Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Published: January 2, 2017 doi: 10.3791/55039
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

Protocol

الحصول على موافقة لاستخدام العينات البشرية من قبل المجلس / مجلس المراجعة المؤسسية أخلاقيات البحث، والحصول على موافقة موقعة من جميع الجهات المانحة الإنسان. مجلس العمل المتحد ويمكن أيضا أن يقوم باستخدام PBMCs الماوس بطريقة مماثلة لفحص البشري، بعد موافقة أخلاقيات استخدام الحيوانات. مجلس العمل المتحد تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة العقيم.

ملاحظة: انظر الشكل 1.

ملاحظة: على الرغم من أننا نوصي استخدام الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2 خلال فحص للحفاظ على تقنية العقيم، كأسلوب ليست سوى "على المدى القصير" طريقة والثقافة، وليس هناك وقت حقا ما يكفي للبكتيريا لتلويث الفحص. ولذلك، إذا لم يكن موجودا الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2، بدلا من شراء واحدة فقط لهذا الفحص، يمكن إجراء فحص خارج مجلس الوزراء الاحتواء البيولوجي، على مقاعد البدلاء مفتوحة. استخدام الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2، ومع ذلك، ليس خيارا، ويجب أن تستخدم لالنتائج المثلى.

1. الدم المحيطي وحيدات النوى عزل الخلايا

  1. الحصول على الدم الكامل البشري من متبرع سليم أو المريض عن طريق بزل الوريد باستخدام vacutainers التي تحتوي على حمض سترات الدكستروز (ACD) تخثر (الأصفر أعلى أنابيب).
    ملاحظة: الدم كله يمكن تخزينها في حوار التعاون الآسيوي في درجة حرارة الغرفة (18-22 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 36 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (11). عادة، 1-2 10 مل أنابيب vacutainer من الدم الكامل كافية للفحص.
  2. تمييع الدم الكامل 1: 1 ت / ت في حارة كاملة المتوسطة RPMI (RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 20 ملي HEPES، و 0.01 ملغ / مل الجنتاميسين).
  3. عزل الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMCs) من الدم الكامل المخفف باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (انظر قائمة من المواد). طبقة من الدم المخفف ببطء شديد على مدى التدرج الكثافة (درجة حرارة لدرجة حرارة الغرفة، 18-22 درجة مئوية).
    ملاحظة: تقليل كمية للانترنتنانوغرام في واجهة لفصل الأمثل من الدم عن طريق طبقات بعناية الخليط الدم بطريقة قطرة قطرة أو باستخدام ماصة.
    1. السماح للخليط الدم إلى طبقة ببطء فوق الجزء العلوي من التدرج الكثافة عن طريق وضع طرف الماصة على مقربة من التدرج الكثافة ومن خلال تمكين خليط الدم لتشغيل أسفل الجانب من الأنبوب ببطء شديد.
    2. اعتمادا على حجم التجربة، طبقة 10 مل من خليط الدم على رأس 3 مل من درجة الكثافة (في أنبوب 15 مل) أو طبقة 35 مل من خليط الدم على رأس 15 مل من درجة الكثافة (في 50 مل أنبوب). عادة، 10 مل من الدم الكامل ينتج 10 ملايين PBMCs، مع بعض الاختلاف المانحة إلى الجهات المانحة.
      ملاحظة: من المهم جدا أن يكون هناك أي اختلاط الخليط الدم مع التدرج الكثافة. يجب أن طبقة الخليط الدم خلال التدرج كثافة وترتفع ببطء حتى كل الدم على أعلى درجة الكثافة.
    3. أجهزة الطرد المركزي الخليط الطبقات في 700 x ج لمدة 30 دقيقة دون فرامل. والطرد المركزييجب فصل خليط ifuged إلى 5 طبقات (من الأعلى إلى الأسفل): البلازما، ومعطف بافي (التي تحتوي على PBMCs)، كثافة المواد التدرج، المحببة، وكرات الدم الحمراء.
    4. إزالة والتخلص من غالبية البلازما واسترداد بعناية محتوى معطف الشهباء (PBMC) في أنبوب 15 مل جديد باستخدام ماصة باستور ولمبة الشفط.
      ملاحظة: إزالة طبقة معطف الشهباء يتم ذلك على نحو فعال من خلال تطبيق الشفط على ماصة باستور أثناء أداء حركة دائرية حول الجزء الخارجي من طبقة، مع غيض من ماصة ضد الأنبوب.
  4. غسل PBMCs معزولة ثلاث مرات في درجة الحموضة 7.3 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة (مع الفرامل كاملة) بين يغسل. إعادة بيليه PBMC في المتوسط ​​RPMI كاملة. اعتمادا على حجم بيليه، 3-7 مل من المتوسط ​​غير كافية.
  5. عد PBMC باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات. الاعتماد فقط تلك الخلايا التي لم يتم الملون بالأزرق التريبان. Reconstitutه على PBMCs إلى 1،750،000 خلية / مل في المتوسط ​​RPMI كاملة.
  6. البذور 400 ميكرولتر (700،000 خلايا) في كل بئر من الشريحة 8 الغرفة. احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية، ترطيب تماما نسيج الثقافة الحاضنة (تستكمل مع 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة للسماح للالوحيدات / الضامة على الانضمام.

