きます。
- 実体顕微鏡下で、しっかりと胸腔のキューティクルの左側を貫通した後、液体やビーズを注入することにより、キャピラリーで蚊を接種します。
注：可能な限り蚊に同様に垂直にキャピラリーを保持することにより、飛翔筋を傷つけないように注意してください。 - 毛細血管を削除します。
- フェザー級昆虫学の鉗子を使用して、蚊帳で覆われた180ミリリットルのプラスチックカップに個別に女性を配置。彼らに10％の糖溶液へのアクセスを与えます。
注：蚊は、糖液滴にはまり込むことができるように注意、糖液で必要とされます。
6.モスキート解剖とビーズの写真
- 蚊が接種後24時間生きているかどうかを確認してください。もしそうであれば、その状態を確認し、飛ぶことができますだけで蚊を保ちます。
- -20℃で、これらの蚊をフリーズします。
注：必要に応じて彼らは、解剖の前に数ヶ月に数日間維持することができます。 - 32Xの倍率で双眼顕微鏡下でピンセットを使って蚊羽を削除します。透明テープでスライドガラス上に翼を固定してください。各個々の蚊のために使用されるコードを書き留めます。
- スキャナでガラススライドを入れて、1200 dpiでそれらをスキャンします。
注：コードは、個々の蚊のために読み取り可能であることを確認してください。 - ガラス顕微鏡スライド上にと解剖溶液中で、頭部と腹部から胸部を分離するために鉗子を使用しています。
- ビーズを取得するために鉗子で胸部を開きます。
注：腹部に移動しないビーズは、互いに接触しておらず、それらのほとんどがTで自由に浮きます彼は血リンパ。非メラニンビーズを見つけるのは厳しいものになる可能性があるため、ピンセットでビーズを壊さないように注意してください。色を得るためにビーズ1〜5分間待ってください。 - 写真を撮る前に、ガラス顕微鏡スライド上の解剖液の液滴中にビーズを転送します。
注：ビーズを洗浄する必要はありません。 - カメラを備えた顕微鏡を使用して、標準の照明設定と400Xの倍率で各ビーズのデジタル画像を撮ります。
注：彼らの比較を可能にするために、異なる画像間の照明を変更しないでください。
7.画像解析：ビーズメラニン
- 画像解析ソフトウェアを開きます。 「ファイル」をクリックして、「開く」をビーズ画像を見つけること。
- クリックして「分析」。クリックして「設定の測定値。 " 「セット測定」ウィンドウで「グレイ平均値」ボックスにチェックを入れ。
- サークル選択ツールアイコンをクリックします。ビーズ周囲を選択します。に残りますビーズを左右し、その周りに明るいハローを避けます。
- 「分析」メニューをクリックします。クリックして「尺度。」ビーズの断面積の平均グレー値とサイズを取得します。
- 「 - 灰色の平均値256。」：各ビーズのメラニン値を取得するには、電卓や計算機のソフトウェアを使用して、次の操作を行いますメラニンの尺度は0が完全に白画像を表すと、0と256の間の値です。
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Representative Results
いくつかのビーズが少ない他よりもメラニン（ 図1）で覆われていたとして蚊は、同じようにビーズをメラニン化するすべてではないでした。実際、いくつかのビーズが（ 図1）他の人が完全に暗くしたのに対し、理由メラニンの不足の青のままでした。メラニン値（青およびunmelanizedビーズに相当）が0と100（暗いと高メラニンビーズに相当）（ 図2a及び2b）の間の値を線形補間することにより標準化しました。これらの値は、従って、免疫応答の強度は、ビーズのメラニンの程度を示し、。
私たちは、彼らのメラニン値を比較することにより、相互にビーズを比較することができます。メラニンの応答は、一般的ANOVAまたはガウスGLMのような古典的な統計分析を可能にする、ガウス分布に従います。
。 "FO：キープtogether.within-ページ=" 1 ">我々は同時に蚊に接種したビーズの数に対するメラニン応答の変化を研究の目標は、変動のより良い理解を得ることであったとの限界メラニン応答。ビーズのサイズは、任意の効果を持っていませんでした。ビーズの数は、（Fのigure 2）増加した接種した場合、平均ビーズメラニン値は50に71から減少しました。免疫チャレンジが増加蚊におけるメラニン応答のいくつかの制限があります。また、メラニンの応答はそれぞれ1〜3個のビーズ、のために71から35に、各蚊に少なくとも-メラニンビーズの減少となりました。しかし、最も強くメラニンビードのメラニン値はほぼ一定にとどまりました。メラニンの変動は、ビーズの数とともに増加しました。メラニンの努力は、与えられた蚊内のすべてのビーズの間で均一ではありませんでした1ビーズのような他のものよりも優先されました。この注入法は、蚊に免疫応答の変動性を検討することが有用です。
