Abstract
Den stimulering af immunreaktioner er et fælles værktøj i hvirvelløse studier for at undersøge effekten og mekanismerne i immunitet. Denne stimulering er baseret på injektion af ikke-patogene partikler til insekter, da partiklerne vil blive opdaget af immunsystemet og vil inducere produktion af immuneffektorer. Vi fokuserer her på stimulering af melanin respons i myg malariamyg. melanin respons resulterer i indkapsling af fremmede partikler og parasitter med et mørkt lag af melanin. For at stimulere denne reaktion, er myg podet med perler i brysthulen hjælp mikrokapillær glasrør. Så efter 24 timer, er myggene dissekeret for at hente perlerne. Graden af melanin af perlen måles anvendelse af billedanalyse-software. Perler har ikke de patogene virkninger af parasitter eller deres evne til at omgå eller undertrykke immunreaktionen. Disse injektioner er en måde at measure immun effekt og effekten af immun stimuleringer på andre liv historie træk, såsom frugtbarhed eller levetid. Det er ikke helt det samme som direkte studere vært-parasit interaktioner, men det er en interessant værktøj til at studere immunitet og dets evolutionære økologi.
Introduction
Insekter afhængige immunreaktioner at beskytte sig mod parasitter og patogener 1 - 3, der overtræder gennem deres neglebånd eller deres mellemtarmen epitel 4. I myg, disse reaktioner er effektive mod bakterier 5, vira 6, filarial nematoder 7 og malariaparasitter 1,8,9. I myg, en nøgle immunrespons er indkapslingen af fremmede partikler med melanin 10 - 12 år. Denne indkapsling kan ske i mellemtarmen eller i hæmolymfe cirkulerende systemet 10-12. Denne melanin reaktion er resultatet af den pro-phenoloxidase kaskade 10 - 12 og det kan føre til døden af parasitter eller deres fagocytose. Hos voksne myg, hvor antallet af hæmocytter celler er begrænset, melanin er et humoralt respons, ligesom mod Plasmodium parasitter eller filarial nematoder 7.I nogle andre insekter, det er direkte de hæmocytter celler, der samles omkring parasitten at melanize dem 7. Desuden, melanin er også afgørende for flere andre fysiologisk proces som ægproduktion og kutikula sår healing 7.
Stimuleringen af immunresponser anvendes som et værktøj til at studere insektimmunitet i flere landbrugs- og folkesundheden modelsystemer 13 - 18. Det anvendes i malariamyg myg, de store vektor af malaria i Afrika, for at studere vært-parasit interaktioner 14 - 16,19. Disse teknikker er baseret på kapaciteten af insekter for parasitter med deres mønstergenkendelse receptorer (PRR) 2. Myg kan også detektere andre molekyler der interfererer med deres biologi såsom patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs), eller detektere deres egne beskadigede celler på grund af frigivelsen af kollagen og nukleinsyrer. Den myg immun celles såsom hæmocytter anvendes til påvisning 20 -. 23 De vigtigste immune signalveje er IMD, Toll, JAK / STAT 24, og ribonukleinsyre interferens (RNAi) 25,26. Både Toll og IMD veje påvirke melanin respons og interagere med pro-phenoloxidase kaskade 10-12.
Standarden værktøj anvendes til at stimulere melanin respons er podning af en myg med en lille perle i hæmolymfe af brysthulen. Kan derefter måles Graden af melanin indkapsling 19 efter at hente perlen gennem dissektion af myg. I de fleste undersøgelser blev kun én kugle injiceret pr mosquito 15,16,27, men injicere flere perler er muligt for at studere grænserne for melanin respons 19. Disse perler injiceres under anvendelse af en injektionsopløsning (fysiologisk serum) for at begrænse forstyrrelse af myg fysiologi ogden udtørring af myg 15,16,27. En farvestof tilsættes til denne opløsning for at lette bead markering. Det er det samme for dissektion opløsning anvendes til at finde perlen 15,16,27.