2. المعالجة المسبقة للالالتزام وحيدات

ملاحظة: هذه الخطوة الضرورية فقط إذا كنت تبحث عن سبل لمنع أو تعزيز البلعمة.

  1. انضمت قبل علاج حيدات مع أي دواء (ق) أو مركب (ق) من الفائدة. إعادة تشكيل المخدرات (ق) أو غيرها من المواد اختبار للتركيز المطلوب باستخدام المتوسطة RPMI كاملة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، عادة ما تستخدم 200 ميكروغرام / مل من IVIG أن تسفر عن تثبيط 95-100٪ من البلعمة عند استخدام حيدات الإنسان.
  2. نضح وتجاهل طاف تحتوي على أي خلايا غير ملتصقة من الشريحة 8 الغرفة بعد حضانة 1-ساعة (بعد الخطوة 1.6). استبدله 400ميكرولتر من دواء أو علاج آخر واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    1. عندما الشفط واستبدال الحلول في الشريحة 8 الغرفة، تأكد للسيطرة على تدفق السوائل بحيث خلايا الالتزام ضعيف لا يقلع. أيضا، والعمل مع فقط 2-3 الآبار فارغة في وقت وتجنب تجفيف الآبار.
      ملاحظة: عادة، يتم تنفيذ كل معاملة في يثلث التقنية.

3. طهاية من R 2 R 2 خلايا الدم الحمراء

ملاحظة: R 2 R 2 المستخدمة هنا هي الحصول عليها من مركز جمع الدم (الكندية خدمات الدم)، وإنما هي أيضا متاحة تجاريا. تستخدم Opsonized R 2 R 2 كرات الدم الحمراء كما تحكم إيجابية لالبلعمة بوساطة FcγR. السذاجة R 2 R 2 يجب أن يتم تخزينها في حل Alsever في (لإطالة العمر الافتراضي) في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. يتم حل Alsever لفي المنزل ويتكون من 0.8٪ ث / ت سترات الصوديوم (ثنائي الهيدرات)، 1.9٪ ث / ت سكر العنب، 0.42٪ ث / ت كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ ث / ت حمض الستريك (الهيدرات). إذا R 2 R 2 خلايا غير متوفرة، وغيرها من الخلايا phenotyped الصحة الإنجابية، مثل R 1 R 2، R 1 R 1، R 1 ص، أو R 2 ص، ويمكن استخدامها.