図1：非メラニンの画像の例では、部分的にメラニン、および高度メラニンビーズ解剖後。左、中央、右には、それぞれ、非メラニンビーズ、部分的にメラニンビード、および高度メラニンのビーズです。
図2：接種したビーズの数の関数としてのビーズメラニン。 （a）は、各ポイントは（メラニン値が重くメラニンものに非メラニンビーズのための0から100までの範囲で）単一のビーズのメラニン化を示し、点の各列は、個々の蚊を表します。各mosquitoは、1つ、2つ、または3つのビーズを接種しました。固体ポイントは蚊あたり最高メラニン値を表し、交差した点は、中間メラニン値を表し、空のポイントが最も低いメラニン値を表します。実線はビーズ処置あたりの平均メラニンを表し、破線は、最も高いメラニンの平均値を示し、点線は最小メラニンの平均を示します。 （b）の平均とメラニン、最高のメラニンとビーズ接種の処置あたり最低メラニンの標準誤差。 ブラック（重くメラニンものに非メラニンビーズ0から100までの範囲のメラニン値を有する）ビーズの数の関数として平均ビーズメラニンを表します。赤い点が最も高いメラニンの平均を表します。青い三角形は、最低メラニンの平均を表します。バーは標準誤差です。参照19から変更されました。</ P>
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Discussion
この注入法は、蚊におけるメラニンの応答を刺激し、検討することが有用です。例えば、ここでは、免疫刺激負荷の影響を検討しました。
この手順の重要なステップは、適切に蚊に接種することです。飛翔筋または蚊自体への過度な損傷が給紙から蚊を防ぐことができるか、解剖の前にそれを殺すことができます。第二の重要なステップは、それらを殺すことなく、それらをノックアウトするのに十分な長さ氷上で蚊を維持することです。それは氷との緊密な接触を可能にするような小さな容器は、プロセスを容易にし、スピードアップします。ピンセットは、そうでない場合は、ビーズを破損する可能性があり最後に、特別な注意が、解剖時に必要とされています。蚊の組織に埋め込まれたビーズは、解剖液で着色するより多くの時間がかかることがあります。
彼らはMと（のような中立的、積極的、または負に帯電したビーズやガラスビーズ）は、異なる結果につながるビーズの複数種類を使用しますAYすべて同じ程度27,43にメラニンされていません。実際に、中性に荷電したビーズに比べて、負に帯電したビーズは、蚊27との間のメラニン応答のより多くの変動につながります。ガラスビーズは、他の一方で、蚊に不活性であり、すべての27でメラニン応答を誘発しません。負に帯電したビーズは、このように好ましいかもしれないが、別のビーズとの間の比較はまた、適切であり得ます。しかし、ビーズの種類に応じて、異なる色素を注入し、解剖ソリューションのために必要な場合があります。ガラスビーズ27を使用する場合、例えば、クレシルバイオレット染料の代わりにメチルグリーンを使用すべきです。
この注入法は、蚊のために侵襲的です。破損や損傷が最小限に抑えられ、制御することができたとしても、代替のツールは、実験計画に応じて、より良いオプションかもしれません。同じ蚊のいくつかの免疫応答を刺激し、同時に測定することは困難です。作業免疫応答28との間の相関を見ると蚊の家族やグループでる必要です。また、ビーズは、昆虫における寄生虫の実際の存在に部分的にしか似ています。
まず、免疫応答が刺激され、その後、得られた表現型の応答、カプセル化は、測定されるが、何の間で起こることは知られていません。生理学的または分子ツールで10回の注射をカップリング- 12は、このメラニン応答の我々の理解を向上させることができます。 12 -メラニン応答の根底にあるメカニズムを研究するために、重要な酵素またはプロフェノールオキシダーゼカスケード中に生成分子の発現は、10を測定することができます。しかし、最終的なカプセル化の実際の結果を知らずに、アップまたはダウンレギュレーションこのような分子のもっぱら焦点を当て、メラニン形成プロセスの不正確な評価につながる可能性があります。そのため、勉強encapsulationと一緒に分子メカニズムは別々に使用するとき、彼らはそれぞれの有効な科学的手法であるという事実にもかかわらず、非常に有益であろう。
結論として、これは免疫力や免疫力の進化を研究する技術です。マラリア原虫に対する殺虫剤抵抗性および蚊の感受性との間のリンクの証拠を増加させる、例えば、存在します。この注入法は、フィールド試験で、ならびに、そのような状況で使用することができます。第二の作業方向を詳細に免疫経路を研究するために、遺伝子ノックダウンと免疫刺激を組み合わせることです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
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