Fordelen ved at pode insekter med ikke-patogene stimuli er evnen til at fokusere på den direkte effekt på immunforsvaret. Der er ingen komplicerende virkninger på grund parasit patogenicitet 28, immunosuppression 29 - 31, eller immun unddragelse 31-34. Desuden konsekvenserne af de stimulationer på andre liv historie træk, såsom levetid eller frugtbarhed, kan også blive undersøgt. Således kan forskere studerer evolutionær økologi kræver sådanne værktøjer 2,35,36. For eksempel, immuno-udfordret humlebier har en kortere levetid under sult. Samme negative virkninger af immune stimuleringer og implementeringer er blevet observeret i forskellige hvirvelløse modeller, hvilket ofte resulterer i en kortER levetid eller mindre reproduktive succes 13,27,37. Sådanne undersøgelser kan udføres i varierende miljøer 2,4,38. Stimulering immunitet er også af interesse for dem, der fokuserer direkte på immunopatologi 39,40.
Denne protokol er baseret på inokulering af perler med myg at stimulere melanin respons og direkte måler mængden af melanin. Dette muliggør kvantitativ og kvalitativ undersøgelse af melanin respons i forskellige eksperimentelle indstillinger. Et sådant værktøj kan udvides til stimuleringen af andre immunresponser, såsom det antibakterielle respons på varmedræbte bakterier 41. Det kan også udføres i mange økologiske indstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. saltvandsopløsning til injektion og Dissection
- Forbered saltopløsningen ved tilsætning NaCl, KCl, og CaCl2 til destilleret vand til opnåelse af 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCI og 0,2 mM CaCl2 ved pH = 6,8.
- Der tilsættes 1 ml 0,1% methyl grøn opløsning til 99 ml af saltvandsopløsningen at farve gennemsigtige perler. Dette er den 0,001% methylgrønt "injektionsopløsning".
- Derefter tilsættes 5 ml 0,1% methyl grønne opløsning 45 ml af saltopløsningen. Denne 0,01% methylgrønt "dissektion opløsning" er 10 gange mere koncentreret i methylgrønt at lette farvning af perlerne og deres iagttagelser under dissektion.
BEMÆRK: Filtersteriliser bufferen om nødvendigt.
2. Kapillær Forberedelse
- Heat-pull mikrokapillære glasrør at opnå en meget fin spids lidt større end de mindste perler (φ = 40 um) 42.
- Åbne og endjust hver kapillar ved at bryde spidsen med en pincet eller ved at save spidsen off.
3. Mosquito Opdræt
- Rear A. gambiae ved 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% relativ fugtighed, og en 12:12 timers lys: mørke cyklus. Hold voksne kvinder og give dem adgang til en 10% sukkeropløsning.
4. Bead Selections med Kapillær
- Hæld 0,009 g af negativt ladede perler (40-120 um i diameter) i en 5 cm petriskål, og der tilsættes 5 ml injektionsopløsning 30 minutter i forvejen.
BEMÆRK: Målet er at lade farvestoffet farve perlerne til at gøre perle valg til injektion lettere. Autoklaver perlerne, hvis de ikke kommer i en steril beholder. - Ved hjælp af en kapillær monteret i en kapillær pipette pære vælge visuelt den mindste perle i 0,1 pi af saltopløsning under et binokulært mikroskop.
BEMÆRK: Når pode flere perler på samme tid, skal du vælge tre perler fra en samlet volumen på 0,1 pi.
5. Mosquito Håndtering og Podning
- Ved hjælp af en insektsuger, sted hver myg i et 50 ml rør.
- Chill hver myg kortvarigt ved at placere røret i knust is (2-5 min).
- Placer en myg på sin højre side under kikkerten mikroskop.
- Under et stereomikroskop, pode mosquito med kapillærrøret ved kraftigt piercing gennem venstre side af brysthulen kutikula og derefter indsprøjtning af væsken og perlen.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige flyvning muskler ved at holde kapillær så vinkelret på myg som muligt. - Fjern kapillarrøret.
- Brug fjervægtsklassen entomologi pincet, placere hver hun individuelt i en 180 ml plastik kop dækket med myggenet; give dem adgang til en 10% sukkeropløsning.
BEMÆRK: Forsigtighed er påkrævet med sukker løsning, som myg kan sidde fast på sukkeropløsning dråber.
6. MosquitoDissektion og Bead Photography
- Kontroller, om myggene er i live 24 timer efter podningen. Hvis ja, tjek deres tilstand og holde kun de myg, der er i stand til at flyve.
- Frys disse myg ved -20 ° C.