  1. غسل R 2 R 2 (الرفيق / الرفيق) خلايا الدم الحمراء في برنامج تلفزيوني ما مجموعه ثلاث مرات باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: كمية كرات الدم الحمراء اللازمة يعتمد على حجم التجريبية ويمكن أن يكون حساب العودة. غسل دائما كمية كبيرة من كرات الدم الحمراء، حيث يتم فقدان كرات الدم الحمراء خلال كل غسل بسبب تحلل أو أثناء إزالة طاف. على سبيل المثال، في تجربة مع 5 العلاجات و2 الضوابط، كل أجريت في يثلث التقنية، هناك ما مجموعه 21 بئرا. 21 بئرا مع 400 ميكرولتر / بئر 1.25٪ RBC الخليط إلى أن 105 ميكرولتر من معبأة، opsonized هناك حاجة إلى ربك. 200 ميكرولتر من RBC يجب غسلها في البداية و 150 & #يجب opsonized L لضمان وجود كمية كافية من كرات الدم الحمراء للخطوة البلعمة، 181.
  2. يستطهي غسلها R 2 R 2 بيليه مع 1: 1 ت / ت بولكلونل أضداد-D من مصل الدم البشري واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع الخلط على فترات متقطعة.
    ملاحظة: إذا بولكلونل أضداد-D غير متوفرة، فمن الممكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للD، وهي متوافرة تجاريا، أو مكافحة-D الذي يستخدم عادة لره الوقاية المناعي، والتي يمكن الحصول عليها من بنوك الدم أو نقل خدمات. وينبغي إجراء الاختبار الأمثل في البداية، عند إعداد مقايسة، وكلما تبديل الكثير من الأجسام المضادة، titered الامم المتحدة أو التحول إلى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا هو تحديد تركيز الأمثل أو حجم المضادة للD المطلوبة لاختبار أضداد الغلوبولين (IAT) نتيجة بين 3+ و 4+ والبلعمة نتيجة بين 70-90 كرات الدم الحمراء المبتلعة في 100 حيدات فرزها.
  3. غسل يستطهيد R 2 R 2 ما مجموعه ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: طهاية بنجاح R 2 R 2 ويمكن التأكد عن طريق إجراء IAT غير مباشر. لفترة وجيزة، وأضاف الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الإنسان لربط الأجسام المضادة opsonizing الأولية على الأسطح RBC، وإشارة تضخيمها بحيث يمكن ملاحظتها في شكل التراص. ويمكن الاطلاع على بروتوكول الشركة المصنعة مفصل في ملف المواد التكميلية.
  4. إعادة غسلها R 2 R 2 بيليه إلى 1.25٪ ت / ت باستخدام المتوسطة RPMI كاملة.
    ملاحظة: الزائد R opsonized 2 R 2 يمكن تخزينها في حل Alsever لفي 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

4. البلعمة بوساطة مستقبلات-FC

  1. نضح المخدرات أو طاف المتوسط من الشريحة 8 الغرفة وإضافة 400 ميكرولتر من 1.25٪ ت / ت R 2 R 2 الخليط. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  2. الخلفإيه 2 ساعة من الحضانة، وإزالة الدوائر باستخدام محولات الشركة المصنعة. ربت قبالة الزائد R 2 R 2 على منشفة ورقية. تأكد من أن شريحة لا تجف.
  3. ملء كوب 100 مل مع برنامج تلفزيوني. غمر وغسل الشريحة التي تتحرك ببطء الشريحة ذهابا وإيابا (حوالي 30-40 السكتات الدماغية) لإزالة غالبية-المبتلعة الامم المتحدة R 2 R 2.
  4. إزالة الشريحة من برنامج تلفزيوني. ربت قبالة الزائد PBS باستخدام منشفة ورقية أو الأنسجة والهواء الجاف الشريحة.
  5. إصلاح الشريحة المجفف في الهواء في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 45 ثانية. ثم، والهواء الجاف الشريحة الثابتة.
    ملاحظة: يمكن ان تكون ثابتة الشرائح باستخدام طريقة أخرى التي هي أكثر توافقا لتلطيخ المصب، مثل وصمة عار جرونوالد بالغيمزا 21 أو وصمة عار رايت بالغيمزا 22.
  6. جبل الشريحة باستخدام في صنع منزل تصاعد elvanol المتوسطة (أو المتوسطة المتزايدة المتاحة تجاريا آخر) وإضافة coverslips.
    يتكون Elvanol المتوسطة المتزايدة من 15٪ ث / ت ص: ملاحظةlyvinyl الراتنج الكحول و 30٪ ت / ت الجلسرين في برنامج تلفزيوني. ويسخن المزيج حتى يذوب كل الراتنج والجليسرين مختلطة متجانس. يمكن استبدال هذا مع تصاعد المتوسط ​​الأخرى المتاحة تجاريا.
  7. السماح للجبل لتجف بين عشية وضحاها قبل الكمي.

5. الكمي من البلعمة

  1. باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من و40X عدسة الهدف، تحديد يدويا كمية من الأحداث أكلة عن طريق العد لا يقل عن 200 حيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2 ضمن هذه حيدات. هل لديك عداد واحد في كل يد لتحديد وقت واحد وعدد من وحيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2.
  2. الحصول على متوسط مؤشر أكلة بقسمة عدد من المبتلعة R 2 R 2 من قبل عدد من وحيدات ضرب من قبل 100. اكسبريس البيانات كما المتوسط (متوسط مؤشر البلعمة) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).

Representative Results

باتباع الخطوات الحاسمة في الشكل (1) والإجراءات الموضحة أعلاه، مجلس العمل المتحد لا يمكن أن يؤديها بتكاثر. وقد استخدم IVIG كمثال لتثبيط البلعمة في الشكل 2. ومن المعروف IVIG لربط ومنع المستقبلات التيسير، مما يحول دون نتائج المصب البلعمة. بواسطة المعايرة كمية IVIG المستخدمة، لوحظ تثبيط تعتمد على الجرعة، التي تركيزات أعلى من 200 ميكروغرام أسفرت / مل في ما يقرب من 100٪ تثبيط وتركيزات أقل من 0.5 ميكروغرام / مل لم تمنع على الإطلاق (الشكل 2A). عندما تتحول المؤشرات أكلة وتطبيع للمراقبة إيجابية R 2 R 2 ك 0٪ كبت، منحنى تثبيط مع IC 50 من 3 ميكروغرام يمكن تحديد / مل (الشكل 2B).

بالإضافة إلى إجراء فحص على الدوام، quantificaنشوئها الفحص يمكن أن يكون صعبا في بعض الأحيان. الشكل (3) عبارة عن مجموعة من المرحلة على النقيض من الصور المجهري مختلف الشرائح MMA. مع خبرة المجهر، يمكن للمرء أن يميز الوحيدات من RBC تلوث (الشكل 3D)، أو فجوة من RBC المبتلعة (الشكل 3B). وينبغي تجنب التجمعات الكثيفة للخلايا و / أو الحطام خلال الكمي (أرقام 3E و F). أيضا، ينبغي للمرء تجنب الإفراط في opsonizing آر 2 R 2 RBC، التي من شأنها أن تؤدي إلى البلعمة الكبيرة التي يمكن overcrowds الداخلية الوحيدات ويتداخل مع التقدير الدقيق (الشكل 3C).

شكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي من مجلس العمل المتحد. ووصف خطوة بخطوة من خطوات حاسمة في مجلس العمل المتحد: عزل PBMC من الدم الكامل، وإطعام monocyt الالتزاموفاق مع opsonized R 2 R 2، وغسل الشرائح غرفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الوريد مفتش (IVIG) يمنع البلعمة في المختبر باستخدام MMA. ومن المعروف IVIG لمنع البلعمة، ويستخدم كعنصر تحكم تثبيط في MMA البشري. (A) المعايرة من IVIG أدى إلى تثبيط تعتمد على الجرعة البلعمة بالمقارنة مع غير المعالجة R 2 R 2 السيطرة. وأظهرت النتائج أن متوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) ن = 3 تجارب. وقد أجري التحليل الإحصائي باستخدام الطلاب ر -test: ** P≤0.01 و*** P≤0.001. (ب) منحنى تثبيط IVIG مع IC 50 سو 3 ميكروغرام / مل (الخط المنقط). وتشير نتائج البيانات تطبيع لR غير المعالجة 2 R 2 (0٪ تثبيط)؛ يعني ± SEM من ن = 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المرحلة على النقيض الصور المجهر الشرائح العينة تحت 40X التكبير. (A) الشريحة مثالية فيه حيدات المبتلعة 1-2 R 2 R 2 في المتوسط (السهام السوداء مع توهج هالة مميزة)، مع عدد قليل جدا من تلويث، برنامج الأمم المتحدة للالمبتلعة R 2 R 2 في الخلفية (السهام البيضاء). فجوات (B) كما هو مبين في هذه الشريحة، وحيدات في بعض الأحيان قد الموسع (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لالمبتلعة R 2 R 2. (C </ قوي>) عندما يكون R 2 R 2 الإفراط في opsonized، أكثر من 4-5 المبتلعة R 2 R 2 في الوحيدات (الأسهم السوداء) تجعل عد دقيقة صعبة، منذ R 2 R 2 تزدحم داخل الوحيدات وخلية متميزة لا يمكن تمييزها الحدود. (D) غسل عدم كفاية الشريحة يؤدي إلى وفرة R 2 R 2 تلوث (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لكرات الدم الحمراء الالتزام. (E) في بعض الأحيان، وحيدات وكرات الدم الحمراء تلويث قد شكل مجموعات. تشير مجموعات أيضا التلوث الجرثومي، والتي ينبغي تجنبها. (F) وحيدات قد تشكل المجاميع الكبيرة، التي يجب تجنبها أثناء الكمي. عن طريق اختيار عشوائي من الحقول لعرض، لوحة (أ) هو ما لوحظ عادة إذا كان قد تم إجراء MMA بشكل صحيح. شريط النطاق هو 20 ميكرون. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

مجلس العمل المتحد هو أسلوب شاقة تتطلب الخبرة في كل من زراعة الأنسجة والفحص المجهري. هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان النجاح: 1) جيل من أحادي الطبقة الوحيدات. 2) طهاية من كرات الدم الحمراء، و 3) الكمي اليدوي. لا تلتزم أحادي الطبقة الوحيدات بقوة إلى الشريحة الغرفة، لذلك يجب المحافظة على درجة الحموضة الفسيولوجية في جميع أنحاء فحص 11، وينبغي أن المصنف وجود عدد كاف من PBMCs. pipetting لقوي، والتي قد تعكر صفو خلايا الالتزام، ينبغي تجنبها. نهج واحد هو إزالة دائما وإضافة حلول من نفس زاوية الغرفة والتأكد من أن الحركة بطيئة وثابتة. وبالمثل، خلال خطوة الغسيل الأخيرة لإزالة الزائد كرات الدم الحمراء، وينبغي أن تكون الحركة بطيئة وثابتة. وهذا يضمن الحد الأدنى من اضطراب أحادي الطبقة في حين لا يزال إزالة الغالبية العظمى من كرات الدم الحمراء-المبتلعة الامم المتحدة. وغسل غير كافية يؤدي إلى خلفية عالية من كرات الدم الحمراء الملوثة، الأمر الذي يجعل منه اليدويntification صعوبة. ثانيا، كرات الدم الحمراء R 2 R 2 يجب opsonized بما فيه الكفاية للحصول على متوسط مؤشر أكلة من 80-120 لمراقبة البلعمة. هذا النطاق أكلة المطلوب توازنا بين سهولة العد (على سبيل المثال، المبتلعة حيدات مع أكثر من 5 كرات الدم الحمراء يصعب تحديدها بدقة) والحفاظ على كمية كافية من البلعمة للتحليل الإحصائي. درجة طهاية يمكن تأكيد من قبل معهد التكنولوجيا التطبيقية، وهناك حاجة إلى القراءة بين 3+ 4+ ل. وR 2 R يجب التخلص 2 كرات الدم الحمراء عندما يكون هناك تحلل الزائد أثناء الغسيل، عندما يتحول طاف الأحمر الداكن، أو عندما لوحظ انخفاض كبير في البلعمة في التجارب نظرا لشيخوخة الخلايا في التخزين. وأخيرا، وتحديد يدوي باستخدام المجهر ويمكن أن تكون خادعة، وخاصة عند المقارنة بين التهم بين أفراد المختبر وبين التجارب. من خلال دراسة نفس المجال على كل بئر، أو ببساطة عن طريق عد المزيد من الخلايا، يمكن الحصول على عدد أكثر اتساقا. ويوصى التدريب جنبا إلى جنب مع فني من ذوي الخبرة واستخدام مجموعة معينة من الشرائح التدريب.