BEMÆRK: De kan holdes flere dage til måneder før dissektion, hvis det er nødvendigt. - Fjern myg 'vinger med en pincet under et binokulært mikroskop ved 32X forstørrelse. Fastgør vingerne på objektglas med gennemsigtig tape. Skriv ned den anvendte kode for hver enkelt myg.
- Sæt objektglas i en scanner og scanne dem på 1.200 dpi.
BEMÆRK: Kontroller, at koden er læsbar for hver enkelt myg. - På en objektglas og dissektion løsning, bruge pincet til at adskille thorax fra hovedet og maven.
- Åbne thorax med pincet for at hente perlerne.
BEMÆRK: Perler, der ikke bevæger sig til maven, ikke er i kontakt med hinanden og de fleste af dem flyde frit i than hemolymph. Vær omhyggelig med ikke at bryde perle med pincet, som en ikke-melanized perle kan være svært at finde. Vent i 1 til 5 minutter for perler til opnåelse farve. - Overfør perlerne i en dråbe af dissektion løsning på et objektglas, før du tager billedet.
BEMÆRK: Ingen grund til at vaske perlerne. - Ved hjælp af et mikroskop udstyret med et kamera, tage et digitalt billede af hver perle på en standard belysning indstilling og 400X forstørrelse.
BEMÆRK: Du må ikke ændre belysningen mellem de forskellige billeder for at aktivere deres sammenligning.
7. Picture Analyse: Bead melanin
- Åbn billedanalysesoftware. Klik på "File" og derefter på "åben" for at finde en perle billede.
- Klik på "analysere". Klik på "fastsatte målinger." Sæt kryds i boksen "betyder grå værdi" i "sæt målinger" vinduet.
- Klik på ikonet cirkel markeringsværktøjet. Vælg bead perimeter; forblive iside perlen og undgå den lysende ring omkring den.
- Klik på "analysere" menuen. Klik på "foranstaltning." Opnå den gennemsnitlige gråtone værdi og størrelsen af tværsnitsarealet af perlen.
- For at opnå den melanin værdi hver perle, udføre følgende handling ved hjælp af en lommeregner eller regnemaskine software: "256 - betyder grå værdi." Den melanin foranstaltning er et værdi mellem 0 og 256, hvor 0 repræsenterer et helt hvidt billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myg ikke alle melanize perlerne på samme måde, som nogle kugler blev mindre dækket med melanin end andre (figur 1). Faktisk er nogle perler forblev blå på grund af manglende melanin, mens andre var helt mørkt (figur 1). Den melanin værdi blev standardiseret ved lineær interpolation til en værdi mellem 0 (som svarede til en blå og unmelanized perle) og 100 (svarende til en mørk og stærkt melanized perle) (figur 2a og 2b). Disse værdier indikerer graden af melanin af perlerne og dermed styrken af immunresponset.
Vi kan sammenligne perler til hinanden ved at sammenligne deres melanin værdier. Den melanin respons generelt følger en Gauss-fordeling, som gør det muligt klassiske statistiske analyser som ANOVA eller Gaussisk GLM.
"Fo: holde-together.within-side =" 1 "> Vi undersøgte variationen af melanin respons med hensyn til antallet af perler samtidigt inokuleret i en myg Målet var at opnå en bedre forståelse af variabilitet og begrænsninger. den melanin respons. størrelsen af vulsten har ikke nogen virkning.Den gennemsnitlige bead melanin værdi faldt fra 71 til 50, når antallet af perler inokuleret forøget (F igur 2). Der er nogle grænser for melanin respons i en myg når immunansporing stiger. Desuden melanin svar faldt for de mindst melanized perle i hver myg, 71-35 i en til tre perler, hhv. Imidlertid melanin værdi stærkest melanized vulst forblevet omtrent konstant. Variabiliteten af melanin stiger med antallet af perler. Den melanin indsats var ikke ensartet blandt alle perler i en given myg,som en perle blev prioriteret frem for andre. Denne injektion teknik er nyttig til at studere variabiliteten af immunresponser i myg.
Figur 1: Picture eksempler på en ikke-melanized, en delvist melanized, og en meget melanized perle efter dissektion. På venstre, midterste og højre er en ikke-melanized perle, en delvist melanized perle, og en højt melanized perle hhv.
Figur 2: Bead melanin som en funktion af antallet af podede perler. (A) Hvert punkt viser melanin af en enkelt perle (med melanin værdier i intervallet fra 0 til ikke-melanized perler til 100 for stærkt melanized dem) og hver kolonne af punkter repræsenterer en individuel myg. hver mosquito blev inokuleret med en, to eller tre kugler. De solide punkter repræsenterer den højeste melanin værdi pr myg, de krydsede punkter repræsenterer den mellemliggende melanin værdi, og de tomme punkter repræsenterer laveste melanin værdi. De fuldt optrukne linier repræsenterer middelværdien melanin per bead behandling, de stiplede linjer viser middelværdien af højeste melanin, og de stiplede linjer angiver middelværdien af de laveste melanin. (B) Mean og standard fejl af melanin, det højeste melanin og laveste melanin pr perle podning behandling. Den sorte repræsenterer middelværdien bead melanin som en funktion af antallet af perler (med melanin værdier i området fra 0 til ikke-melanized perler til 100 for stærkt melanized dem). Det røde punkt repræsenterer middelværdien af højeste melanin. Den blå trekant repræsenterer middelværdien af de laveste melanin. Søjlerne er standardafvigelser. Modificeret fra henvisning 19. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne injektion teknik er nyttig til at stimulere og studere melanin respons i myg. For eksempel er her undersøgte vi virkningen af immun stimuli belastning.
Den kritiske skridt i denne procedure er at korrekt pode myg. Enhver stor skade på de fly muskler eller til selve myg kan forhindre myg fra fodring eller kan dræbe det før dissektion. Et andet vigtigt skridt er at holde myggene på is længe nok til at slå dem ud uden at dræbe dem. En lille beholder bliver det lettere og fremskynde processen, da det giver tættere kontakt med isen. Endelig er der behov særlig pleje under dissektion, som pincet ellers kan bryde perlerne. Perler indlejret i myg væv kan tage længere tid at være farvet af dissektion løsning.
Brug af flere typer af perler (som neutralt, positivt eller negativt ladede perler eller glasperler) vil føre til forskellige resultater, som de may ikke alle være melanized i samme grad 27,43. Faktisk sammenlignet med neutralt ladede perler, negativt ladede perler føre til mere variation i melanin reaktion mellem myg 27. Glasperler, på den anden side, er inaktivt i myg, og ikke udløse melanin respons på alle 27. Negativt ladede perler kan således være foretrukket, men sammenligninger mellem forskellige perler kan også være relevante. Men afhængigt af den form for vulsten, et andet farvestof kan være påkrævet til injektion og dissektion løsninger; for eksempel bør cresylviolet farvestof anvendes i stedet for methyl grønt, når anvendelse af glasperler 27.
Denne injektion teknik er invasiv for myg. Selvom skader og skade kan minimeres og kontrolleres, kan alternative værktøjer være en bedre løsning, afhængigt af den eksperimentelle design. Det er vanskeligt at stimulere og samtidig måle flere immunresponser i samme myg. Arbejdeing på familier eller grupper af myg er påkrævet, når man ser på de sammenhænge mellem immunreaktioner 28. Desuden, perler er kun delvis ligner den faktiske forekomst af parasitter i et insekt.
Først immunrespons stimuleres, og derefter blev den resulterende fænotypisk respons, indkapslingen, måles, men hvad der sker i mellem er ukendt. Kobling injektioner med fysiologiske eller molekylære værktøjer 10 - 12 kan forbedre vores forståelse af dette melanin svar. At studere de underliggende mekanismer i melanin respons, kan udtrykket af centrale enzymer eller molekyler fremkommet under pro-phenoloxidase kaskade måles 10-12. Men udelukkende at fokusere på op- eller nedregulering af sådanne molekyler, uden at kende de faktiske følger af den endelige indkapsling, kan resultere i en forkert vurdering af melanin processen. Derfor studerer ENCApsulation og de molekylære mekanismer sammen ville være meget informative, til trods for at de er hver en gyldig videnskabelig teknik, når de anvendes hver for sig.
Afslutningsvis, det er en teknik til at studere immunitet og udviklingen af immunitet. Der er for eksempel stigende evidens for en forbindelse mellem insekticidresistens og myg modtagelighed for malariaparasitter. Denne injektionsteknik kan anvendes i en sådan sammenhæng, samt i markforsøg. En anden arbejdsretning ville være at kombinere immunstimulering med gen knockdowns at studere immune pathways i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P.
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K.
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J.
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C.
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