نقد كبير من مجلس العمل المتحد هو ذاتية الخطوة الكمي اليدوية. ومع ذلك، مع التدريب المناسب، والاتساق ويمكن الحصول عبر عدادات مختلفة. الحد الآخر هو الجوهرية الخلافات المانحة إلى الجهات المانحة في قدرات أكلة الوحيدات وفي R 2 R 2 سطح مستويات التعبير مستضد، والتي هي مصدر التباين في البيانات عند التعامل مع العينات البشرية.

تتوفر لدراسة البلعمة بوساطة FcγR تقنيات بديلة أخرى. غالبية مجموعات تجارية تستخدم الناتج الفلورسنت لمراقبة البلعمة (على سبيل المثال، bioparticles وحساسة درجة الحموضة البروتين مضان، أو المسمى مفتش الخرز اللاتكس الفلورية). استخدام الناتج الفلورسنت لا تقدم الكمي أكثر موضوعية، ولكن يحتاج واحد أيضا لخداعسدر توافر والتكلفة والتدريب المرتبطة باستخدام المجهر الفلورسنت أو قياس التدفق الخلوي، فضلا عن الاعتماد التي تلت ذلك على مجموعات المتاحة تجاريا.

وأخيرا، وهذا الفحص يمكن تعديلها تبعا لسؤال البحث. على سبيل المثال، عند اختبار تثبيط المخدرات البلعمة، وحيدات يمكن أن تكون إما قبل المعالجة أو المشارك حضنت مع كل من المخدرات وكرات الدم الحمراء opsonized (أي فحص المنافسة). إشارات المصب من الأجسام المضادة من أنواع فرعية مختلفة، والأجسام المضادة خيالية، أو يبني المؤتلف ويمكن أيضا اختبار. مع اختراقات الأخيرة في تطوير مستضد باطل العالمي الدم 24، مجلس العمل المتحد يمكن استخدامها في الشاشات الأولية لهذه كرات الدم الحمراء مستضد لاغيا مع مختلف الأجسام المضادة لتقييم ما إذا كان هناك بالفعل فعالية خفضت في التسبب البلعمة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers BD REF364606
RPMI 1640 Sigma R8758
HEPES Bioshop HEP003.100
Fetal bovine serum Multicell  080150
Gentamicin Gibco 15710-64
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-03 https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline Sigma D8537
8-chamber slides Lab-Tek-ll 154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells Canadian Blood Services Commercially available (e.g., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum Gamma Biologics DIN 02247724 Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol Caledon 6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin Sigma P8136 Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine Invitrogen 15514-011
Cover slips VWR 48366 067
Novaclone anti-IgG Immucorgamma 5461023 Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 119، البلعمة، الوحيدات، بلعم، مستقبلات التيسير، والأجسام المضادة، طهاية،
استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a… More

Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (119), e55039, doi:10.3791/55039 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter